FTA-巢式PCR方法鑒定溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的初步研究

盧　艷，陳家旭，張永年，李　浩，儲言紅，艾　琳，蔡玉春，陳韶紅

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FTA-巢式PCR方法鑒定溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的初步研究

盧艷，陳家旭，張永年，李浩，儲言紅，艾琳，蔡玉春，陳韶紅

中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心，上海200025

摘要：目的建立一種簡便、快速的FTA-巢式PCR方法用于鑒定糞便中溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(Entamoeba histolytica, E.h)。方法收集門診腹瀉病人新鮮糞便，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行初步檢查。用FTA卡抽提鏡檢結(jié)果為陽性的糞便DNA，根據(jù)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的SSU -rRNA序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析，并對陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序和序列比對分析。結(jié)果根據(jù)光學(xué)顯微鏡檢測結(jié)果，挑選了44例鏡檢結(jié)果為阿米巴原蟲陽性的腹瀉病人糞便。經(jīng)FTA-巢式PCR擴(kuò)增，其中20例樣本可擴(kuò)增出427 bp左右的目的條帶，目的條帶的測序和序列分析結(jié)果表明為溶組織內(nèi)阿米巴原蟲。鏡檢方法與巢式PCR方法的陽性符合率為45.45%(20/44)，將E.h與形態(tài)學(xué)相似的其他內(nèi)阿米巴原蟲進(jìn)行了鑒定和區(qū)分。結(jié)論本研究建立的FTA-巢式PCR方法具有簡單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，為臨床檢驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查中E.h的鑒別診斷提供了新的技術(shù)方法。

關(guān)鍵詞：溶組織內(nèi)阿米巴；FTA；巢式PCR；鑒定

阿米巴腸病是由于溶組織阿米巴(Entamoebahistolytica,E.h)寄生于結(jié)腸內(nèi)，引起阿米巴痢疾或阿米巴結(jié)腸炎一種人獸共患寄生蟲病[1]。該病分布范圍廣，易感機(jī)體較多，呈世界性流行傳播。全球每年約有5千萬人感染，因阿米巴腸炎和阿米巴肝膿腫(amoebic liver abscess, ALA)而死亡的人數(shù)高達(dá)10萬[1-2]，其病死率在原蟲寄生蟲病感染中僅次于瘧疾[3]。E.h原蟲在人體內(nèi)以滋養(yǎng)體和包囊兩種形式存在，人感染后既可出現(xiàn)嚴(yán)重的侵襲性癥狀，也可處于無癥狀的帶蟲狀態(tài)。

檢測E.h原蟲常用的方法有直接涂片法和碘液染色法。但腸內(nèi)除了E.h外，還有非致病性的阿米巴——迪斯帕內(nèi)阿米巴(E.dispar,E.d)，其形態(tài)與E.h高度相似，鏡檢方法難以區(qū)分，且E.d的感染率是E.h的9倍[4-6]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，明確了E.h和E.d核酸序列的差別，通過PCR的方法可以將兩者區(qū)分開來，為阿米巴原蟲的生物鑒定提供了新的途徑[7-9]。本研究在形態(tài)學(xué)鑒定(直接涂片、碘液染色)的基礎(chǔ)上，擬建立一種快速、敏感的FTA-巢式PCR檢測用于鑒定致病性的E.h。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1腹瀉病人糞便樣本中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所健康教育咨詢檢測中心門診腹瀉病人新鮮糞便，一般取有黏液、血液部位進(jìn)行收集檢查。

1.1.2主要試劑0.9% 生理鹽水，2.5%碘液，E.h基因組DNA由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院程訓(xùn)佳教授惠贈。FTA卡和FTA卡純化試劑(英國Whatman公司)，TE Buffer(生工生物工程上海股份有限公司)，TaKaRa Ex Taq酶(寶生物工程大連有限公司)，DNA Marker(天根生化科技北京有限公司)，TBE Buffer(生工生物工程上海股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1光學(xué)顯微鏡檢查直接涂片法：加1-2滴生理鹽水于潔凈的載玻片中央，挑取腹瀉病人糞便標(biāo)本中的可疑部分，在生理鹽水中涂抹成糞便薄膜，厚度以透過糞便薄膜能看清字為宜，加蓋玻片后顯微鏡下觀察。

碘液染色法：用碘液代替生理鹽水，制片方法同直接涂片法，檢測是否存在阿米巴原蟲的包囊或滋養(yǎng)體。

1.2.2FTA卡提取DNA將鏡檢結(jié)果為陽性的腹瀉病人糞便分裝于1.5 mL離心管中，95 ℃水浴加熱5 min，冷卻至室溫后滴加于FTA卡上，室溫干燥。用打孔器從樣品卡上取直徑6 mm的小圓片，將其放入1.5 mL的離心管中，加入400 μL FTA卡純化試劑洗2次，每次浸泡5min。再用TE Buffer洗3次，每次浸泡5 min，將處理后的小圓片于室溫或56 ℃晾干。干燥后的FTA卡小圓片可保存于室溫。

1.2.3巢式PCR擴(kuò)增及分析根據(jù)E.h的SSU-rRNA序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物[10-11]，外引物分別為： E1(上游引物)5′-TGCTGTGATTAAAACGCT-3′，E2(下游引物)5′-TTAACTATTTCAATCTCGG-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 076 bp。E.h特異性的內(nèi)引物的序列分別為：Eh-L(上游引物)5′-ACATTTTGAAGACTTTATGTAAGTA-3′，Eh-R(下游引物)5′-CAGATCTAGAAACAATGCTTCTCT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為427 bp。引物均由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

第1輪PCR反應(yīng)以處理好的FTA卡小圓片剪碎作為模板，加入10×Buffer 10 μL，25 mmol/L的MgCl28 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)8 μL，10 μmol/L的引物(E1、E2)各4 μL，Ex TaqDNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足100 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，47 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

第2輪PCR反應(yīng)以第一輪PCR產(chǎn)物5 μL為模板，加入10×Buffer 5 μL，25 mmol/L的MgCl24 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，10 μmol/L的引物(Eh-L、Eh-R、Ed-L、ED-R)各1 μL，Ex TaqDNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。退火溫度為58 ℃，其余反應(yīng)條件與第一輪PCR相同。陽性對照模板采用E.h的基因組DNA，同時(shí)設(shè)立健康人對照、空白對照。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外光下觀察電泳條帶。選擇可擴(kuò)增出目的條帶的PCR產(chǎn)物送上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行目的條帶的純化并測定序列，通過序列比對以驗(yàn)證是否為目的片段。

2結(jié)果

2.1阿米巴原蟲的檢測根據(jù)直接涂片法和碘液染色法檢測的結(jié)果，挑選了44例鏡檢結(jié)果為阿米巴原蟲陽性的腹瀉病人糞便，圖1為碘液染色法觀察到的阿米巴原蟲包囊。

2.2FTA-巢式PCR擴(kuò)增用FTA法提取了44例鏡檢結(jié)果為阿米巴原蟲陽性的腹瀉病人DNA，以此DNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，部分電泳結(jié)果如圖2所示。其中20例樣本可擴(kuò)增出427 bp左右的目的條帶(圖3)，推測為E.h感染。鏡檢法與PCR法的陽性符合率為45.45%(20/44)。

A: 鏡檢陽性，PCR陰性；B: 鏡檢陽性，PCR陽性

A: Positive for microscopy, negative for PCR; B: Positive for microscopy, positive for PCR

圖1碘液染色法

Fig.1Iodine-stain smear

2.3PCR產(chǎn)物測序鑒定分別將測得的DNA片段序列與GenBank中的阿米巴原蟲序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示427 bp的DNA片段與溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(登錄號：AB608092.1)的SSU-rRNA具有高度同源性。根據(jù)得分(Score，676)、E值(E value，0.0)和同源性(Identity，99%)，表明本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物確實(shí)為E.h的片段。

3討論

寄生于人體消化道內(nèi)的阿米巴原蟲種類很多，除E.h之外還有迪斯帕內(nèi)阿米巴(E.d)、結(jié)腸內(nèi)阿米巴(Entamoebacoli)、哈門氏內(nèi)阿米巴(Entamoebahartmanni)、微小內(nèi)蜒阿米巴(Entamoebanana)、布氏嗜碘阿米巴(Iodamoebabutschlii)和齒齦內(nèi)阿米巴(Entamoebagingivalis)，但只有E.h具有致病性，在宿主免疫力低下時(shí)，可引起急性暴發(fā)型阿米巴腸病。E.h、E.d的滋養(yǎng)體直徑約12～60 μm，包含1個(gè)單核，包囊大小約10～20 μm，未成熟包囊有1～2個(gè)核，成熟包囊則有4個(gè)核，從形態(tài)上難以區(qū)分，E.hartmanni包囊通常為6～8 μm，但有時(shí)部分E.hartmanni包囊直徑會大于10 μm，如果嚴(yán)格根據(jù)形態(tài)進(jìn)行檢測，即使具有豐富的鏡檢經(jīng)驗(yàn)仍可能會將E.hartmanni誤認(rèn)為E.h或E.d，從而造成臨床上的誤診，導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；E1-E24：腹瀉病人糞樣；N1、N2：健康人糞樣；P：陽性對照；B：空白對照

M: DNA marker; E1-E24: Fecal samples of diarrheal patients; N1 and N2: Fecal samples of healthy people; P: Positive control; B: Blank control

圖2FTA-巢式PCR產(chǎn)物電泳分析

Fig.2Electrophoresis analysis of FTA-nested PCR products

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-20：陽性產(chǎn)物；P：陽性對照；B：空白對照

圖4　序列比對結(jié)果

PCR技術(shù)是近年來發(fā)展較快且準(zhǔn)確、敏感、特異、高效的診斷方法，在病原檢測和生物鑒定方面得到了廣泛應(yīng)用。核酸提取是PCR實(shí)驗(yàn)的首要步驟，常規(guī)的DNA制備方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，并且樣品中的雜質(zhì)和提取過程也可能影響檢測結(jié)果。FTA卡可通過簡單的一步法采集捕獲DNA，其他的裂解碎片以及PCR抑制因子等均被純化試劑和洗滌劑洗滌除去，可用于PCR、SNP、RT-PCR、RFLP 以及限制酶解作用的分析。此外，F(xiàn)TA卡攜帶方便，在室溫下可以長期保存，整個(gè)過程操作簡單、快速、安全，對樣品需求量少[12-13]。Nantarisai等[14]比較了商業(yè)化試劑盒(QIAamp stool mini kit)、FTA卡和酚-氯仿3種抽提糞便樣品中十二指腸賈第蟲DNA的方法，結(jié)果表明FTA法是一種高效的DNA提取方法，具有操作簡便、靈敏度高、可同時(shí)處理多個(gè)樣品且便于運(yùn)輸保存等優(yōu)點(diǎn)，F(xiàn)TA-PCR方法檢測糞便中的十二指腸賈第蟲與IFA方法檢測的敏感性和特異性無顯著差別。張小萍等[15]用FTA卡提取隱孢子卵囊DNA，檢測水源中的隱孢子蟲，陽性樣品均擴(kuò)增出約446 bp的特異性片段，表明FTA-PCR可用于水樣中隱孢子蟲污染的基因檢測。此外，F(xiàn)TA-PCR方法還可檢測糞便、水產(chǎn)品等不同來源樣品中的寄生蟲[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)直接將鏡檢陽性的糞便樣本95 ℃加熱破壞包囊壁，冷卻后點(diǎn)樣于FTA卡上，再通過簡單的后續(xù)處理即可獲取糞便中的DNA，并根據(jù)阿米巴原蟲的小亞基核糖體RNA(SSU-rRNA)序列設(shè)計(jì)引物，建立了FTA-巢式PCR方法以鑒定E.h。研究結(jié)果表明，鏡檢結(jié)果為阿米巴原蟲陽性的44份腹瀉病人樣品中有20份樣本可擴(kuò)增出目的條帶，經(jīng)BLAST序列比對均為E.h的rRNA片段。其余24份樣本經(jīng)過2次重復(fù)的FTA-巢式PCR驗(yàn)證，仍未擴(kuò)增出E.h的特異性條帶，推測為其他種類的阿米巴原蟲感染或非特異性腸炎。由于從形態(tài)上難以區(qū)分E.h、E.d等內(nèi)阿米巴原蟲，且阿米巴腸病與非特異性潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、慢性腸炎和細(xì)菌性痢疾臨床癥狀相似，尤其伴黏液血便、果醬樣便的患者，鏡檢可能將白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等與阿米巴原蟲相混淆，出現(xiàn)誤診，擴(kuò)大了E.h的感染率。Rodulfo H等[18]發(fā)現(xiàn)150例鏡檢為溶組織內(nèi)阿米巴陽性的糞便樣品中，經(jīng)巢式PCR驗(yàn)證僅14%為E.h陽性。Nqui R等[19]共檢測了426例糞便樣品，鏡檢發(fā)現(xiàn)75例為阿米巴陽性，巢式PCR結(jié)果顯示鏡檢陽性的糞樣中39例(39/75)為E.h陽性。上述研究均表明，僅用鏡檢方法進(jìn)行E.h的檢測會存在不同程度的過度診斷。本研究的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，鏡檢陽性的44例糞樣中有20例經(jīng)PCR驗(yàn)證為E.h陽性，鏡檢與FTA-巢式PCR的陽性符合率為45.45%(20/44)，與已有的報(bào)道[20]相一致，表明該方法與普通巢式PCR的敏感性相同，可以將E.h與其他阿米巴原蟲進(jìn)行鑒別和區(qū)分。

本研究建立的FTA-巢式PCR方法具有簡單、快速、可靠等優(yōu)點(diǎn)，可以特異性地區(qū)分形態(tài)學(xué)上非常相似的E.h與其它消化道內(nèi)阿米巴原蟲，并可鑒別診斷阿米巴腸病與非特異性腸炎、細(xì)菌性痢疾等疾病，可作為鑒定致病性溶組織內(nèi)阿米巴(E.h)感染的輔助診斷方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]World Health Organization. World Health Organization/Pan American Health Organization/UNESCO report of a consultation of experts on amoebiasis[J]. Wkly Epidemiol Rec, 1997, 72: 97-99.

[2]Tanyuksel M,Petri WA Jr. Laboratory diagnosis of amebiasis[J]. Clin Microbiol Rev, 2003, 16(4): 713-729.

[3]WHO/PAHO/UNESCO report. A consultation with experts on amoebiasis. Mexico City, Mexico 28-29 January, 1997[J]. Epidemiol Bull, 1997, 18(1): 13-14.

[4]Sargeaunt PG.EntamoebahistolyticaandE.dispar[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1994, 8(2): 254-255.

[5]Ali IK, Clark CG, Petri WA Jr. Molecular epidemiology of amebiasis[J]. Infect Genet Evol, 2008, 8(5): 698-707.

[6]Delialioglu N, Aslan G, Ozturk C, et al. Detection ofEntamoebahistolyticaantigen in stool samples in Mersin, Turkey[J]. J Parasitol, 2008, 94(2): 530-532.

[7]Zaki M, Meelu P, Sun W, et al. Simultaneous differentiation and typing ofEntamoebahistolyticaandEntamoebadispar[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(4): 1271-1276.

[8]Haque R, Petri WA Jr. Diagnosis of amebiasis in Bangladesh[J]. Arch Med Res, 2006, 37(2): 273-276.

[9]Hamzah Z, Petmitr S, Mungthin M, et al. Differential detection ofEntamoebahistolytica,Entamoebadispar, andEntamoebamoshkovskiiby a single-round PCR assay[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(9): 3196-3200.

[10]Evangelopoulos A, Spanakos G, Patsoula E, et al. A nested, multiplex, PCR assay for the simultaneous detection and differentiation ofEntamoebahistolytica andEntamoebadisparin faeces[J]. Ann Trop Med Parasitol, 2000, 94(3): 233-240.

[11]Santos FL, Gon alves Mde S, Soares NM. Validation and utilization of PCR for differential diagnosis and prevalence determination ofEntamoebahistolytica/Entamoebadisparin Salvador City, Brazil[J]. Braz J Infect Dis, 2011, 15(2): 119-125.

[12]Stangegaard M, Borsting C, Ferrero-Miliani L, et al. Evaluation of four automated protocols for extraction of DNA from FTA cards[J]. J Lab Autom, 2013, 18(5): 404-410.

[13]Kato H, Caceres AG, Mimori T, et al. Use of FTA cards for direct sampling of patients’ lesions in the ecological study of cutaneous leishmaniasis[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(10): 3661-3665.

[14]Nantavisai K, Mungthin M, Tan-ariya P, et al. Evaluation of the sensitivities of DNA extraction and PCR methods for detection of Giardia duodenalis in stool specimens[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(2): 581-583.

[15]Zhang XP, Zhu Q, He YY, et al. Detection ofCryptospordiumspp. in environmental water samples by FTA-PCR[J]. Chin J Schisto Ctrl, 2011, 23(1): 71-73. (in Chinese)

張小萍, 朱倩, 何艷燕, 等. FTA-PCR檢測水源性隱孢子蟲研究 [J].中國血吸蟲病防治雜志, 2011, 23(1):71-73.

[16]Tian LG, Zhang XP, Chen SH, et al. Detection ofCryptosporidiumspp. In human stool samples with FTA-PCR[J]. Int J Med Parasit Dis, 2011, 38(4): 211-214. (in Chinese)

田利光, 張小萍, 陳韶紅, 等. 應(yīng)用FTA/PCR檢測糞便中隱孢子蟲的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志, 2011, 38(4):211-214.

[17]Chen SH, Zhang YN, Li SQ, et al. Preliminary study on detection of metacercariae in aquatic products by FTA[J]. Chin J Zoonoses, 2010, 26(10): 931-934. (in Chinese)

陳韶紅, 張永年, 李樹清, 等. 應(yīng)用FTA法檢測水產(chǎn)品中吸蟲囊蚴的初步研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2010, 26(10):931-934.

[18]Rodulfo H, Ahmar B, Rodriguez ME, et al. Nested PCR reveals elevated over-diagnosis ofE.histolyticain Barcelona, Venezuela[J]. Invest Clin, 2012, 53(4): 365-377.

[19]Ngui R, Angal L, Fakhrurrazi SA, et al. DifferentiatingEntamoebahistolytica,EntamoebadisparandEntamoebamoshkovskiiusing nested polymerase chain reaction (PCR) in rural communities in Malaysia[J]. Parasit Vectors, 2012, 5: 187.

[20]Liu H, Sun XD, Nie RH, et al. Comparison of the three methods used in detection of amoebiasis in feces[J]. Chin J Pathogen Biol, 2008, 3(9): 679-680, 689. (in Chinese)

劉慧, 孫曉東, 聶仁華, 等. 3種方法檢測糞便中溶組織內(nèi)阿米巴的結(jié)果比較[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2008, 3(9):679-680, 689.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.006

通訊作者：陳韶紅，Email: chensh637@163.com

Corresponding author:Chen Shao-hong, Email: chensh637@163.com

中圖分類號：R382

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)02-0128-05

收稿日期：2015-01-23；修回日期:2015-06-12

Identification of Entamoeba histolytica by FTA-nested PCR

LU Yan,CHEN Jia-xu,ZHANG Yong-nian,LI Hao,CHU Yan-hong,AI Lin,CAI Yu-chun,CHEN Shao-hong

(National Institute of Parasitic Diseases, Chinese Center for Disease Control and Prevention; Key Laboratory of ParasiteandVectorBiology,MOH;WHOCollaboratingCenterofMalaria,SchistosomiasisandFilariasis,Shanghai200025,China)

Abstract:To establish a simple and rapid FTA-nested PCR method for identification of the Entamoeba histolytica (E.h), the fecal samples of diarrheal patients were collected. The samples were examined with a microscope firstly, and 44 positive samples were selected. The genomic DNA of Entamoeba in positive samples was extracted by FTA filters. Primers were designed based on the SSU rRNA fragment of E.h and the plate DNA was amplified by nested PCR. All PCR products were detected by agarose gel electrophoresis, and then the target fragments were sequenced and analyzed by BLAST. The 427 bp fragment of DNA was detected from 20 fecal samples. Sequence analysis of 20 target fragments amplified by nested PCR showed that they were E.h. The consistent rate of microscopic examination and nested PCR was 45.45% (20/44). This nested PCR could identify and differentiate the pathogenic E.h from the non- pathogenic Entamoeba species which were morphologically identical (similar). It suggested that FTA-nested PCR is a simple, rapid and reliable technique for identifying E.h in human stool samples, and provided a new technical method for differential diagnosis of E.h in clinical examination and epidemiological survey.

Keywords:Entamoeba histolytica; FTA; nested PCR; identification

衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)(No. 201202019)和國家科技重大專項(xiàng)(No. 2012ZX10004-220)聯(lián)合資助

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