消油劑處理180#燃料油對(duì)黃海膽(GlyptocidarisCrenularis)抗氧化酶系統(tǒng)影響的初步探究*

殷　悅，熊德琪，張欣欣，何　山，段美娜，呂昕璐

(大連海事大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116026)

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消油劑處理180#燃料油對(duì)黃海膽(GlyptocidarisCrenularis)抗氧化酶系統(tǒng)影響的初步探究*

殷悅，熊德琪*，張欣欣，何山，段美娜，呂昕璐

(大連海事大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116026)

摘要:本文研究了180#燃料油分散液(Water-Accomodated Fractions, WAFs)和乳化液(Chemical Enhanced Water-Accomodated Fractions, CEWAFs)對(duì)黃海膽(Glyptocidaris Crenularis)腸和性腺組織抗氧化酶系統(tǒng)的毒性影響。將黃海膽暴露在不同質(zhì)量濃度的WAFs和CEWAFs中，96 h后提取其腸和性腺，測(cè)定暴露期抗氧化系統(tǒng)各酶的活性；再用海水培養(yǎng)，7 d后進(jìn)行恢復(fù)期抗氧化酶活性測(cè)定。研究結(jié)果顯示，WAFs和CEWAFs對(duì)抗氧化酶活性均呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制效應(yīng)，暴露期海膽腸組織的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)在WAFs中的最大誘導(dǎo)率分別為40.21%，46.03%，26.01%，23.89%；在CEWAFs中的最大誘導(dǎo)率分別為38.60%，48.83%，29.34%，27.86%。實(shí)驗(yàn)組性腺組織抗氧化酶活性最大誘導(dǎo)率均高于腸組織，且恢復(fù)期與暴露期規(guī)律基本一致。由此可知，黃海膽性腺組織較腸組織對(duì)石油烴更為敏感。通過對(duì)比可以得出海膽CAT、SOD對(duì)石油烴污染的敏感度更高，更適合作為監(jiān)測(cè)海洋石油烴污染的生物標(biāo)志物。對(duì)照組間差異不明顯，說明消油劑本身對(duì)生物無明顯急性毒性效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：消油劑；180#燃料油；黃海膽；抗氧化酶系；酶活性

隨著全球一體化的趨勢(shì)日益推進(jìn)，我國對(duì)外經(jīng)貿(mào)往來也更加頻繁，并且由于水路運(yùn)輸憑借費(fèi)用低、運(yùn)輸距離長、運(yùn)輸噸位大等優(yōu)勢(shì)成為主要運(yùn)輸方式，故沿海地區(qū)船運(yùn)事業(yè)蓬勃發(fā)展，船用燃料油已然占據(jù)燃料油市場(chǎng)的主導(dǎo)地位[1-4]。船用燃料油主要由石油的裂化殘?jiān)秃椭别s殘?jiān)椭瞥?，主要成分含有非烴化合物、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)等[5]。本實(shí)驗(yàn)所用的180#燃料油，粘度大熱值高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定不易降解。當(dāng)其聚集于深層海域，就會(huì)污染海洋生態(tài)環(huán)境，破壞底棲生物結(jié)構(gòu)，從而給漁業(yè)帶來不利影響[6]。目前，雖已研發(fā)出消油劑來清理海面上的油污，但其給海洋生物帶來的危害也是不容忽視的[7-8]。Hannah等[9]以藍(lán)蟹幼體作為受試生物，研究了消油劑對(duì)其急性毒性效應(yīng)，結(jié)果表明隨著消油劑質(zhì)量濃度增加藍(lán)蟹幼體活動(dòng)靈活性下降。E. Cotou等[10]通過消油劑對(duì)生長期鹵蟲無節(jié)幼體的三磷酸腺苷酶促系統(tǒng)毒性作用研究，發(fā)現(xiàn)了消油劑對(duì)生物的毒性效應(yīng)。Gong等[11]，Etkinds[12],Lessard和Demarlog[13],Xia等[14]研究表明，消油劑是由表面活性劑及含有大量多環(huán)芳烴等毒性極強(qiáng)的有機(jī)溶劑和助劑組成，故其不僅不能徹底清除油污而且會(huì)造成二次污染。

目前，已有大量關(guān)于石油烴對(duì)海洋中藻類、浮游微生物、魚類、甲殼類等海洋生物的毒性效應(yīng)影響研究[15-20]。國內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)抗氧化酶防御系統(tǒng)的研究表明，生物體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽含量(GSH)等活性(含量)升高或降低程度往往與機(jī)體受毒性影響程度有著一定關(guān)系[21-25]。因此,抗氧化酶系統(tǒng)的活性被作為生物毒理研究的重要指標(biāo)，對(duì)它的測(cè)定也是判斷環(huán)境污染的警示性手段。本文選用180#燃料油和GM-2型消油劑對(duì)黃海膽(GlyptocidarisCrenularis)進(jìn)行急性毒理實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其SOD，CAT，GST酶活性和GSH含量，為海洋溢油污染對(duì)底棲生物的影響評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1受試生物

本實(shí)驗(yàn)選用將黃海膽(GlyptocidarisCrenularis)置于室溫(13±2) ℃、鹽度31.4的實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)3個(gè)月后，選擇生理性狀正常、反應(yīng)敏捷、狀態(tài)健康、大小一致的海膽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用海膽直徑(5±0.2) cm左右、體重(57.4±3.2) g、30個(gè)月齡左右。

1.1.2受試油品

本實(shí)驗(yàn)選用180#船用燃料油作為受試油品，黏度大，在50 ℃時(shí)其運(yùn)動(dòng)黏度小于180，熱值高，含有大量的非烴化物、膠質(zhì)和瀝青質(zhì)，由大連船舶燃料公司提供。

本實(shí)驗(yàn)選用GM-2型消油劑作為實(shí)驗(yàn)消油劑，購自青島光明環(huán)保技術(shù)有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器

JY92-Ⅱ型細(xì)胞破碎儀、微型離心機(jī)(Beckman Microfuge 18)、冷凍臺(tái)式離心機(jī)(Thermo Fisher)、酶標(biāo)儀、基因研究型超純水機(jī)(FJY2002-UVF-P)、DK-8D型電熱恒溫水浴鍋、FA1004型電子天平、JDS-109U紅外測(cè)油儀、JB-3型磁力攪拌器、Beckman J2-MC型高速冷凍離心機(jī)、HH-S水浴鍋等。

1.1.4實(shí)驗(yàn)試劑

無水乙醇(分析純)、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)、抗氧化酶活性測(cè)試試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)、NaCl(分析純)、CCl4(紅外測(cè)油專用)等。

1.2受試液制備

1.2.1180#燃料油WAFs(Water-Accomodated Fractions)的制備

將180#燃料油與過濾海水按一定質(zhì)量體積比例混合，置于2 L燒杯中封口避光，磁力攪伴器低速攬拌24 h，控制漩渦高度為總體系高度的25%～30%。靜置6 h后，分離下層水相即為WAF母液。將母液置于4 ℃環(huán)境中避光保存，實(shí)驗(yàn)前稀釋至所需濃度。

1.2.2180#燃料油CEWAFs(Chemical Enhanced Water-Accomodated Fractions)的制備

將180#燃料油與過濾海水按一定的質(zhì)量體積比混合，并加入油品質(zhì)量20%的消油劑，攬拌24 h后靜置6 h，分離下層水相即為CEWAFs母液，置于4 ℃環(huán)境中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

以上受試液制備均為預(yù)實(shí)驗(yàn)所用，油水配比濃度可按實(shí)驗(yàn)具體要求改變。

1.2.3消油劑空白對(duì)照組受試液制備

在2 L海水中加入油品質(zhì)量20%的GM-2型消油劑，按照上述方法與上述2種受試液一同攪拌24 h后，靜置6 h，分離下層水相，置于4 ℃環(huán)境中避光貯存待用。

1.2.4實(shí)驗(yàn)濃度梯度設(shè)定

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的96 h-EC50值為實(shí)驗(yàn)組的WAFs組和CEWAFs組設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別用紅外測(cè)油儀測(cè)出其實(shí)際質(zhì)量濃度(表1)。

表1　質(zhì)量濃度梯度設(shè)定

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1暴露實(shí)驗(yàn)

暴露期分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組包括WAFs組和CEWAFs組，將18只黃海膽置于32 cm×16.5 cm×24 cm玻璃缸中，暴露在根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的0.312 5，0.625，1.25，2.5和5 g/L五組質(zhì)量濃度WAFs和CEWAFs(總體積為2 L)中培養(yǎng)。對(duì)照組為海水空白對(duì)照和消油劑空白對(duì)照，按照最佳分散比例，消油劑對(duì)照組受試液2 L海水中加入2 g消油劑；海水對(duì)照組即受試液僅為2 L海水。進(jìn)行24 h更換一次受試液的半靜態(tài)暴露，96 h后，從容器中隨機(jī)選取3只海膽用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2恢復(fù)實(shí)驗(yàn)

暴露期后只用2 L海水培養(yǎng)，24 h換1次水，7 d后按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3樣品預(yù)處理

取各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中海膽部分腸和性腺組織，在4 ℃生理鹽水(0.86%)中漂洗，用濾紙拭干后，置于10 mL小燒杯中，稱重并記錄。向小燒杯中加入2/3體積的質(zhì)量為組織樣品9倍的生理鹽水，用醫(yī)用剪刀盡快剪碎組織，整個(gè)過程應(yīng)將小燒杯置于冰水中進(jìn)行。

將超聲粉碎機(jī)的電流調(diào)至400A，超聲時(shí)間為5 s/次，間隔10 s，重復(fù)5次，即得到組織勻漿。

將制備好的10%組織勻漿用低溫高速離心機(jī)在4 ℃、轉(zhuǎn)速為2 000 r/min條件下離心10 min，取上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4酶活性測(cè)定

蛋白含量測(cè)定需按照考馬斯亮藍(lán)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

抗氧化酶活性的測(cè)定參照SOD，CAT，GSH-Px，GST試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4數(shù)據(jù)處理

誘導(dǎo)率計(jì)算公式：

誘導(dǎo)率=(Ni-N)/N×100%，

(1)

式中，Ni為實(shí)驗(yàn)組受誘導(dǎo)后酶活性(含量)；N為對(duì)照組酶活性(含量)。

各酶活性的計(jì)算公式均根據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。當(dāng)0.01≤p≤0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著，p≤0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1暴露期黃海膽體內(nèi)酶活性變化

暴露在油水配比質(zhì)量濃度分別為0.312 5，0.625，1.25，2.5和5 g/L的燃料油WAFs和CEWAFs中96 h的黃海膽，其腸和性腺組織中CAT、SOD、GST酶活性及GSH含量不僅實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著，而且各實(shí)驗(yàn)組間亦存在顯著差異，圖1～圖4可清晰反映出2種暴露液對(duì)黃海膽腸和性腺組織中抗氧化酶活性的影響。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白，表示每毫克蛋白中酶活性大小；“a”表示該組數(shù)據(jù)和對(duì)照空白組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖1　暴露期WAFs和CEWAFs對(duì)黃海膽腸和性腺的CAT酶活性影響Fig.1　Effect of WAFs and CEWAFs on CAT activity of G. Crenularis in intestine and gonad during the exposure period

由圖1可知，黃海膽經(jīng)不同質(zhì)量濃度的WAFs和CEWAFs暴露96 h后，其腸和性腺組織的CAT酶活性變化趨勢(shì)大致相同，均先升高后降低。質(zhì)量濃度為0.625 g/L到1.25 g/L時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著差異，說明暴露液對(duì)CAT酶活性誘導(dǎo)作用顯著。當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度為1.25 g/L時(shí)，腸和性腺的CAT酶活性達(dá)到最大誘導(dǎo)值，即在WAFs和CEWAFs中分別為120.72，103.19 U/mgprot和123.02，114.14 U/mgprot。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白，表示每毫克蛋白中酶活性大??；“a”表示該組數(shù)據(jù)和對(duì)照空白組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖2　暴露期WAFs和CEWAFs對(duì)黃海膽腸和性腺的SOD酶活性影響Fig.2　Effect of WAFs and CEWAFs on SOD activity of G. Crenularis in intestine and gonad during exposure period

由圖2可知，實(shí)驗(yàn)組腸和性腺組織SOD酶活性明顯高于對(duì)照組，說明WAFs和CEWAFs對(duì)SOD顯著誘導(dǎo)。而酶活性總體呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)，說明一定質(zhì)量濃度時(shí)誘導(dǎo)作用減弱，出現(xiàn)抑制效應(yīng)。WAFs組油水配比質(zhì)量濃度為2.5 g/L時(shí)，SOD酶活性出現(xiàn)最大誘導(dǎo)值，腸為113.06 U/mgprot、性腺為113.67 U/mgprot；而CEWAFs組，油水配比質(zhì)量濃度為1.25 g/L時(shí)，SOD酶活性達(dá)到最大誘導(dǎo)值，腸和性腺分別為119.57，116.95 U/mgprot。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白，表示毫克蛋白中酶活性大?。弧癮”表示該組數(shù)據(jù)和對(duì)照空白組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖3　暴露過程中WAFs和CEWAFs對(duì)黃海膽腸和性腺的GST酶活性影響Fig.3　Effect of WAFs and CEWAFs on GST activity of G. Crenularis in intestine and gonad during the exposure period

由圖3可知，暴露期黃海膽腸和性腺組織的GST酶活性均隨著WAFs和CEWAFs質(zhì)量濃度的升高先增大后減小。當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度0.312 5 g/L時(shí)各組織GST酶活性均WAFs組低于CEWAFs組,說明此質(zhì)量濃度時(shí)CEWAFs組對(duì)GST酶活性誘導(dǎo)強(qiáng)度大于WAFs。而油水配比質(zhì)量濃度5 g/L時(shí)，情況則相反。當(dāng)油水配比濃度為2.5 g/L時(shí)，暴露在WAFs中的海膽腸和性腺中GST酶活性均最大，即最大誘導(dǎo)值為127.82,128.46 U/mgprot；而油水配比濃度為1.25 g/L時(shí)，CEWAFs中海膽腸和性腺中GST酶活性均最大，最大誘導(dǎo)值為140.19,134.13 U/mgprot。

注：“a”表示該組數(shù)據(jù)和對(duì)照空白組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖4　暴露期WAFs和CEWAFs對(duì)黃海膽腸和性腺的GSH含量影響Fig.4　Effect of WAFs and CEWAFs on GSH content of G. Crenularis in intestine andgonad during the exposure periodd

由圖4可知，當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度為0.312 5 g/L時(shí)，腸和性腺組織中GSH含量均略有上升，說明2種暴露液對(duì)GSH酶含量的誘導(dǎo)作用較弱。隨著油水配比質(zhì)量濃度的升高，GSH含量增加，說明2種受試液對(duì)GSH酶活性誘導(dǎo)效應(yīng)增強(qiáng)。達(dá)到最大值后酶活下降，發(fā)生抑制作用。當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度為1.25 g/L時(shí)，暴露在WAFs和CEWAFs中的黃海膽腸和性腺GSH含量均達(dá)到最大誘導(dǎo)值，即腸中分別為178.67，191.03 μmol/L，性腺中分別為170.81，187.97 μmol/L。而且相鄰濃度組之間基本上存在極顯著差異。

表2　暴露期WAFs與CEWAFs對(duì)黃海膽抗氧化酶活性誘導(dǎo)效應(yīng)的比較

由表2可見，WAFs組油水配比質(zhì)量濃度為2.5 g/L時(shí)，腸和性腺組織中的SOD和GST均達(dá)到最大誘導(dǎo)率，即該質(zhì)量濃度對(duì)SOD和GST酶活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)；而CEWAFs組油水配比質(zhì)量濃度在1.25 g/L時(shí)對(duì)CAT，SOD，GST，GSH酶活性誘導(dǎo)強(qiáng)度最大。從最大誘導(dǎo)率來看，無論是腸還是性腺，SOD和CAT均為最大，可以說明二者對(duì)暴露液的誘導(dǎo)作用敏感度最高。

2.2恢復(fù)期黃海膽體內(nèi)酶活性變化

經(jīng)過7 d恢復(fù)期，海膽腸和性腺中CAT，SOD和GST酶活性和GSH含量變化趨勢(shì)與暴露期大體一致，如圖5～圖8。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白，表示每毫克蛋白中酶活性大??；“a”表示該組數(shù)據(jù)和對(duì)照空白組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖5　恢復(fù)期WAFs和CEWAFs對(duì)黃海膽腸和性腺的CAT酶活性影響Fig.5　Effect of WAFs and CEWAFs on CAT activity of G. Crenularis in intestine and gonad during the recovery period

由圖5可見，恢復(fù)期的黃海膽腸和性腺組織的CAT酶活性發(fā)生了顯著變化，相鄰質(zhì)量濃度組之間表現(xiàn)出極顯著差異，變化趨勢(shì)隨著暴露期油水配比質(zhì)量濃度的增加呈先增加后降低。恢復(fù)期同暴露期相比，實(shí)驗(yàn)組的酶活性均有所降低，說明活性有所恢復(fù)。暴露在WAFs和CEWAFs中的黃海膽均在恢復(fù)期油水配比質(zhì)量濃度為1.25 g/L時(shí)腸和性腺組織的CAT酶活性最大，腸中最大誘導(dǎo)值WAFs組為111.98 U/mgprot、CEWAFs組為99.68 U/mgprot，性腺中最大誘導(dǎo)值WAFs組為115.84 U/mgprot，CEWAFs組為101.31 U/mgprot。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白,表示每毫克蛋白中酶活性大小；“a”表示該組數(shù)據(jù)和對(duì)照空白組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖6　恢復(fù)期WAFs和CEWAFs對(duì)黃海膽腸和性腺的SOD酶活性影響Fig.6　Effect of WAFs and CEWAFs on SOD activity of G. Crenularis in intestine and gonad during the recovery period

經(jīng)過7 d恢復(fù)期，黃海膽腸和性腺中SOD酶活性同暴露期相比，對(duì)應(yīng)油水配比質(zhì)量濃度下的SOD酶活性與對(duì)照組差異性減弱，隨著WAFs和CEWAFs質(zhì)量濃度的增大酶活性仍呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，但變化程度減小。海膽腸和性腺組織SOD酶活性最大誘導(dǎo)值出現(xiàn)在質(zhì)量濃度為2.5 g/LWAFs組，即109.47,109.06 U/mgprot。CEWAFs組腸和性腺組織的SOD酶活性達(dá)到最大誘導(dǎo)值的油水配比質(zhì)量濃度為1.25 g/L，即112.33,108.70 U/mgprot(圖6)。

注：U/mgprot中U為酶活性單位，mgprot為毫克蛋白,表示每毫克蛋白中酶活性大??；“a”表示該組數(shù)據(jù)和對(duì)照空白組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖7　恢復(fù)期WAFs和CEWAFs對(duì)黃海膽腸和性腺的GST酶活性影響Fig.7　Effect of WAFs and CEWAFs on GST activity of G. Crenularis in intestine and gonad during the recovery period

當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度為0.312 5 g/L時(shí)，性腺組織中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無顯著差異，油水配比質(zhì)量濃度為0.625，1.25和2.5 g/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均呈現(xiàn)極顯著差異，而且相鄰濃度組之間亦差異顯著，腸組織中GST酶活性的差異形態(tài)與性腺組織基本一致。與暴露期WAFs和CEWAFs油水配比質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的腸和性腺中GST酶活性均隨著配比質(zhì)量濃度的增大出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，而這種變化程度和暴露期相比較小，最大誘導(dǎo)值也下降，暴露期WAFs和CEWAFs中腸組織的GST酶活性最大誘導(dǎo)值分別為132.26 U/mgprot和140.19 U/mgprot；恢復(fù)期對(duì)應(yīng)WAFs和CEWAFs中腸組織的GST酶活性最大誘導(dǎo)值分別為125.04 U/mgprot和131.29 U/mgprot(圖7)。

注：“a”表示該組數(shù)據(jù)和對(duì)照空白組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“aa”表示差異極顯著(p≤0.01)；“b”表示組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果呈差異顯著(0.01≤p≤0.05)；“bb”表示差異極顯著(p≤0.01)圖8　恢復(fù)期WAFs和CEWAFs對(duì)黃海膽腸和性腺的GSH含量影響Fig.8　Effect of WAFs and CEWAFs on GSH content of G. Crenularis in intestine and gonad during the recovery period

如圖8所示，和暴露期相比，經(jīng)過7 d恢復(fù)腸和性腺中試驗(yàn)組GSH的含量有不同程度的降低，隨著油水配比質(zhì)量濃度的增大，含量出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，但變化程度明顯下降。當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度為0.312 5，0.625，1.25和2.5 g/L時(shí)，試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的GSH含量呈現(xiàn)顯著差異，相鄰濃度組之間亦表現(xiàn)顯著差異。在油水配比質(zhì)量濃度為1.25 g/L時(shí)，腸中GSH含量在WAFs組和CEWAFs組中均出現(xiàn)最大誘導(dǎo)值，分別為172.90，182.81 μmol/L。而性腺中GSH含量在WAFs組和CEWAFs組中亦均出現(xiàn)最大誘導(dǎo)值，分別為166.84，181.35 μmol/L。

表3　恢復(fù)期WAFs與CEWAFs對(duì)黃海膽抗氧化酶活性誘導(dǎo)效應(yīng)的比較

與暴露期相比，最大誘導(dǎo)率均有所下降。但WAFs和CEWAFs組對(duì)各酶活性的最大誘導(dǎo)濃度與暴露期相同。經(jīng)過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，WAFs組性腺中SOD酶活性恢復(fù)程度較其他3種酶相比最為顯著，CEWAFs組性腺中CAT和SOD酶活性均顯著恢復(fù)。

3討論

劑量-效應(yīng)柱形圖是被采用最頻繁的生物急性毒性研究結(jié)果的反應(yīng)形式[26]，它能清晰反映出想要對(duì)比的數(shù)值之間的差異情況。暴露期和恢復(fù)期各實(shí)驗(yàn)組的抗氧化酶活性均不同程度的高于對(duì)照組，說明WAFs和CEWAFs對(duì)腸和性腺的抗氧化酶系統(tǒng)均起著不同程度的誘導(dǎo)作用，從整體趨勢(shì)看誘導(dǎo)強(qiáng)度先增大后減小。

在不同質(zhì)量濃度組之間進(jìn)行比較，0.312 5，0.625，1.25 g/L的CEWAFs對(duì)黃海膽的抗氧化酶誘導(dǎo)作用依次增強(qiáng)，達(dá)到最大誘導(dǎo)值后開始減弱，抗氧化酶活性開始下降。而WAFs對(duì)于SOD和GST酶活性最大誘導(dǎo)濃度達(dá)到2.5 g/L，CAT和GSH酶活性最大誘導(dǎo)濃度均為1.25 g/L。由此說明從最大誘導(dǎo)濃度開始，生物體細(xì)胞受損，抗氧化酶系統(tǒng)被破壞。盡管CEWAFs濃度約WAFs的3倍，但CEWAFs組2個(gè)時(shí)期的抗氧化酶活性整體卻并沒有高出WAFs組3倍。這與Milinkovitch等[27]的研究中得出了相同的結(jié)果，加入化學(xué)消油劑的暴露液(CD)總石油烴濃度近似原油分散液(MD)總石油烴濃度3倍，而所測(cè)得的GST和GPx均是CD略高于MD，而SOD、CAT則MD略高于CD，其原因可能是CD的PAH含量較MD低，ROS較少，故不能充分激發(fā)抗氧化酶活性[28]。這同時(shí)也說明了化學(xué)消油劑的使用，在一定程度上降低了石油中PAH的含量。

從表2和表3來看，不同組織之間受WAFs和CEWAFs的誘導(dǎo)影響規(guī)律為，性腺組織大于腸組織。且腸和性腺的SOD和CAT活性對(duì)于暴露液誘導(dǎo)和抑制作用的敏感性較GST和GSH要相對(duì)強(qiáng)一些。余群等[29-32]認(rèn)為SOD和CAT活性更能在一定程度上反映生物毒性機(jī)制，因此更適合作為溢油污染的生物標(biāo)志物。其研究石油烴脅迫對(duì)海洋生物的急性毒性影響結(jié)果顯示，SOD和CAT酶活性隨著暴污濃度的上升而增強(qiáng)，達(dá)到最大誘導(dǎo)值后便下降。說明SOD和CAT活性的增強(qiáng)是機(jī)體對(duì)抗氧化脅迫的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，然而這種適應(yīng)性調(diào)節(jié)能力有限，當(dāng)劑量過高氧化脅迫壓力增強(qiáng)時(shí)，氧化損傷在所難免，酶活降低，從而使機(jī)體細(xì)胞受損出現(xiàn)病變致畸甚至致死。本文中SOD和CAT活性受影響變化程度較為顯著，恢復(fù)程度較好，因此二者可看作抗氧化防御機(jī)制的主要調(diào)節(jié)功能酶。

GSH是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，其特點(diǎn)是水溶性較強(qiáng)。在谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)作用下把 H2O2還原為 H2O，其自身被氧化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)。而GSSG又可被還原酶催化受H轉(zhuǎn)化為GSH，進(jìn)而持續(xù)清除活性氧自由基，減輕氧化脅迫毒性影響。本實(shí)驗(yàn)中，GSH含量實(shí)驗(yàn)組始終高于對(duì)照組且CEWAFs組高于WAFs組，這與黃志斐等[33]研究BDE209脅迫對(duì)翡翠貽貝(Perna viridis)SOD，MDA和GSH的影響中結(jié)論相一致。表明隨著暴露液濃度上升，GSH大量消耗同時(shí)也大量合成，故活性增加。達(dá)到最大誘導(dǎo)濃度后，機(jī)體氧化損傷加重，自身調(diào)節(jié)機(jī)制無法有效緩解氧化脅迫壓力，GSH消耗遠(yuǎn)大于合成，故含量降低。

Milinkovitch等[34]和Marques等[35]在研究原油及消油劑對(duì)鯔魚心臟組織生物標(biāo)記物毒性效應(yīng)中表明，CD組GST酶活性高于MD組，二者均顯著高于對(duì)照組并且此規(guī)律在暴露期和恢復(fù)期相同，此結(jié)論與本文相一致。GST可促進(jìn)氧化型PAH與GSH結(jié)合，故GST增加則GSH會(huì)有所減少，但本實(shí)驗(yàn)中并沒用體現(xiàn)出此規(guī)律。

4結(jié)論

本文探究了180#燃料油WAFs和CEWAFs對(duì)黃海膽抗氧化酶活性的影響，得出如下結(jié)論：

1)暴露后的黃海膽腸和性腺組織中抗氧化酶活性隨著暴露液濃度的增加出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)，說明機(jī)體在WAFs和CEWAFs暴露下既可產(chǎn)生適應(yīng)性“毒性興奮”作用，表現(xiàn)為酶活性因受到誘導(dǎo)而升高；也受到抑制產(chǎn)生中毒反應(yīng)，表現(xiàn)為各酶活力下降。

2)CEWAFs組和WAFs組的各酶活性最大誘導(dǎo)濃度均相同，說明二者對(duì)黃海膽抗氧化酶活性的效應(yīng)濃度大致相同，然而二者質(zhì)量濃度相差懸殊，這其中具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

3)從抗氧化酶活性上來看，CAT和SOD這兩種酶變化幅度較大，表現(xiàn)較為活躍，與其他學(xué)者研究作對(duì)比分析，得出結(jié)論，CAT和SOD可看作抗氧化防御機(jī)制的主要調(diào)節(jié)功能酶。二者也更適合作溢油污染評(píng)估分析的生物標(biāo)記物。

4)暴露期腸和性腺的各酶活性最大誘導(dǎo)率均為CEWAFs組高于WAFs組，說明經(jīng)過化學(xué)消油劑增溶后的180#燃料油乳化液毒性效應(yīng)要高于燃料油單獨(dú)作用的毒性效應(yīng)。同時(shí)也反映了目前噴灑消油劑這種海上溢油的處理方法還有待進(jìn)一步研究和改善，從而使溢油事故得到更加優(yōu)化高效的防治。

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Received: June 25, 2015

*收稿日期：2015-06-25

作者簡介：殷悅(1992-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事環(huán)境毒理學(xué)方面研究.E-mail：18841129227@163.com *通訊作者：熊德琪(1967-)，男，遼寧大連人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事海洋生態(tài)毒理學(xué)與溢油損害評(píng)估方面研究.E-mail：xiongdq@dlmu.edu.cn(王佳實(shí)編輯)

中圖分類號(hào)：X55

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-6647(2016)02-0292-12

doi:10.3969/j.issn.1671-6647.2016.02.014

Compound Toxicity of No.180 Fuel Oil Disposed by Oil Spill Dispersant onGlyptocidarisCrenularis

YIN Yue, XIONG De-qi, ZHANG Xin-xin, HE Shan, DUAN Mei-na, Lü Xin-lu

(SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,DalianMaritimeUniversity, Dalian 116026, China)

Abstract:In this study, the compound toxic effects of 180# fuel oil water-accommodated fractions (WAFs) and chemically enhanced water-accommodated fractions (CEWAFs) on the antioxidant enzyme system in gonadal and intestinal tissues of Glyptocidaris Crenularis were investigated. During the exposure period, the sea urchins were exposed in different concentration gradient of WAFs and CEWAFs for 96 h, then a portion of its intestine and gonad was extracted for antioxidase activities determination. Subsequently, the exposure solution was replaced by filtered seawater to culture the rest of sea urchins for 7 d, then the same antioxidase activities of sea urchins were examined during the recovery period..The results indicated that the CEWAFs and WAFs demonstrated an inductive effect first and then an inhibitory effect to the antioxidase activity. In the exposure period, the maximum inductive rates of CAT、SOD、GST and GSH in WAFs were 40.21%，46.03%，26.01% and 23.89%, in CEWAFs they were 38.60%，48.83%，29.34% and 27.86% respectively. In disposal group, the maximum inductive rates of antioxidase activity in gonad were higher than those in intestine, and same phenomenon was observed during the recovery period as well. The results suggested that the gonad of Glyptocidaris Crenularis is more sensitive to the petroleum hydrocarbon than intestine. By comparison, the activity of CAT and SOD was more sensitive to petroleum hydrocarbon pollutant , suggesting CAT and SOD were better suited as a biomarker for marine oil spill pollution monitoring. There were no significant diversity between the two kinds of control suggesting that the chemical dispersant has inconspicuous toxicity itself.

Key words:oil spill dispersant; 180# fuel oil; Glyptocidaris Crenularis; antioxidase activity

資助項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目——消油劑處理溢油對(duì)模式生物海膽的聯(lián)合毒性效應(yīng)及機(jī)制研究(41276105/D0608)；交通運(yùn)輸部應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目——消油劑處理溢油對(duì)生物的復(fù)合毒害效應(yīng)及機(jī)理研究(2013329225250)