大鼠巨噬細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)的基因表達(dá)譜分析

趙志軍，董　輝，汪　濤，郭雅琪，鐘　利，王　姝，殷國(guó)民，林　茹

?

大鼠巨噬細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)的基因表達(dá)譜分析

趙志軍1,2，董輝1,2，汪濤3，郭雅琪1，鐘利1，王姝1,2，殷國(guó)民1，林茹4

1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川750004；2. 寧夏臨床病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川750004；3. 九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，九江332000;4. 寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，銀川750004

摘要：目的分析大鼠腹腔和肺泡巨噬細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)RH株的基因表達(dá)譜差異。方法以弓形蟲(chóng)RH株速殖子感染SD大鼠腹腔和肺泡巨噬細(xì)胞0 h、6 h后提取細(xì)胞總RNA，采用NimbleGen 12x135K微陣列基因表達(dá)分析芯片檢測(cè)差異表達(dá)基因，并對(duì)部分表達(dá)變化的基因進(jìn)行Real time PCR驗(yàn)證。結(jié)果表達(dá)分析芯片涵蓋大鼠26 419個(gè)基因，對(duì)差異表達(dá)基因(Fold Change≥4.0)進(jìn)行聚類分析顯示，經(jīng)弓形蟲(chóng)RH株作用6 h和0 h 的RNA表達(dá)譜相比，大鼠肺泡巨噬細(xì)胞上調(diào)的基因有49個(gè)(主要包括Zfp90，Map4k4，Mrpl42等)，下調(diào)的基因有130個(gè)(主要包括Pitx1，Chpt1，Chd6等)。大鼠腹腔巨噬細(xì)胞上調(diào)的基因有136個(gè)(主要包括Map2k3，Il17b，Phka2等)，下調(diào)的272個(gè)(主要包括Tlr2，Tgfb2，Wnt2等)。GO、Pathway分析差異表達(dá)的基因，大鼠腹腔巨噬細(xì)胞能夠引發(fā)更多和弓形蟲(chóng)有關(guān)的信號(hào)通路變化，其肺泡巨噬細(xì)胞則不能引起這一效應(yīng)。Real time PCR和基因芯片檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論大鼠腹腔和肺泡巨噬細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)不同的表現(xiàn)型，可能和其基因表達(dá)差異引起的信號(hào)通路變化有關(guān)。

關(guān)鍵詞：大鼠巨噬細(xì)胞；弓形蟲(chóng)；基因表達(dá)譜

Supported by the Ningxia Natural Science Foundation (No. NZ1245), the Ningxia Department of Education Project (2013) and the National Natural Science Foundation of China (No. 81301945)

弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，能感染包括人在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游?，全世界大約有1/3的人口感染弓形蟲(chóng)[1]。弓形蟲(chóng)特殊的生物學(xué)特性被認(rèn)為是研究宿主(或細(xì)胞)和寄生蟲(chóng)相互作用的理想模式生物[2]。大鼠和人類相似，具有抗弓形蟲(chóng)感染的固有免疫特征，這種特性可能主要是由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的。然而，同一宿主不同類型巨噬細(xì)胞對(duì)弓形蟲(chóng)感染的固有免疫應(yīng)答并不一致，這種異質(zhì)性可能導(dǎo)致肺組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)弓形蟲(chóng)易感[3]。本文將在前期工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)微陣列基因表達(dá)分析芯片研究具有代表性的大鼠腹腔和肺泡巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)引起的mRNA表達(dá)譜差異變化，以期為揭示弓形蟲(chóng)病的致病機(jī)制和防治提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑弓形蟲(chóng)RH株由九江學(xué)院汪濤副教授惠贈(zèng)，ICR小鼠、SD大鼠購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物都經(jīng)過(guò)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn))；胎牛血清、RPMI 1640、DPBS購(gòu)自GBICO公司，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑采用LightCycler○R480 SYBR Green I Master, 5×1 mL包裝。

1.2弓形蟲(chóng)傳代與純化弓形蟲(chóng)RH株的傳代采用ICR小鼠腹腔接種。液氮中保存的菌株37 ℃水浴，待復(fù)蘇后腹腔注射0.3 mL，6～7 d可見(jiàn)小鼠出現(xiàn)聳毛、反應(yīng)遲鈍。對(duì)有癥狀的小鼠，用手術(shù)刀剪開(kāi)腹部毛皮，露出腹膜，腹腔注射5 mL DPBS，輕輕揉腹部約1 min，抽取腹腔液，注射到正常小鼠，3 d左右即可發(fā)病，此時(shí)獲取第2代。如此再次接種，直到獲取第3代時(shí)，(第3代毒力恢復(fù)，蟲(chóng)株?duì)顟B(tài)穩(wěn)定，)將全部腹腔液收回到15 mL離心管。4 ℃，1 300 g離心10 min，收集沉淀，DPBS沖懸，再次離心，RPMI 1640沖懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀進(jìn)行計(jì)數(shù)后備用。

1.3腹腔與肺泡巨噬細(xì)胞的收集

1.3.1腹腔巨噬細(xì)胞的收集用手術(shù)刀剪開(kāi)大鼠腹部毛皮，露出腹膜，腹腔注射15 mL DPBS，輕輕揉腹部約1 min，抽取腹腔液至15 mL離心管。4 ℃，3 500 r/min離心10 min，收集沉淀，DPBS沖懸，再次離心，最后用RPMI 1640沖懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2肺泡巨噬細(xì)胞的收集將處死的大鼠用手術(shù)剪刀剪開(kāi)頸部皮膚，鈍性分離出包囊器官的肌肉層，然后順著紋理剪開(kāi)肌肉層，暴露出氣管，在氣管上剪開(kāi)一個(gè)“V”型口，將輸液管的輸液端傾斜剪去輸液部分，小心插入氣管上的“V”型口，小心拔去留置針金屬部分。大鼠用10 mL注射器吸滿8～10 mL DPBS液，緩慢注入肺腔，有阻力時(shí)輕輕調(diào)整輸液管插入深度，大鼠反復(fù)抽吸約5～6次，吸滿50 mL肺泡盥洗液至50 mL離心管中，4 ℃，1 300 g離心10 min，收集沉淀，棄上清，DPBS沖懸，再次離心，最后用RPMI 1640沖懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀進(jìn)行計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4巨噬細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與純化采用6孔板，每孔加入2 mL細(xì)胞溶液，總濃度為5×106個(gè)細(xì)胞/孔。細(xì)胞鋪板后，將培養(yǎng)板放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃，5% CO2培養(yǎng)4 h，然后將上清吸出，并用37 ℃預(yù)熱的DPBS輕洗細(xì)胞2遍，除去未貼壁的細(xì)胞，然后重新加入新鮮的10% 血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。

1.5弓形蟲(chóng)感染實(shí)驗(yàn)弓形蟲(chóng)與細(xì)胞的感染比例為：T.gondii/Cells=1∶1。待巨噬細(xì)胞純化培養(yǎng)后，調(diào)整純化后的弓形蟲(chóng)，感染巨噬細(xì)胞，使得弓形蟲(chóng)濃度為4×106個(gè)細(xì)胞/孔。37 ℃，5% CO2共培養(yǎng)1 h后，吸棄上清，預(yù)熱的DPBS輕洗細(xì)胞2遍，加入新的10 % 血清的RPMI 1640培養(yǎng)液2 mL，此時(shí)定義為感染0 h，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃，5% CO2共培養(yǎng)6 h。分別在0 h，6 h吸棄上清，DPBS輕洗細(xì)胞兩遍后收取細(xì)胞，加入TRIzol試劑反復(fù)吹打后-80 ℃保存。

1.6表達(dá)譜芯片以及數(shù)據(jù)分析RNA提取采用TRIzol試劑，RNA定量采用NanoDrop ND-1000，并進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)完整性。反轉(zhuǎn)錄采用Invitrogen Superscript ds-cDNA synthesis kit，ds-cDNA標(biāo)記采用NimbleGen One-Color DNA labeling kit，表達(dá)譜芯片采用NimbleGen 12 x 135K Gene Expression Array。Axon GenePix 4000B掃描儀采集芯片圖像，Agilent GeneSpring GX software (version 11.5.1) 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有樣品通過(guò)均一化處理后，選擇RNAs信號(hào)強(qiáng)度≥50，重復(fù)3次取其平均值，本實(shí)驗(yàn)在上?？党缮镉邢薰就瓿?。

1.7生物信息學(xué)分析對(duì)表達(dá)譜差異基因基于KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Pathway 分析，Gene Ontology (www.geneontology.org)進(jìn)行GO分析。

1.8熒光定量PCR試驗(yàn)驗(yàn)證隨機(jī)選取表達(dá)上調(diào)和下調(diào)因子(NFΚBia、TLR4、TLR2、IL-6、MAP3K8、IL-17b、AKT1、AKT2)，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，送上海生工合成。在Roche 480 II熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)。

2結(jié)果

2.1RNA的純化及檢測(cè)提取的RNA通過(guò)甲醛變性瓊脂凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示18S和28S條帶清晰，亮度比約為2∶1。Nanodrop核酸測(cè)定儀檢測(cè)結(jié)果顯示A260/280分別為1.83，1.85，2.00，1.99。提示總RNA純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求無(wú)明顯降解。

2.2差異基因表達(dá)分析結(jié)果采用NimbleGen 12x135K 微陣列基因表達(dá)分析芯片，涵蓋大鼠26 419個(gè)基因。雜交后的芯片經(jīng)過(guò)掃描、軟件分析及標(biāo)準(zhǔn)化處理后，針對(duì)RAMs0h_vs_RAMs6h，RPMs0h_vs_RPMs6h差異表達(dá)的RNA(Fold Change≥4.0)，進(jìn)行聚類分析。數(shù)據(jù)分析顯示，經(jīng)過(guò)弓形蟲(chóng)RH株作用6 h后的肺泡巨噬細(xì)胞與0 h RNA表達(dá)譜相比，上調(diào)的RNA有49個(gè)，主要包括Zfp90，Map4k4，Mrpl42等。下調(diào)的基因有130個(gè)，主要包括Pitx1，Chpt1，Chd6等。弓形蟲(chóng)RH株作用6 h后的腹腔巨噬細(xì)胞與0 h RNA表達(dá)譜相比，上調(diào)的RNA有136個(gè)，主要包括Map2k3，Il17b，Phka2等。下調(diào)的272個(gè)，主要包括Tlr2，Tgfb2，Wnt2等。

2.3差異表達(dá)基因聚類GO分析以P≤0.05作為篩選條件，RAMs6h_vs_RAMs0h_down基因主要的生物學(xué)功能是binding(GO:0005488)、protein binding(GO:0005515)、nucleic acid binding(GO:0003676)等，RAMs6h_vs_RAMs0h_up基因主要的生物學(xué)功能是binding(GO:0005488)、catalytic activity(GO:0003824)、hydrolase activity(GO:0016787)等，RPMs6h_vs_RPMs0h_down基因主要的生物學(xué)功能是NF-kappaB binding(GO:0051059)，polysaccharide binding(GO:0030247)，GTPase activity(GO:0003924)等，RPMs6h_vs_RPMs0h_up基因主要的生物學(xué)功能是enzyme regulator activity(GO:0030234)，kinase activity(GO:0016301)，phosphatase activity(GO:0016791)等。

2.4Pathway 結(jié)果分析針對(duì)RPMs6h_vs_RPMs0h變化顯著的基因，統(tǒng)一指向了弓形蟲(chóng)引起的共同信號(hào)通路(見(jiàn)表1)，RAMs6h_vs_RAMs0h表達(dá)差異顯著的基因，經(jīng)過(guò)Pathway分析基因變化引起的信號(hào)通路與表1中提示的無(wú)關(guān)，提示這些信號(hào)通路可能在腹腔巨噬細(xì)胞抵抗弓形蟲(chóng)、肺泡巨噬細(xì)胞易感弓形蟲(chóng)中發(fā)揮著重要的作用。

表1差異性顯著表達(dá)基因KEGG通路分析結(jié)果

Tab.1KEGG pathway analysis with differentially expressed genes

KEGG通路分析KEGGpathwayP包含基因數(shù)量Genenumber主要基因KeygeneNOD-likereceptorsignalingpathway0.00007216816IL6,BIRC3,CASP1,CCL2,IL18//IL1BToll-likereceptorsignalingpathway0.00054780621TLR2//TLR4//TLR7NF-kappaBsignalingpathway0.00418823718BCL10//BCL2A1D//NFKBIAHIF-1signalingpathway0.01141496015AKT1//AKT2//BCL2MAPKsignalingpathway0.01537111027MAP3//MAP2K3//MAP3KmTORsignalingpathway0.0462888208AKT1//AKT1S1//AKT2TGF-betasignalingpathway0.00279550418ACVR1//ACVR2B//BMP7PI3K-Aktsignalingpathway0.04712266019CCND1//COL27A1//COL2A1Jak-STATsignalingpathway0.04926903010CCND1//CNTFR//CREBBP

2.5熒光定量PCR試驗(yàn)驗(yàn)證針對(duì)RAMs0h_vs_RAMs6h，RPMs0h_vs_RPMs6h差異表達(dá)的RNA(Fold Change≥4.0)隨機(jī)選取各自上調(diào)因子和下調(diào)因子進(jìn)行Real time PCR驗(yàn)證，結(jié)果基本相符。相對(duì)于大鼠RPM0h，RPM6h在NFκB、TLR4、TLR2、IL-6、MAP3K8等呈顯著下調(diào)趨勢(shì)，而炎性應(yīng)答因子如IL-17b、AKT1、AKT2等則呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，IL-17表達(dá)升高近4.5倍；相對(duì)于大鼠RAM0h，RAM6h除了NFκB、MAP3K8呈顯著上調(diào)趨勢(shì)外，TLR4、TLR2、IL-6、IL-17b、AKT1、AKT2等則呈無(wú)明顯變化。

A 大鼠腹腔巨噬細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)6 h基因表達(dá)譜變化；B大鼠肺泡巨噬細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)6 h基因表達(dá)譜變化。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義是分別與RPM0h、RAM0h情況比較±s，n=3)A: RPM 6 h VS RPM 0 h; B: RAM 6 h VS RAM 0 h.圖1　Real time PCR對(duì)表達(dá)譜芯片結(jié)果的驗(yàn)證Fig.1　Verification of the results of the expression profile chip by real time PCR

3討論

大鼠和人感染弓形蟲(chóng)的特征相似，因此被認(rèn)為是研究人弓形蟲(chóng)病的理想模式動(dòng)物。巨噬細(xì)胞對(duì)宿主生理功能、免疫調(diào)節(jié)等具有重要的意義[4]，同時(shí)也被認(rèn)為是機(jī)體對(duì)抗病原體如弓形蟲(chóng)等感染最重要防御細(xì)胞。由于體外培養(yǎng)的大鼠巨噬細(xì)胞能夠抑制弓形蟲(chóng)增殖，而其他易感宿主細(xì)胞卻能支持弓形蟲(chóng)增殖，因此，巨噬細(xì)胞又被認(rèn)為能夠介導(dǎo)宿主對(duì)弓形蟲(chóng)的抗性[5-7]。

前期工作顯示，弓形蟲(chóng)能夠在大鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖，而在其腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)則被抑制[8]，這和Catterall等[5]認(rèn)為同一宿主體內(nèi)不可能出現(xiàn)對(duì)弓形蟲(chóng)具有不同抗性巨噬細(xì)胞的觀點(diǎn)相反，但與Chinchilla等[6]報(bào)道弓形蟲(chóng)能夠在體外培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖的結(jié)論一致。由于肺泡巨噬細(xì)胞是宿主抵抗微生物感染的重要防御陣線，人和動(dòng)物的肺弓形蟲(chóng)病也常有發(fā)生，因此，我們對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)不同結(jié)局的差異分子機(jī)理產(chǎn)生了濃厚的興趣，而腹腔和肺泡巨噬細(xì)胞又是宿主體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，因此研究大鼠腹腔和肺泡巨噬細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)后的基因表達(dá)譜差異，對(duì)于揭示同一宿主體內(nèi)不同巨噬細(xì)胞弓形蟲(chóng)感染抗性差異機(jī)制具有重要的意義。

實(shí)際上，基因表達(dá)譜分析及PCR驗(yàn)證試驗(yàn)也確實(shí)在一定程度上反映了差異機(jī)制的存在。弓形蟲(chóng)RH株感染6 h后的肺泡巨噬細(xì)胞相比其0 h表達(dá)譜，有49個(gè)RNA上調(diào)，而腹腔巨噬細(xì)胞上調(diào)的RNA則有136個(gè)，說(shuō)明腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)弓形蟲(chóng)存在積極活躍的應(yīng)答，繼續(xù)分析上調(diào)基因的特性，肺泡巨噬細(xì)胞都主要集中在固有組成型基因(如Zfp90，Mrpl42等)的表達(dá)，而腹腔巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)為包括Map2k3，Il17b，Phka2等激酶及Th1細(xì)胞因子的上調(diào)表達(dá)，在促炎性免疫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程中抑制了弓形蟲(chóng)在細(xì)胞內(nèi)的增殖，從而造成腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)弓形蟲(chóng)特有的抗性。在下調(diào)基因表達(dá)中，肺泡巨噬細(xì)胞仍然沒(méi)有腹腔巨噬細(xì)胞活躍，只有130個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，而腹腔巨噬細(xì)胞則有272個(gè)，進(jìn)一步分析下調(diào)基因特性仍然顯示肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)下調(diào)的基因和弓形蟲(chóng)免疫應(yīng)答相關(guān)性不強(qiáng)，而腹腔巨噬細(xì)胞則集中在相關(guān)信號(hào)通路及Tp相關(guān)因子主要包括Tlr2，Tgfb2，Wnt2等基因的表達(dá)下調(diào)。通過(guò)以上表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因分析，我們推測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞可能通過(guò)巨噬細(xì)胞極化[9]作用發(fā)揮了抗弓形蟲(chóng)的作用，而肺泡巨噬細(xì)胞似乎在感染過(guò)程中被弓形蟲(chóng)挾持，造成了“木馬效應(yīng)”[10]。

在差異表達(dá)基因聚類GO分析和Pathway 結(jié)果分析中，我們可以明確看到RPMs6h對(duì)RPMs0h變化顯著的基因，和弓形蟲(chóng)引起的共同信號(hào)通路(見(jiàn)表1)有關(guān)，如RPMs6h對(duì)RPMs0h_up中enzyme regulator activity(GO:0030234)，kinase activity(GO:0016301)，phosphatase activity(GO:0016791)等基因的表達(dá)上調(diào)，能夠很好的解釋腹腔巨噬細(xì)胞抗弓形蟲(chóng)感染的特性。而RAMs6h對(duì) RAMs0h變化顯著的基因并無(wú)此相關(guān)通路，這和我們認(rèn)為腹腔和肺泡巨噬細(xì)胞通過(guò)Th1/Tp免疫平衡進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞極化造成對(duì)弓形蟲(chóng)的抗性預(yù)測(cè)不同，肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)弓形蟲(chóng)的感染免疫應(yīng)答似乎存在其他的機(jī)制。另外Pathway結(jié)果將RPMs6h對(duì)RPMs0h變化顯著的基因，統(tǒng)一指向了弓形蟲(chóng)誘導(dǎo)的共同信號(hào)通路(見(jiàn)表1)，而RAMs6h對(duì)RAMs0h變化顯著的基因并無(wú)此相關(guān)通路，肺泡巨噬細(xì)胞易感弓形蟲(chóng)的分子機(jī)制，除了可能和上述“木馬效應(yīng)”有關(guān)外，也可能和其靜息狀態(tài)有關(guān)[11-12]。

綜上，通過(guò)基因表達(dá)譜分析及其驗(yàn)證試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞抑制弓形蟲(chóng)在其細(xì)胞內(nèi)增殖的分子機(jī)制，主要是通過(guò)上調(diào)和Th1有關(guān)的因子和降低Tp有關(guān)因子，相關(guān)信號(hào)通路都指向了弓形蟲(chóng)誘導(dǎo)的共同的信號(hào)通路，而肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)弓形蟲(chóng)的抗性雖已明確，但通過(guò)表達(dá)譜分析我們并未發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的基因表達(dá)變化，提示我們尚需擴(kuò)大樣本量研究或改變研究策略以獲得其可能的感染機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1] Liu JF, LYU FL. Research review of pulmonary toxoplasmosis[J]. J Trop Med, 2014, 14(4): 541-544. (in Chinese)

劉晉鋒,呂芳麗. 肺弓形蟲(chóng)病研究進(jìn)展[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2014,14(4):541-544.

[2] Kafsack BF, Pena JD, Coppens I, et al. Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells[J]. Science, 2009, 323(5913): 530-533.

[3] Catterall JR, Sharma SD, Remington JS. Oxygen-independent killing by alveolar macrophages[J]. J Exper Med, 1986, 163(5): 1113-1131.

[4] Geissmann F, Manz MG, Jung S, et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells[J]. Science, 2010, 327(5966): 656-661. DOI: 10.1126/science.1178331

[5] Catterall JR, Black CM, Leventhal JP, et al. Nonoxidative microbicidal activity in normal human alveolar and peritoneal macrophages[J]. Infect Immun, 1987, 55(7): 1635-1640.

[6] Chinchilla M, Guerrero OM, Solano E. Lack of multiplication ofToxoplasmain macrophages of ratsinvitro[J]. J Parasitol, 1982, 68(5): 952-955.

[7] Li Z, Zhao ZJ, Zhu XQ, et al. Differences in iNOS and arginase expression and activity in the macrophages of rats are responsible for the resistance againstT.gondiiinfection[J]. PLoS One, 2012, 18(6): e35834. DOI: 10.1371/journal.pone.0035834

[8] Zhao ZJ, Zhang J, Wei J, et al. Lower expression of inducible nitric oxide synthase and higher expression of arginase in rat alveolar macrophages are linked to their susceptibility toToxoplasmagondiiinfection[J]. PLoS One, 2013, 18(5): e63650. DOI: 10.1371/journal.pone.0063650

[9] Zhang AM, Shen Q, Li M, et al. Comparative studies of macrophage-biased responses in mice to infection withToxoplasmagondiiToxoDB#9 strains of different virulence isolated from China[J]. Parasit Vectors, 2013, 6(1): 308.

[10] Luder CG, Lang C, Giraldo-Velasquez M, et al.Toxoplasmagondiiinhibits MHC class II expression in neural antigen-presenting cells by down-regulating the class II transactivator CIITA[J]. J Neuroimmunol, 2003, 134(1/2): 12-24.

[11] Holt PG, Oliver J, Bilyk N, et al. Down regulation of the antigen presenting cell function (s) of pulmonary dendritic cellsinvivoby resident alveolar macrophages[J]. J Exper Med, 1993, 177(2): 397-407.

[12] Lambrecht BN. Alveolar macrophage in the driver's seat[J]. Immunity, 2006, 24(4): 366-368.

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.011

通訊作者：董輝，Email：173401951@qq.com

中圖分類號(hào)：R382.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)04-0371-05

Corresponding author:Dong Hui，Email:173401951@qq.com

收稿日期：2015-09-17修回日期：2015-12-17

Gene expression profile analysis of the rat macrophages infected withToxoplasmagondii

ZHAO Zhi-jun1,2, DONG Hui1,2, WANG Tao3, GUO Ya-qi1,ZHONG Li1,2, WANG Shu1,2, YIN Guo-min1, LIN Ru4

(1.GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China;2.NingxiaKeyLaboratoryofClinicalandPathogenicMicrobiology,Yinchuan750004,China;3.DepartmentofPathogenicBiology,MedicalCollege,JiujiangUniversity,Jiujiang33200,China;4.DepartmentofInspectionCollege,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Abstract:Since rat macrophages are very important for the resistance of Toxoplasma gondii infection, we investigated the differential expression profiling between rat peritoneal and alveolar macrophages by using NimbleGen 12x135K microarray in this study. Through clustering analysis (Fold Change≥4.0), the results showed that there were 49 high expression genes (mainly including Zfp90, Map4k4, Mrpl42 and so on) and 130 low expression genes (mainly including Pitx1, Chpt1, Chd6 and so on) in rat alveolar macrophages at the time course of T.Gondii RH strain infection 0 h and 6 h. As for rat peritoneal macrophages at this condition, there were 136 high expression genes (mainly including Map2k3, Il17b, Phka2 and so on) and 272 low expression genes(mainly including Tlr2, Tgfb2, Wnt2 and so on). Further analysis by Go and Pathway methods revealed that rat peritoneal macrophages could trigger more reaction on the related pathway about toxoplamosis, otherwise the alveolar macrophages could not. The results were verified by real-time PCR and the result of verification were entirely coincident. Therefore, the results indicated that the different phenotype between rat alveolar and peritoneal macrophages infected with T. Gondii RH strain may be related to their different expression gene which was connected to toxoplasmosis reaction.

Keywords:rat macrophaes; alveolar; peritoneal; gene expression profile

寧夏自然科學(xué)基金(No.NZ1245)，寧夏教育廳項(xiàng)目(2013)以及國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(No.81301945)聯(lián)合資助