瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1通道影響支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥的研究

趙麗敏，況紅艷，張羅獻(xiàn)，吳紀(jì)珍，陳獻(xiàn)亮，張曉宇，馬利軍

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·論著·

瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1通道影響支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥的研究

趙麗敏，況紅艷，張羅獻(xiàn)，吳紀(jì)珍，陳獻(xiàn)亮，張曉宇，馬利軍

目的探討瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(TRPV1)通道對(duì)支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥的影響。方法2013年6月—2014年6月，選取5～6周齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為：正常對(duì)照組、支氣管哮喘組、支氣管哮喘+辣椒素(CAP)組、支氣管哮喘+辣椒卓平(CPZ)組，每組15只。支氣管哮喘組、支氣管哮喘+CAP組、支氣管哮喘+CPZ組大鼠制作支氣管哮喘模型，支氣管哮喘+CAP組大鼠給予含有0.01% CAP的飼料喂養(yǎng)，支氣管哮喘+CPZ組大鼠給予含有0.01% CPZ的飼料喂養(yǎng)。病理學(xué)檢查顯微鏡下找到完整肺內(nèi)支氣管橫斷面，計(jì)算管壁面積(WA)/管腔內(nèi)周長(zhǎng)(Pi)、支氣管平滑肌面積(S)/Pi、支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)(N)/Pi，采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)和Western blotting法檢測(cè)氣管平滑肌組織TRPV1、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)mRNA及其蛋白表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)大鼠氣管平滑肌組織白介素(IL)-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平。結(jié)果支氣管哮喘組和支氣管哮喘+CAP組大鼠氣管WA/Pi、S/Pi、N/Pi高于對(duì)照組(P<0.05)；支氣管哮喘+CAP組大鼠氣管WA/Pi、S/Pi、N/Pi高于支氣管哮喘組(P<0.05)；支氣管哮喘+CPZ組大鼠氣管WA/Pi、S/Pi、N/Pi低于支氣管哮喘+CAP組(P<0.05)。支氣管哮喘組和支氣管哮喘+CAP組大鼠氣管平滑肌組織TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)；支氣管哮喘+CAP組大鼠氣管平滑肌組織TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平高于支氣管哮喘組(P<0.05)；支氣管哮喘+CPZ組大鼠氣管平滑肌組織TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平低于支氣管哮喘和支氣管哮喘+CAP組(P<0.05)。結(jié)論TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13在支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌組織中高表達(dá)，阻斷TRPV1通道后，氣管平滑肌組織增生和炎癥均明顯減輕，提示TRPV1通道可能在支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥形成中發(fā)揮重要作用。

支氣管哮喘；瞬時(shí)受體電位通道；肌細(xì)胞，平滑??；細(xì)胞增殖；炎癥

趙麗敏，況紅艷，張羅獻(xiàn)，等.瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1通道影響支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥的研究 [J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(21)：2522-2527.[www.chinagp.net]

ZHAO L M,KUANG H Y,ZHANG L X,et al.Function of TRPV1 channel on the proliferation and inflammation in airway smooth muscle cells of asthmatic rat[J].Chinese General Practice，2016，19(21)：2522-2527.

支氣管哮喘是一種常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，也是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。由于支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前的治療只能達(dá)到控制癥狀的效果，因此，進(jìn)一步明確支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制、尋找更有針對(duì)性的治療方法是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1]。氣管重塑是支氣管哮喘的重要病理特征，是支氣管哮喘不可逆氣流阻塞的病理基礎(chǔ)[2]。氣管平滑肌作為氣管壁的主要組成成分，其細(xì)胞增殖是氣管重塑的重要原因之一[3]。瞬時(shí)受體電位香草酸(TRPV)是細(xì)胞膜上重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化起著關(guān)鍵作用，尤其是瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(TRPV1)通道[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1對(duì)支氣管收縮、蛋白分泌、氣管黏膜水腫和炎性細(xì)胞趨化[6]以及咳嗽反射[7-8]等有重要的作用。另外研究發(fā)現(xiàn)，遺傳缺失功能性TRPV1通道的兒童，其活動(dòng)性支氣管哮喘的風(fēng)險(xiǎn)較低[9]。但關(guān)于TRPV1通道在支氣管哮喘氣管平滑肌重塑中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。故本研究擬通過(guò)觀察TRPV1 通道在支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌組織的表達(dá)以及對(duì)氣管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥的影響，來(lái)闡明TRPV1通道在氣管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用和地位，為治療支氣管哮喘氣管平滑肌重塑尋找新的靶點(diǎn)。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(TRPV1)通道影響支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥的研究是在有關(guān)研究工作最新進(jìn)展的基礎(chǔ)上更深一步的研究,系細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)傳導(dǎo)研究領(lǐng)域和分子生物技術(shù)研究領(lǐng)域的前沿和交叉。在氣管平滑肌細(xì)胞中，Ca2+內(nèi)流的途徑包括電壓門(mén)控的Ca2+通道(VOCC)、受體操縱的Ca2+通道(ROC)和容量性Ca2+內(nèi)流(CCE)。瞬時(shí)受體電位香草酸(TRPV)通道家族成員可能參與鈣庫(kù)操縱性通道(SOC)的構(gòu)成，從而影響細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的調(diào)控。以往的研究均是觀察Ca2+相關(guān)通道在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)方面的研究，在呼吸系統(tǒng)方面的研究較少，特別是關(guān)于TRPV1通道在支氣管哮喘氣管重塑中的研究，目前國(guó)內(nèi)、外尚未見(jiàn)類似報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)TRPV1通道和白介素(IL)-4、IL-5、IL-13在支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌組織中高表達(dá)，阻斷TRPV1通道后，氣管平滑肌組織增生和炎癥均明顯減輕，提示TRPV1通道可能在支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥形成中發(fā)揮著重要`作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器TRIZOL試劑購(gòu)于Gibco公司；Omniscript反轉(zhuǎn)錄酶、TRPV1引物(QT00193907)、內(nèi)參β-actin引物(QT00193473)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒、SYBR GreenⅠ購(gòu)于Qiagen(Valencia，CA)；Taq酶購(gòu)于Promega公司；TRPV1兔多抗(ab63083)、內(nèi)參β-actin引物(ab75186)、羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(ab97069)購(gòu)于Abcam公司(英國(guó))；增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)兔多抗(sc-7907)購(gòu)于Santa Cruz公司(美國(guó))；卵清蛋白(OVA)、辣椒素(capsaicin，CAP)、辣椒卓平(capsazepin，CPZ)購(gòu)于Sigma公司(美國(guó))；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司(美國(guó))；含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

主要儀器有定量熒光分光光度計(jì)(Spex AR-CM-MIC)、Bio-Rad PCR儀、Kodak Image station成像系統(tǒng)(美國(guó))、Bio-Rad Mini V垂直電泳儀(GE公司)、Trans Blot儀(GE公司)、酶標(biāo)儀(Bio-tek ELX800)等。

1.2支氣管哮喘模型制作和實(shí)驗(yàn)分組2013年6月—2014年6月，選取5～6周齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60 只，體質(zhì)量180～200 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為：(1)對(duì)照組15只：大鼠給予正常飼料喂養(yǎng)，并以0.9%氯化鈉溶液代替OVA進(jìn)行致敏。(2)支氣管哮喘組15只：大鼠給予正常飼料喂養(yǎng)，按文獻(xiàn)[10-11]方法制成支氣管哮喘模型，第1天每只大鼠腹腔注射含10 mg OVA和200 mg氫氧化鋁的0.9%氯化鈉溶液1 ml，同時(shí)腹腔注射百日咳桿菌疫苗1 ml(約6×109個(gè)菌株)，第8天重復(fù)致敏1次，第15天開(kāi)始激發(fā)。將大鼠置于特制玻璃容器內(nèi)，用超聲霧化器噴入含2% OVA的0.9%氯化鈉溶液50 ml，激發(fā)30 min，3次/周，持續(xù)激發(fā)6周。激發(fā)后大鼠出現(xiàn)呼吸加快、煩躁、嗆咳、輕度發(fā)紺等支氣管哮喘發(fā)作癥狀。(3)支氣管哮喘+CAP組15只：大鼠給予含有0.01% CAP的飼料喂養(yǎng)，造模同上，激發(fā)同上。(4)支氣管哮喘+CPZ組15只：大鼠給予含有0.01% CPZ的飼料喂養(yǎng)，造模同上，激發(fā)同上。末次激發(fā)18～24 h內(nèi)將大鼠處死。取左肺下葉，肺組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定96 h，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色和病理圖像分析；取右肺氣管平滑肌組織，0.9%氯化鈉溶液中漂洗干凈，置于1.5 ml EP管中，放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存，待行實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)、Western blotting、ELISA檢測(cè)。

1.3病理圖像分析在顯微鏡下找到完整肺內(nèi)支氣管橫斷面，采用圖像分析軟件，測(cè)定管腔內(nèi)周長(zhǎng)(Pi)、管壁面積(WA)、支氣管平滑肌面積(S)、支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)(N)，將所測(cè)值用Pi標(biāo)準(zhǔn)化，分別以WA/Pi、S/Pi、N/Pi表示。

1.4RT-qPCR法檢測(cè)氣管平滑肌組織TRPV1、PCNA mRNA表達(dá)水平用TRIZOL試劑提取氣管平滑肌組織總RNA，取100 ng RNA，用Omniscript反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以1 μl cDNA為模板行PCR擴(kuò)增，RT-qPCR樣品反應(yīng)體系采用SYBR GreenⅠ，其最終的反應(yīng)體系為25 μl。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。繪制TRPV1、PCNA和內(nèi)參β-actin的熒光曲線和熔解曲線，并得到各自的熒光域值循環(huán)數(shù)(Ct值)，采用相對(duì)定量法2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.5Western blotting法檢測(cè)TRPV1、PCNA表達(dá)水平取氣管平滑肌組織100 mg，用冰凍的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1遍，濾紙吸干，剪碎后，加入預(yù)冷的含PMSF的RIPA裂解液1 ml，冰磨3 min，至不見(jiàn)組織碎塊，4 ℃，10 000 r/min離心5 min(離心半徑6.5 cm)，取上清液，-80 ℃凍存。采用BCA法測(cè)定蛋白含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白濃度。使用前各組蛋白分別取50 μg，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和蛋白印跡反應(yīng)，半干法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶室溫下?lián)u動(dòng)封閉后加入一抗(TRPV1、PCNA均按1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下漂洗后加入HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000稀釋)，搖床上孵育2 h，TBST充分漂洗后，用ECL發(fā)光劑熒光顯色，曝光后X線片用凝膠圖像分析軟件掃描，并用Image J 4.0 software測(cè)定蛋白條帶的吸光度(OD值)。結(jié)果均用實(shí)際值與內(nèi)參β-actin的比值表示。

1.6ELISA法檢測(cè)大鼠氣管平滑肌組織勻漿上清液中白介素(IL)-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平取右肺氣管平滑肌組織，預(yù)冷的PBS沖洗后濾紙吸干，稱重，剪碎后，加入9倍體積的PBS，冰磨2 min至不見(jiàn)組織碎塊，4 ℃，3 000 r/min離心l5 min(離心半徑6.5 cm)，后取上清液，BCA法測(cè)定蛋白含量，-80 ℃凍存。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平。

2　結(jié)果

2.1病理學(xué)檢查對(duì)照組大鼠肺組織病理切片顯微鏡下可見(jiàn)支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)正常，支氣管管腔光滑，無(wú)閉塞，黏膜下及血管周?chē)M織未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；支氣管哮喘組大鼠肺組織可見(jiàn)細(xì)支氣管黏膜皺襞明顯增多、斷裂，黏膜下及管壁可見(jiàn)大量的嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液栓，氣管壁及氣管平滑肌明顯增厚；支氣管哮喘+CAP組大鼠肺組織可見(jiàn)細(xì)支氣管黏膜皺襞明顯增多、斷裂，黏膜下及管壁可見(jiàn)嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液栓，氣管壁及氣管平滑肌明顯增厚；支氣管哮喘+CPZ組大鼠肺組織可見(jiàn)少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁無(wú)明顯增厚，管壁黏膜光整，黏膜下膠原少，形態(tài)基本接近正常(見(jiàn)圖1，本文彩色圖片見(jiàn)本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。4組大鼠氣管WA/Pi、S/Pi、N/Pi比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中支氣管哮喘組和支氣管哮喘+CAP組大鼠氣管WA/Pi、S/Pi、N/Pi高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；支氣管哮喘+CAP組大鼠氣管WA/Pi、S/Pi、N/Pi高于支氣管哮喘組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；支氣管哮喘+CPZ組大鼠氣管WA/Pi、S/Pi、N/Pi低于支氣管哮喘+CAP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1　4組大鼠氣管WA/Pi，S/Pi，N/Pi比較

注：CAP=辣椒素，CPZ=辣椒卓平，WA=管壁面積，Pi=管腔內(nèi)周長(zhǎng)，S=氣管平滑肌面積，N=氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與支氣管哮喘組比較，bP<0.05；與支氣管哮喘+CAP組比較，cP<0.05

2.2各組大鼠氣管平滑肌組織TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白表達(dá)水平4組大鼠氣管平滑肌組織TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中支氣管哮喘組和支氣管哮喘+CAP組大鼠氣管平滑肌組織TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；支氣管哮喘+CAP組大鼠氣管平滑肌組織TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白表達(dá)水平高于支氣管哮喘組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；支氣管哮喘+CPZ組大鼠氣管平滑肌組織TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白表達(dá)水平低于支氣管哮喘組和支氣管哮喘+CAP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2、圖2)。

2.3各組大鼠氣管平滑肌組織IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平4組大鼠氣管平滑肌組織IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中支氣管哮喘組和支氣管哮喘+CAP組大鼠氣管平滑肌組織IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；支氣管哮喘+CAP組大鼠氣管平滑肌組織IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平高于支氣管哮喘組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；支氣管哮喘+CPZ組大鼠氣管平滑肌組織IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平低于支氣管哮喘+CAP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

3　討論

支氣管哮喘是全球最常見(jiàn)的慢性疾病之一，表現(xiàn)為氣管的高反應(yīng)性、氣管炎癥和氣管阻塞等。其發(fā)病率逐年增高并造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及社會(huì)負(fù)擔(dān)，因此研究支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展及防治，已成為當(dāng)前呼吸領(lǐng)域的前沿課題[1]。近年來(lái)氣管重塑，又稱氣管重建或氣管重構(gòu)，被認(rèn)為是支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制和治療中的作用越來(lái)越受到關(guān)注[12-13]。氣管重塑是以氣管壁細(xì)胞和分子的組成、數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化為特征的一系列慢性損傷和修復(fù)過(guò)程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)沉積、基底膜增厚、氣管平滑肌增生和肥大等[14-15]。作為支氣管哮喘的特征性病理變化，氣管重塑是支氣管哮喘慢性化、持續(xù)化、嚴(yán)重化的病理基礎(chǔ)，是支氣管哮喘存在的不可逆性氣管阻塞的病理基礎(chǔ)，也是激素抵抗性支氣管哮喘的病理基礎(chǔ)[16]。因此，支氣管哮喘的治療必須與防治氣管重塑相結(jié)合，才是真正意義上的治療和控制。氣管平滑肌作為氣管壁的主要組成部分，其過(guò)度增殖是支氣管哮喘氣管重塑的重要原因之一。故氣管平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制探討是目前支氣管哮喘氣管重塑研究的熱點(diǎn)。

Table 2Comparison of expression level of TRPV1，PCNA mRNA and protein in airway smooth muscle tissue among four groups

組別只數(shù)TRPV1mRNAPCNAmRNATRPV1PCNA對(duì)照組151.1±0.11.0±0.21.0±0.11.0±0.2支氣管哮喘組152.1±0.3a2.8±0.4a2.2±0.5a2.5±0.4a支氣管哮喘+CAP組152.9±0.8ab3.6±0.7ab3.2±0.5ab4.3±0.7ab支氣管哮喘+CPZ組151.1±0.2bc0.9±0.1bc1.1±0.2bc1.0±0.1bcF值9.52010.10512.43014.603P值0.0050.0040.0020.001

注：TRPV1=瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1，PCNA=增殖細(xì)胞核抗原；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與支氣管哮喘組比較，bP<0.05；與支氣管哮喘+CAP組比較，cP<0.05

Table 3Comparison of expression level of IL-4，IL-5，IL-13 in airway smooth muscle tissue among four groups

組別只數(shù)IL-4IL-5IL-13對(duì)照組1548.7±3.232.3±4.610.3±1.7支氣管哮喘組15126.1±10.4a72.4±10.4a19.5±2.9a支氣管哮喘+CAP組15156.2±12.7ab119.6±13.9ab29.4±4.0ab支氣管哮喘+CPZ組1558.0±4.6bc35.1±6.9bc9.2±1.2bcF值36.25717.88111.989P值<0.0010.0010.002

注：IL-4=白介素4，IL-5=白介素5，IL-13=白介素13；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與支氣管哮喘組比較，bP<0.05；與支氣管哮喘+CAP組比較，cP<0.05

注：TRPV1=瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1,PCNA=增殖細(xì)胞核抗原

圖2Western blotting法檢測(cè)4組大鼠氣管平滑肌組織TRPV1和PCNA的表達(dá)

Figure 2The protein expression of TRPV1 and PCNA in airway smooth muscle tissue of four groups by Western blotting

注：CAP=辣椒素，CPZ=辣椒卓平

圖14組大鼠氣管病理學(xué)檢查(蘇木精-伊紅染色，×100,Bar=20 μm)

Figure 1The rat airway pathological examination of each group

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在體內(nèi)一系列Ca2+依賴性的生理活動(dòng)中具有重要作用，包括肌肉收縮、神經(jīng)遞質(zhì)和激素的釋放、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞的增殖和凋亡等。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化不僅是影響細(xì)胞生理功能的重要因素，而且也是多種受體激活后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵[17-18]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，氣管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)異常是氣管平滑肌功能異常的重要機(jī)制[19]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化依賴于Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放和再攝取Ca2+等過(guò)程的動(dòng)態(tài)平衡。在氣管平滑肌細(xì)胞中，Ca2+內(nèi)流的途徑包括電壓門(mén)控的Ca2+通道(VOCC)、受體操縱的Ca2+通道(ROC)和容量性Ca2+內(nèi)流(CCE)。由于VOCC阻斷劑對(duì)支氣管哮喘氣管平滑肌的收縮功能和氣管高反應(yīng)性無(wú)明顯作用[20],表明其他通道在氣管平滑肌細(xì)胞Ca2+信號(hào)調(diào)控中具有主導(dǎo)地位。ROC是目前研究較多的離子通道，其中鈣庫(kù)操縱性通道(SOC)是最熱門(mén)、最受重視的一個(gè)ROC亞型[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV通道家族成員可能參與SOC的構(gòu)成，從而影響細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的調(diào)控[22]。

TRPV通道是個(gè)超家族，目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物TRPV 通道家族有6個(gè)成員，可被分為3組：(1)TRPV1(vanilloid receptor 1，VR1)、TRPV2 (vanillod-like receptor1，VRL1)、TRPV4(OTRPC4)； (2) TRPV3； (3) TRPV5(epithelial calcium channel 1/calcium transporter 2，ECaC1/CaT2)、TRPV6(ECaC2/CaT1)。TRPV各個(gè)亞型不同程度地分布在皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)等[23-24]。TRPV1通道可被高溫、細(xì)胞外低pH值、炎性因子、某些化學(xué)毒物等激活，對(duì)野香草分子(包括CAP)較敏感[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1通道對(duì)支氣管收縮、蛋白分泌、氣管黏膜水腫和炎性細(xì)胞趨化等有重要的影響。此外，TRPV1通道受體在慢性咳嗽患者中表達(dá)增加，原因可能是對(duì)慢性炎癥的一種反應(yīng)[26-27]。但關(guān)于TRPV1通道對(duì)支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。 IL-4、IL-5和IL-13是重要的炎性遞質(zhì)，在支氣管哮喘的發(fā)病中起著主要作用[28]。另外，長(zhǎng)期的氣管慢性炎癥可加重氣管重建[29]。 因此，本研究擬通過(guò)觀察TRPV1 通道在支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌的表達(dá)及對(duì)支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平的影響，來(lái)闡明TRPV1通道在支氣管哮喘氣管重建中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌組織中TRPV1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組；同時(shí)，支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌組織中PCNA mRNA及其蛋白表達(dá)水平及IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組。TRPV1通道阻斷劑CPZ干預(yù)的支氣管哮喘大鼠，其氣管重塑明顯得到改善,且其氣管平滑肌組織中TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白表達(dá)水平及IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平均明顯下降。而TRPV1通道激動(dòng)劑CAP有相反的作用。

綜上所述，激活支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌TRPV1通道，可增加細(xì)胞增殖和炎性反應(yīng)，氣管重塑加重;抑制支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌TRPV1通道，可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和炎性反應(yīng)減弱，氣管重塑減輕。因此，本研究推測(cè)，支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌TRPV1通道表達(dá)的增加可能參與了支氣管哮喘氣管平滑肌細(xì)胞的增生、肥厚和炎癥形成。此結(jié)果對(duì)于研究支氣管哮喘的病理生理學(xué)改變及氣管重塑有著重要的意義，并為臨床防治支氣管哮喘提供了一個(gè)新的方向。

作者貢獻(xiàn)：趙麗敏、況紅艷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；張羅獻(xiàn)、吳紀(jì)珍、陳獻(xiàn)亮、張曉宇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；馬利軍進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Function of TRPV1 Channel on the Proliferation and Inflammation in Airway Smooth Muscle Cells of Asthmatic Rat

ZHAOLi-min,KUANGHong-yan,ZHANGLuo-xian,etal.

DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,People′sHospitalofZhengzhouUniversity，HenanProvincialPeople′sHospital，Zhengzhou450003，China

ObjectiveTo observe how TRPV1 channel work on proliferation and inflammation in airway smooth muscle cells of asthmatic rat.MethodsFrom June 2013 to June 2014,60 healthy clean male SD rats which were five to six weeks old were selected and randomly divided into control group，bronchial asthma group，asthma+capsaicin(CAP) group and asthma+capsazepine(CPZ) group.Each group included 15 rats.Asthmatic models were established for bronchial asthma group，asthma+CAP group，asthma+CPZ group.Asthma+CPA group were fed with food which contains 0.01% CAP，asthma+CPZ group were fed with food which contains 0.01% CPZ.Intact cross section of bronchus were observed under microscope，the pipe wall area(WA)/lumen perimeter(Pi)，ASM area(S)/Pi，ASM nuclei number(N)/Pi were caculated.TRPV1 and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) mRNA and protein expression levels in airway smooth muscle tissue were measured by real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR) and Western blotting.Expression level of IL-4，IL-5 and IL-13 in airway smooth muscle tissue homogenate supernatant was measured by enzyme-linked immunosorbent adsorption test(ELISA).ResultsCompared with control group，rats in bronchial asthma group and asthma+CAP group had higher value in WA/Pi，S/Pi，N/Pi(P<0.05).Compared with bronchial asthma group，rats in asthma+CAP group had higher value in WA/Pi，S/Pi，N/Pi(P<0.05).Compared with asthma+CAP group，rats in asthma+CPZ group had lower value in WA/Pi，S/Pi，N/Pi(P<0.05).Compared with control group，bronchial asthma group and asthma+CAP group had higher expression level of TRPV1，PCNA mRNA and protein，IL-4，IL-5，IL-13 in airway smooth muscle tissue(P<0.05).Compared with bronchial asthma group，asthma+CAP group had higher expression level of TRPV1，PCNA mRNA and protein，IL-4，IL-5，IL-13 in airway smooth muscle tissue(P<0.05).Compared with bronchial asthma group and asthma+CAP group，asthma+CPZ group had lower expression level of TRPV1，PCNA mRNA and protein，IL-4，IL-5，IL-13 in airway smooth muscle tissue(P<0.05).ConclusionHigh expressions level of TRPV1，PCNA mRNA and protein,IL-4，IL-5 and IL-13 in airway smooth muscle tissue of asthmatic rats could be inhibited by TRPV1 channel antagonist.TRPV1 channel may play a crucial role in the development of proliferation and inflammation of airway smooth muscle tissue cell.

Bronchial asthma；Transient receptor potential channels；Myocytes，smooth muscle；Cell proliferation；Inflammation

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81100029)

450003河南省鄭州市，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

馬利軍，450003河南省鄭州市，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；E-mail：mlj0401@163.com

R 562.25

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.21.007

2016-01-02；

2016-05-19)

注：趙麗敏、況紅艷共同為第一作者