補(bǔ)充水解膠原蛋白與跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)聯(lián)合作用對(duì)生長(zhǎng)期大鼠骨密度和組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響

馬濤+蘇紅燕

摘要：目的：從補(bǔ)充水解膠原蛋白（hydrolyzed collagen，HC）和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)兩個(gè)方面探索促進(jìn)生長(zhǎng)期骨生長(zhǎng)的有效途徑。方法：4周齡雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只：正常對(duì)照組（CON）、6%HC補(bǔ)充組（HC6）、12%HC補(bǔ)充組（HC12）、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組（CON+Ex）、6%HC補(bǔ)充+跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組（HC6+Ex）和12%HC補(bǔ)充+跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組（HC12+Ex）。跑臺(tái)訓(xùn)練速度為30 m/min，每次訓(xùn)練60 min，每周訓(xùn)練6 d，共訓(xùn)練8 w。8w后測(cè)試各組大鼠股骨骨密度（bone mineral density，BMD）和形態(tài)學(xué)指標(biāo)以及脛骨松質(zhì)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)。結(jié)果：與其相應(yīng)的對(duì)照組相比，補(bǔ)充HC組與運(yùn)動(dòng)組大鼠股骨BMD和形態(tài)學(xué)指標(biāo)，以及脛骨松質(zhì)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)均顯著增加；高劑量補(bǔ)充HC組與中等劑量補(bǔ)充HC組相比，其上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；補(bǔ)充HC與跑臺(tái)訓(xùn)練聯(lián)合干預(yù)組與單純補(bǔ)充HC組或單純跑臺(tái)訓(xùn)練組相比，上述指標(biāo)均顯著增加。結(jié)論：補(bǔ)充HC與跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)均能有效促進(jìn)生長(zhǎng)期的骨生長(zhǎng)；中等劑量的HC補(bǔ)充即能較好地促進(jìn)生長(zhǎng)期的骨生長(zhǎng)，而高劑量的補(bǔ)充并不能起到更好效果；補(bǔ)充HC與跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)具有協(xié)同作用，其效果優(yōu)于單純補(bǔ)充HC或單純跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

關(guān)鍵詞：水解膠原蛋白；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)；骨密度；組織形態(tài)計(jì)量學(xué)

中圖分類號(hào)：G804.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-2076（2016）04-0077-08

Abstract：Objective：This study aimed to explore effective ways to promote growth of growing bone from supplement hydrolyzed collagen and treadmill exercise. Methods：Forty-eight male SD rats， 4 weeks of age， were randomly divided into six groups and assigned as follows： normal control group （CON）， 6%HC supplemented group （HC6）， 12%HC supplemented group （HC12）， treadmill exercise group （CON+Ex）， 6%HC + supplement treadmill exercise group （HC6+Ex）and 12%HC + supplement treadmill exercise group （HC12+Ex）， each group of eight rats. Rats treadmill trained speed is 30m/min， eight weeks of training， training six days a week， 60 minutes a day of

training.After eight weeks， bone mineral density and morphological indicators of femur and histomorphometry indexes of tibia cancellous bone in each group were tested.Results：Compared with the corresponding control groups， bone mineral density and morphological indicators of femur and histomorphometry indexes of tibia cancellous bone in supplemented HC group and the exercise group were significantly increased. Compared with moderate-dose HC supplements group， the difference of these indexes in high-dose HC supplement group were not statistically significant. Compared with simply HC supplement group and simply treadmill training group， these indexes in combined HC supplement with treadmill training group were significantly increased.Conclusion：Supplementary HC and treadmill exercise both can effectively promote growth of growing bone. Moderate doses of HC supplement can better promote growth of growing bone， high-dose supplementation did not play better results. HC supplement with treadmill exercise have a synergistic effect， the effect is better than simply HC supplements and simply treadmill exercise.

Key words： hydrolyzed collagen； treadmill exercise； bone mineral density； histomorphometry

生長(zhǎng)發(fā)育期是骨量增長(zhǎng)的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，此期間骨量的快速獲得，是與骨骼本身處于突增生長(zhǎng)階段相吻合的。人生的最初20年里所獲得的骨量可以達(dá)到其峰值骨量（PBM，Peak bone mass）的90%～99%，峰值骨量是維持成人生命的“骨庫(kù)”，因而青少年時(shí)期骨量的獲得對(duì)其成年后骨骼的健康起著決定性的作用[1]。峰值骨量的水平與成年后患骨質(zhì)疏松癥的可能性密切相關(guān)[2]。因此，在生長(zhǎng)期獲得盡可能高的基礎(chǔ)骨量，對(duì)提高骨量峰值以及保證成年后的骨健康具有重要的意義。

業(yè)已證明，在生長(zhǎng)期，適宜的機(jī)械負(fù)荷刺激（如體力勞動(dòng)或體育運(yùn)動(dòng)）對(duì)于提高峰值骨量具有重要作用[3]。除此之外，營(yíng)養(yǎng)因素（如蛋白質(zhì)的攝入）也是影響骨形成的重要因素之一[4]。因此，為了能夠提高峰值骨量，在生長(zhǎng)期要經(jīng)常參加體育活動(dòng)以使骨組織經(jīng)常受到機(jī)械負(fù)荷刺激，而且通過(guò)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充攝取足夠的蛋白質(zhì)也是必不可少的。就青少年運(yùn)動(dòng)員來(lái)說(shuō)，他們?cè)诮?jīng)歷高水平的體育鍛煉的同時(shí)，雖也攝取了足夠的蛋白質(zhì)[5]，然而體育鍛煉和蛋白質(zhì)攝入對(duì)于其骨組織生長(zhǎng)的影響并沒(méi)有得到充分的研究。已有研究顯示，補(bǔ)充水解膠原蛋白（hydrolyzed collagen，HC）可以有效減緩隨年齡增長(zhǎng)而增加的骨質(zhì)流失，然而，關(guān)于補(bǔ)充HC與運(yùn)動(dòng)聯(lián)合作用對(duì)生長(zhǎng)期骨量影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)補(bǔ)充HC與跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)聯(lián)合作用對(duì)生長(zhǎng)期大鼠BMD和組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)影響的研究，旨在從營(yíng)養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)兩個(gè)方面探索促進(jìn)生長(zhǎng)期骨生長(zhǎng)的有效途徑，為提高青少年峰值骨量和保證成年后的骨健康提供有效方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

4周齡雄性SD大鼠48只，體重（89.26±6.32）g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)為SCXK（滬）2003-0002]。在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為（22±1）℃，光照遵循12 h：12 h明暗周期。動(dòng)物購(gòu)回適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和飲食1周后，被隨機(jī)分為6組，每組8只：正常對(duì)照組（CON）、6%HC補(bǔ)充組（HC6）、12%HC補(bǔ)充組（HC12）、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組（CON+Ex）、6%HC補(bǔ)充+跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組（HC6+Ex）和12%HC補(bǔ)充+跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組（HC12+Ex）。大鼠分籠飼養(yǎng)，各組大鼠每日提供足夠食物，自由飲水，每周記錄大鼠體重和進(jìn)食量。

1.2 HC補(bǔ)充方案

HC的補(bǔ)充是通過(guò)動(dòng)物食物配方的改變實(shí)現(xiàn)的，各組大鼠食物的蛋白含量如下：CON組和CON+Ex組大鼠食物均為標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，其中蛋白總含量為20%，蛋白中不含HC蛋白；HC6組和HC6+Ex組大鼠為中等劑量HC補(bǔ)充組，其食物蛋白含量為：HC蛋白含量為6%，蛋白總含量為20%；HC12組和HC12+Ex組大鼠為高劑量HC補(bǔ)充組，其食物蛋白含量為：HC蛋白含量為12%，蛋白總含量為20%。

1.3 跑臺(tái)訓(xùn)練方案

CON+Ex組、HC6+Ex組和HC12+Ex組大鼠每周跑臺(tái)訓(xùn)練6 d，共訓(xùn)練8 w。跑速?gòu)氖状斡?xùn)練的10 m/min以每日5 m/min的速度逐漸遞增為30 m/min，每日訓(xùn)練時(shí)間從首次訓(xùn)練的35 min開(kāi)始，以每日5 min的速度逐漸遞增為60 min。從第二周開(kāi)始，大鼠每日訓(xùn)練時(shí)間固定為60 min，跑速固定為30 m/min。

1.4 取材

于跑臺(tái)訓(xùn)練組大鼠最后一次訓(xùn)練結(jié)束24小時(shí)后，稱量大鼠體重，斷頸椎處死所有大鼠。分離大鼠左側(cè)股骨和脛骨，用鑷子和紗布除去骨表面的軟組織，用游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨的形態(tài)學(xué)指標(biāo)后，將股骨用浸透生理鹽水的紗布包好，放于-20 ℃ 冰箱內(nèi)保存待測(cè)BMD，將脛骨投于10%甲醛溶液中進(jìn)行固定，待測(cè)組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)。

1.5 測(cè)試方法

1.5.1 體重及進(jìn)食量的測(cè)定

飼養(yǎng)期間每周固定時(shí)間用YP601N電子分析天平測(cè)試各小鼠體重并記錄，最后一次體重測(cè)試在小鼠處死前一天晚上進(jìn)行；每周用YP601N電子分析天平稱量各籠大鼠飼料添加量和剩余量并記錄。

1.5.2 游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨的形態(tài)學(xué)指標(biāo)

分離大鼠左側(cè)股骨和脛骨后，用游標(biāo)卡尺（精確度為0.02 mm）測(cè)量股骨的長(zhǎng)度、近端厚度（矢狀徑）和寬度（額狀徑）、遠(yuǎn)端厚度（矢狀徑）和寬度（額狀徑）、中段厚度（矢狀徑）和寬度（額狀徑）。

1.5.3 Kodak 雙能X 射線骨密度儀測(cè)量股骨干骺端BMD

從- 20℃冰箱中取出左側(cè)股骨，室溫自然解凍，用Kodak 雙能X 射線骨密度儀和Carestream 骨密度分析軟件測(cè)量股骨遠(yuǎn)端干骺端BMD（圖1）。

1.5.4 脛骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

所有大鼠分別于處死前第10天和第3天腹腔注射鹽酸四環(huán)素（購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。處死后，取左側(cè)脛骨經(jīng)10%甲醛溶液固定2天，流水沖洗2小時(shí)，酒精梯度脫水（75%、85%、95%、100%各2天），甲基丙烯酸甲酯（MMA）包埋，室溫干燥后在德國(guó)LEICA SP1600切片機(jī)上進(jìn)行50 μm切片，一部分在熒光顯微鏡（日本Olympus IX71）下直接觀察熒光標(biāo)記并拍片，觀察位置在距骺線1～4 mm 范圍；另一部分經(jīng)磨成5 μm的薄片后，HE染色，在日本產(chǎn)Olympus IX71顯微鏡下觀察并拍片，觀察位置在距骺線1～4 mm范圍。測(cè)量參數(shù)如下：

骨小梁體積（TBV，trabecular volume），指骨小梁體積占松質(zhì)骨總體積的百分比。骨小梁寬度（Tb. Wi，trabecular width），單位為μm。骨小梁數(shù)目（Tb. N，trabecular number），單位為個(gè)/mm。皮質(zhì)骨礦化沉積率（MAR，mineral apposition rate），熒光雙標(biāo)記帶間的距離除以二次標(biāo)記相隔的天數(shù)，單位為μm/d。

1.6 統(tǒng)計(jì)處理

各檢測(cè)結(jié)果以[AKX-]±S表示，用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先，使用多因素方差分析（MANOVA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，如果發(fā)現(xiàn)有顯著性差異，運(yùn)動(dòng)組和非運(yùn)動(dòng)組之間、不同劑量HC補(bǔ)充組之間采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前及8周實(shí)驗(yàn)后數(shù)據(jù)檢驗(yàn)采用配對(duì)T檢驗(yàn)（Paired T test）。以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01為差異非常顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的進(jìn)食量

由圖2可知，隨著大鼠的生長(zhǎng)，其進(jìn)食量也有一定的增加，而各組大鼠進(jìn)食量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重變化

實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)后各組大鼠體重均比實(shí)驗(yàn)前有較大幅度的增長(zhǎng)（P<0.01）；實(shí)驗(yàn)后補(bǔ)充HC組與其對(duì)應(yīng)的正常飼養(yǎng)組相比（即HC6、HC12與CON相比，或者HC6+Ex、HC12+Ex與CON+Ex相比），大鼠體重顯著增加（P<0.05或P<0.01）；而高劑量補(bǔ)充HC組與中等劑量補(bǔ)充HC組相比（即HC12與HC6相比，或HC12+Ex 與HC6+Ex相比），其體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而運(yùn)動(dòng)各組（CON+Ex、HC6+Ex、HC12+Ex）大鼠體重與其對(duì)應(yīng)的非運(yùn)動(dòng)組（CON、HC6、HC12）大鼠相比，體重均顯著下降（P<0.01）（見(jiàn)圖3）。

2.3 各組大鼠股骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)比較

由表1和表2可知：補(bǔ)充HC組與其對(duì)應(yīng)的正常飼養(yǎng)組相比（即HC6、HC12與CON相比，或者HC6+Ex、HC12+Ex與CON+Ex相比），大鼠股骨形態(tài)各項(xiàng)指標(biāo)均顯著增加（P<0.05或P<0.01）；而高劑量補(bǔ)充HC組與中等劑量補(bǔ)充膠原蛋白組相比（即HC12與HC6相比，或者HC12+Ex與HC6+Ex相比），其股骨形態(tài)學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；運(yùn)動(dòng)各組（CON+Ex、HC6+Ex、HC12+Ex）與其對(duì)應(yīng)的非運(yùn)動(dòng)組（CON、HC6、HC12）相比，大鼠股骨形態(tài)學(xué)各指標(biāo)均顯著增加（P<0.01或P<0.01）；而補(bǔ)充HC與跑臺(tái)訓(xùn)練聯(lián)合干預(yù)組（HC6+Ex或HC12+Ex）與單純補(bǔ)充HC組（HC6或HC12）或單純跑臺(tái)訓(xùn)練組（CON+Ex）相比，大鼠股骨形態(tài)學(xué)各指標(biāo)均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。

2.4 各組大鼠股骨干骺端BMD比較

由圖4可知：補(bǔ)充HC組與其對(duì)應(yīng)的正常飼養(yǎng)組相比（即HC6、HC12與CON相比，或者HC6+Ex、HC12+Ex與CON+Ex相比），大鼠股骨干骺端BMD均顯著增加（P<0.05或P<0.01）；而高劑量補(bǔ)充HC組與中等劑量補(bǔ)充HC組相比（即HC12與HC6相比，或者HC12+Ex與HC6+Ex相比），其股骨干骺端BMD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；運(yùn)動(dòng)各組（CON+Ex、HC6+Ex、HC12+Ex）與其對(duì)應(yīng)的非運(yùn)動(dòng)組（CON、HC6、HC12）相比，大鼠股骨干骺端BMD均顯著增加（P<0.01）；而補(bǔ)充HC與跑臺(tái)訓(xùn)練聯(lián)合干預(yù)組（HC6+Ex或HC12+Ex）與單純補(bǔ)充HC組（HC6或HC12）或單純跑臺(tái)訓(xùn)練組（CON+Ex）相比，大鼠股骨形態(tài)學(xué)各指標(biāo)均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。

2.5 各組大鼠脛骨干骺端骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)比較

圖5和圖6分別是大鼠脛骨干骺端松質(zhì)骨骨小梁HE染色圖片及皮質(zhì)骨熒光雙標(biāo)記圖片。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：補(bǔ)充HC組與其對(duì)應(yīng)的正常飼養(yǎng)組相比（即HC6、HC12與CON相比，或者HC6+Ex、HC12+Ex與CON+Ex相比），大鼠脛骨干骺端組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)均顯著增加（P<0.05或P<0.01）；而高劑量補(bǔ)充HC組與中等劑量補(bǔ)充HC組相比（即HC12與HC6相比，或者HC12+Ex與HC6+Ex相比），其脛骨干骺端組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；運(yùn)動(dòng)各組（CON+Ex、HC6+Ex、HC12+Ex）與其對(duì)應(yīng)的非運(yùn)動(dòng)組（CON、HC6、HC12）相比，大鼠脛骨干骺端組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)均顯著增加（P<0.01）；而補(bǔ)充HC與跑臺(tái)訓(xùn)練聯(lián)合干預(yù)組（HC6+Ex或HC12+Ex）與單純補(bǔ)充HC組（HC6或HC12）或單純跑臺(tái)訓(xùn)練組（CON+Ex）相比，大鼠脛骨干骺端組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)均顯著增加（P<0.05或P<0.01）（見(jiàn)圖7）。3 分析與討論

3.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)與生長(zhǎng)期骨生長(zhǎng)

骨組織是一種代謝非?；钴S的組織，其外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)都與其自身所處的力學(xué)環(huán)境密切相關(guān)。美國(guó)骨生理學(xué)家Harold Frost[6]的研究和論斷被人們稱為機(jī)械應(yīng)力調(diào)控骨重建的最經(jīng)典理論。Harold Frost認(rèn)為，機(jī)械力因素（如骨骼肌施加在骨組織上的力以及體力活動(dòng)對(duì)骨組織的機(jī)械應(yīng)力等）對(duì)骨組織的生理過(guò)程起著決定性作用，骨組織所受機(jī)械負(fù)荷的變化影響著骨代謝激素的反應(yīng)，從而對(duì)骨鈣含量進(jìn)行調(diào)節(jié)。運(yùn)動(dòng)可以看做是對(duì)骨組織的一種機(jī)械刺激，這種機(jī)械刺激同樣可以調(diào)節(jié)骨代謝，優(yōu)化骨結(jié)構(gòu)。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中[7-9]，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可顯著提高生長(zhǎng)期大鼠和骨質(zhì)疏松模型大鼠BMD并優(yōu)化其松質(zhì)骨骨小梁結(jié)構(gòu)。國(guó)外的大量研究也表明[10]，體力活動(dòng)或體育運(yùn)動(dòng)可顯著提高生長(zhǎng)期青少年兒童骨組織的生長(zhǎng)發(fā)育，使BMD和骨強(qiáng)度均顯著增加。在本研究中，運(yùn)動(dòng)方式采用的是動(dòng)物跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，根據(jù)Wheeler DL等人報(bào)道[11]，30 m/min的跑速相當(dāng)于大鼠60%～70% VO2max的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度?？紤]到過(guò)大的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可能會(huì)對(duì)骨代謝產(chǎn)生不利的影響，反而會(huì)影響大鼠骨組織的生長(zhǎng)[12]，故本研究也采取了30 m/min的速度作為大鼠的跑速。此外，在本研究中，大鼠的跑臺(tái)訓(xùn)練周期選擇為8周，這是根據(jù)大鼠的壽命周期長(zhǎng)度安排的，由文獻(xiàn)[13]可知，SD大鼠的壽命為2～3年，而8周約占大鼠整個(gè)生命周期的6%～7%，相當(dāng)于人類生命周期中的4～5年（按照平均壽命75歲計(jì)算）。由此可見(jiàn)，對(duì)于SD大鼠來(lái)說(shuō)，8周的跑臺(tái)訓(xùn)練應(yīng)屬于較長(zhǎng)時(shí)間的系統(tǒng)的訓(xùn)練。

BMD是指單位體積內(nèi)的骨礦含量，是影響骨組織力學(xué)性能的一個(gè)重要指標(biāo)，目前國(guó)內(nèi)外均把BMD作為評(píng)價(jià)骨強(qiáng)度的一個(gè)最方便、最常用的臨床指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可顯著提高生長(zhǎng)期大鼠股骨BMD，和本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[7-8]一致。近年來(lái)的研究表明[15]，盡管骨組織的力學(xué)性能80%由BMD決定，但是骨組織的力學(xué)性能還與其內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切有關(guān)，尤其對(duì)于對(duì)松質(zhì)骨而言，骨小梁三維構(gòu)筑方式以及骨小梁間的連接性與骨強(qiáng)度密切相關(guān)。骨小梁體積（TBV）反映的是單位體積內(nèi)骨小梁所占的體積百分比，即骨小梁的疏密程度，它同骨小梁寬度（Tb.Wi）和骨小梁數(shù)目（Tb.N）共同反映了松質(zhì)骨中骨小梁的三維結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組大鼠股骨長(zhǎng)度、寬度和厚度指標(biāo)均顯著增加，脛骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)TBV、Tb.Wi和Tb.N均顯著增加，表明跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)皮質(zhì)骨的生長(zhǎng)和松質(zhì)骨骨小梁的三維結(jié)構(gòu)重建，使骨組織更致密，從而增加骨組織的生物力學(xué)強(qiáng)度。四環(huán)素是一種活性熒光物質(zhì)，進(jìn)入血液循環(huán)與無(wú)機(jī)鹽結(jié)合沉積于骨組織礦化前沿，在熒光顯微鏡下，可見(jiàn)到首次標(biāo)記線埋于近小梁表面的骨基質(zhì)中；第二條標(biāo)記線更靠近骨表面。皮質(zhì)骨礦化沉積率（MAR）是熒光雙標(biāo)記帶間的距離除以兩次熒光標(biāo)記相隔的天數(shù)，單位為μm/d，它是反映骨生長(zhǎng)速率的指標(biāo)，它代表成骨細(xì)胞礦化類骨質(zhì)的速度[16]。本研究結(jié)果顯示，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組大鼠MAR顯著大于非跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組大鼠，說(shuō)明跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以增加成骨細(xì)胞的活性，提高其類骨質(zhì)分泌與礦化的速度，促進(jìn)骨的生長(zhǎng)。

3.2 補(bǔ)充HC與生長(zhǎng)期骨生長(zhǎng)

Ⅰ型膠原蛋白是一種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，更是骨組織進(jìn)行鈣化的主要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，它廣泛分布于人類機(jī)體的各種組織，大約占身體蛋白總量的25%，在人類結(jié)締組織中Ⅰ型膠原蛋白的比例更是達(dá)到了80%[17]。研究證明，Ⅰ型膠原蛋白的合成對(duì)于進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化至關(guān)重要[18-19]。業(yè)已證明，動(dòng)物服用HC可以有效提高BMD和骨礦含量（bone mineral content，BMC）[20]，服用HC也能夠顯著增加去卵巢大鼠骨基質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白的含量[21]。而且，骨質(zhì)疏松患者在注射降鈣素的同時(shí)口服HC能夠比單純注射降鈣素具有更強(qiáng)的對(duì)抗骨質(zhì)流失的作用[22]。Guillerminet 等人的研究表明[23]，食用含HC蛋白的食物比食用標(biāo)準(zhǔn)的AIN-93N 食物能夠有效提高去卵巢小鼠的BMD。Mizoguchi 等人發(fā)現(xiàn)[24]，攝取含HC蛋白的食物在顯著增加去卵巢大鼠股骨BMD和骨強(qiáng)度的同時(shí)，能夠顯著提高血清骨鈣素（成骨作用標(biāo)志物），說(shuō)明補(bǔ)充HC能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨作用。而且血清羥脯氨酸和甘氨酸水平增加，說(shuō)明補(bǔ)充HC可顯著提高血清氨基酸水平，這對(duì)合成骨組織蛋白十分重要。此外，體外實(shí)驗(yàn)表明[25]，在成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系中，HC能夠顯著提高堿性磷酸酶（成骨作用標(biāo)志酶）的活性。這些研究結(jié)果表明，口服膠原蛋白肽能夠有效阻止增齡性骨質(zhì)流失，然而，至今仍然沒(méi)有研究證明口服膠原蛋白肽是否也能夠增加生長(zhǎng)期的骨形成作用。本研究的結(jié)果顯示，補(bǔ)充HC能夠增加生長(zhǎng)期大鼠的BMD，提高其骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)，使骨組織更致密，促進(jìn)生長(zhǎng)期的骨生長(zhǎng)。

在本研究中，為了研究動(dòng)物HC攝入水平對(duì)于生長(zhǎng)期骨生長(zhǎng)的影響，動(dòng)物HC的補(bǔ)充分為中等劑量組和高劑量組，此劑量的標(biāo)準(zhǔn)源于參考Reeves PG等人的研究，在Reeves PG等人的研究中[25]推薦，生長(zhǎng)期大鼠食物中適宜的蛋白質(zhì)含量應(yīng)為17.9%，同時(shí)參考Wu J[20]等人和Nomura Y[21]等人研究中關(guān)于大鼠服用HC的劑量，將HC6組和HC6+Ex組大鼠食物（HC蛋白含量為6%，蛋白總含量為20%）作為中等劑量的HC補(bǔ)充，將HC12組和HC12+Ex組大鼠食物（HC蛋白含量為12%，蛋白總含量為20%）作為高劑量的HC補(bǔ)充。值得注意的是，在本研究中，高劑量HC補(bǔ)充組并沒(méi)有比中等劑量HC補(bǔ)充組獲得更高的BMD或骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)。這說(shuō)明對(duì)于生長(zhǎng)期的骨生長(zhǎng)而言，中等劑量的HC補(bǔ)充即能起到較好的效果，而高劑量的補(bǔ)充并不能更好地促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)。已有一些關(guān)于蛋白質(zhì)攝入水平對(duì)骨量影響的研究，如蛋白質(zhì)缺乏可引起胰島素樣生長(zhǎng)因子1的分泌減少，從而能夠阻止正常的骨量合成[27]。Takeda等人的研究表明，在生長(zhǎng)期蛋白質(zhì)攝入不足可減少骨量的獲得并且使骨強(qiáng)度下降[28]。然而，過(guò)高的蛋白攝入可導(dǎo)致尿鈣分泌的增加，同樣也可因此導(dǎo)致骨吸收作用的增加[29]，在生長(zhǎng)期攝入過(guò)高的蛋白質(zhì)也可以抑制跑臺(tái)訓(xùn)練引起的骨量的獲得和骨強(qiáng)度的增加[28]。然而，Takeda等人的研究是以酪蛋白作為蛋白質(zhì)補(bǔ)充物質(zhì)，而對(duì)于高水平攝入HC同時(shí)結(jié)合跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)于生長(zhǎng)期骨量獲得的影響仍屬未知，所以本研究的目的在于研究是否高水平的HC補(bǔ)充比中等水平的HC補(bǔ)充能夠更加有效提高生長(zhǎng)期大鼠的骨量。

3.3 補(bǔ)充HC與跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)聯(lián)合作用與生長(zhǎng)期骨生長(zhǎng)

已有多數(shù)關(guān)于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和運(yùn)動(dòng)聯(lián)合作用對(duì)BMD和骨結(jié)構(gòu)影響的研究，如李爽等[30]研究了運(yùn)動(dòng)與中藥聯(lián)合作用對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠BMD的影響，結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)與中藥聯(lián)合作用較單純運(yùn)動(dòng)或中藥治療有較好的治療效果，同時(shí)減少副作用。再如章曉霜等[31]研究了不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和雌激素聯(lián)合作用對(duì)去卵巢大鼠骨骼生物力學(xué)性能的影響，結(jié)果顯示單純運(yùn)動(dòng)對(duì)力直接作用部位的力學(xué)性能—股骨頸最大載荷的影響大于單純補(bǔ)充雌激素，運(yùn)動(dòng)和雌激素?zé)o明顯協(xié)同作用；對(duì)于非力直接作用部位的力學(xué)性能—第2 腰椎最大凹入載荷及第3 腰椎最大壓縮載荷，運(yùn)動(dòng)和雌激素聯(lián)合有一定的協(xié)同作用。然而上述研究均是對(duì)去卵巢模擬婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠進(jìn)行的研究，而關(guān)于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和運(yùn)動(dòng)聯(lián)合作用對(duì)生長(zhǎng)期大鼠BMD和骨結(jié)構(gòu)影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道，而且也未見(jiàn)有關(guān)HC補(bǔ)充與運(yùn)動(dòng)聯(lián)合作用對(duì)骨生長(zhǎng)或骨代謝影響的報(bào)道。本研究的結(jié)果顯示：不論股骨BMD和形態(tài)學(xué)指標(biāo)還是脛骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)，補(bǔ)充HC與跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)聯(lián)合作用均比單純補(bǔ)充HC和單純跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能夠更大幅度地促進(jìn)生長(zhǎng)期的骨生長(zhǎng)。這提示我們，補(bǔ)充HC和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)在促進(jìn)生長(zhǎng)期骨生長(zhǎng)方面具有協(xié)同效應(yīng)，二者分別從營(yíng)養(yǎng)攝入和改變骨組織的應(yīng)力環(huán)境方面促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨活性，從而提高新骨組織的生成。

4 結(jié)論

4.1 補(bǔ)充HC與跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)均能有效提高生長(zhǎng)期BMD，使骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)增加，促進(jìn)生長(zhǎng)期的骨生長(zhǎng)。

4.2 對(duì)于促進(jìn)生長(zhǎng)期骨生長(zhǎng)而言，補(bǔ)充HC與跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)具有協(xié)同作用，其效果優(yōu)于單純補(bǔ)充HC或單純跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

4.3 中等劑量的HC補(bǔ)充即能較好地促進(jìn)生長(zhǎng)期的骨生長(zhǎng)，而高劑量的補(bǔ)充并不能起到更好效果。

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