甜葉菊三倍體培育及其農(nóng)藝性狀分析

程曉紊，朱　平，崔廣榮

(安徽科技學院　農(nóng)學院，安徽　鳳陽　233100)

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甜葉菊三倍體培育及其農(nóng)藝性狀分析

程曉紊，朱平，崔廣榮*

(安徽科技學院農(nóng)學院，安徽鳳陽233100)

摘要：目的與方法：利用人工誘導(dǎo)獲的四倍體植株與二倍體植株進行雜交獲得三倍體甜葉菊植株，并對其農(nóng)藝性狀進行比較分析。結(jié)果：氣孔、染色體等細胞學鑒定結(jié)果表明，甜葉菊三倍體氣孔大小介于二倍體與四倍體之間，染色體數(shù)為33(2n=33)，甜葉菊三倍體培育獲得成功。田間農(nóng)藝性狀考察及糖苷測定結(jié)果顯示，植株高度及葉產(chǎn)量與二倍體相近但高于四倍體；三倍體甜葉菊植株在葉片厚度、葉片長度、葉片寬度均大于二倍體而與四倍體接近；糖苷含量及糖苷成分與二倍體及四倍體也存在一定的差異。結(jié)論：三倍體甜葉菊在農(nóng)藝性狀及糖苷含量上具有自身特點，在生產(chǎn)上具有重要的潛在價值。

關(guān)鍵詞：甜葉菊；三倍體培育；農(nóng)藝性狀

甜葉菊(SteviarebaudianaBertoni )為菊科多年生草本植物，原產(chǎn)地為南美巴拉圭東北部地區(qū)，甜葉菊在世界范圍內(nèi)廣為種植。甜葉菊是一種新型的天然甜味劑，葉片中的糖苷甜度是蔗糖的300倍，具有低熱量，安全無毒，甜味適口的特點，還有一定的藥理作用。許多研究表明甜葉菊糖苷具有降血糖、抗菌功效[1-2]，并且對患有肥胖癥、心臟病、齲齒等都有很好的療效[3-6]。隨著甜菊糖苷在食品、飲料和醫(yī)藥行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，甜葉菊越來越受到人們的歡迎和信賴。

甜葉菊為異花授粉植物，其品種有無性品種和有性品種之分。培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)無性品種是甜葉菊有性品種的重要補充，同時也能確保其種苗遺傳上的一致性[7]。多倍體植株在生物學特性上具有形態(tài)上的巨大性、細胞內(nèi)次生代謝物含量高等特性。國外開展甜葉菊多倍體育種研究較早，Valois[8]利用秋水仙素溶液浸泡種子成功獲取甜葉菊多倍體植株，Shuichi等[9]以四倍體植株為母本，二倍體植株為父本，成功獲取了部分有價值的三倍體植株[9-10]。近些年來，國內(nèi)有關(guān)研究工作者也開展了一些甜葉菊多倍體培育的研究探索工作，利用秋水仙素進行甜葉菊離體化學誘變，獲取了大量的甜葉菊四倍體植株[11-12]，而且對多倍體離體誘變技術(shù)體系進行了技術(shù)改進，提高了四倍體誘導(dǎo)效率[13]。但經(jīng)田間種植比較研究發(fā)現(xiàn)誘變獲取的當代甜葉菊四倍體植株表現(xiàn)并不如意，四倍體雖表現(xiàn)出葉片肥大、厚實，但植株相對矮小(尤其是植株生長前期)，生物學產(chǎn)量相對較低[13]，國內(nèi)有關(guān)三倍體培育的研究尚未見報道。基于甜葉菊四倍體田間生物學性狀表現(xiàn)不足及其三倍體展現(xiàn)的育種價值[9],本研究在前期成功培育甜葉菊四倍體基礎(chǔ)上，利用四倍體植株與二倍體植株雜交，培育三倍體甜葉菊植株，通過農(nóng)藝性狀篩選獲得三倍體優(yōu)良品系植株，旨在培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)甜葉菊無性品種，也為進一步開展甜葉菊多倍體相關(guān)遺傳學基礎(chǔ)、糖苷合成變化的生理機制研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料二倍體甜葉菊是由安徽省蚌埠永生農(nóng)業(yè)科技有限公司提供的甜葉菊二倍體株系，人工誘變的四倍體、四倍體與二倍體單株雜交后代植株。

1.2方法

1.2.1四倍體與二倍體雜交分別取四倍體植株、二倍體植株各20株，間行栽培，形成隔離雜交小區(qū)，分別從二倍體與四倍體植株上收獲種子備用。隨機抽取四倍體與二倍體雜交后代100個植株進行細胞學鑒定，其中來自于四倍體上和二倍體上所結(jié)種子長成的植株各為50株。

1.2.2氣孔鑒定甜葉菊植株移栽生長2月后，于上午9～10點取成熟葉片，擦去葉片表面的污垢，并防止葉表水分蒸發(fā)，使氣孔充分張開。用刀片輕輕割下葉片下表皮，再用鑷子取下，用水制成臨時的封片，放在顯微鏡下進行觀察并拍攝照片。

1.2.3根尖染色體鑒定參照王波、崔廣榮等方法[11]。

1.2.4農(nóng)藝性狀的考察在開花前一周內(nèi)，每個品種分別采用小區(qū)取樣法，在每個小區(qū)隨機抽取5株具有代表性的、長勢中等的植株，分別考察不同倍性甜葉菊的株高、葉長、葉寬、葉厚、莖粗、節(jié)長等主要農(nóng)藝性狀，數(shù)據(jù)取平均值。

1.2.5甜葉菊糖苷含量的測定參照朱吟吟、周凌方法[14]，由安徽蚌埠永生農(nóng)業(yè)科技有限公司完成。

1.2.6數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理采用DPS軟件、EXCEL軟件等進行處理、分析。

2結(jié)果與分析

2.1三倍體細胞學鑒定

2.1.1氣孔觀察及其與四倍體植株、二倍體植株比較二倍體、三倍體及四倍體植株氣孔鏡檢結(jié)果如圖1～3所示，其大小存在明顯差異，四倍體及四倍體與二倍體雜交后代植株葉片的氣孔大小差異尤為明顯，氣孔的數(shù)量也較二倍體植株少很多，四倍體葉片的氣孔大小較來自四倍體與二倍體雜交后代植株葉片氣孔大，但在氣孔數(shù)量上差異并不明顯。在多倍體育種中，根據(jù)氣孔大小來進行鑒定倍性是一種常用的辦法，氣孔的變化可以作為鑒定多倍體的一個重要指標，由此可以初步判定來自二倍體與四倍體雜交種子長成的植株是否為三倍體。

圖1二倍體氣孔大小(5×10)

Fig.1. The size of stomata of diploid(5×10);

圖2三倍體氣孔大小(5×10)

Fig.2. The size of stomata of triploid(5×10);

圖3四倍體氣孔大小(5×10)

Fig.3. The size of stomata of tetraloid(5×10)

2.1.2根尖染色體數(shù)目觀察已知二倍體甜葉菊的染色體數(shù)目為2n=2x=22[11]，由圖5可見，由四倍體與二倍體雜交獲得了三倍體植株，其染色體數(shù)介于二倍體與四倍體之間，可較為清晰地數(shù)出染色體數(shù)為33條。

圖4二倍體染色體(10×40)

Fig.4The chromosome of diploid(10×40) (2n=2x=22)

圖5三倍體倍體染色體(10×40)

Fig.5 The chromosome of triploid (10×40) (2n=2x=33)

圖6四倍體染色體(10×40)

Fig.6The chromosome of tetraloid (10×40)(2n=2x=44)

2.1.3四倍體和二倍體雜交不同來源種子植株的三倍體狀況比較從四倍體與二倍體雜交后收獲種子的情況看，四倍體上收獲的可育種子數(shù)量大大少于來自二倍體上所結(jié)的種子，從數(shù)量上看僅為二倍體上的1/5左右，四倍體表現(xiàn)出明顯的育性差的特點。不僅如此，經(jīng)細胞學鑒定發(fā)現(xiàn)，來自于四倍體與二倍體雜交種子后代植株的三倍體數(shù)目及其比例差異也較為明顯，來自于四倍體植株(雜交母株)的種子長成的雜交后代植株全為三倍體，而來自于二倍體植株(雜交母株)種子長成的雜交后代植株中的三倍體50株材料僅檢出4株，其比例還不到10%(見表1)。

表1　四倍體與二倍體來源種子重量及其三倍體數(shù)量比較

上述結(jié)果表明，甜葉菊二倍體經(jīng)染色體加倍后，四倍體的育性較差，尤其是花粉的育性較差(相關(guān)研究結(jié)果另文發(fā)表)，也就是說四倍體植株上所結(jié)種子的花粉全部來源于二倍體，而二倍體植株上所結(jié)種子的花粉主要來自二倍體，極少數(shù)來自于四倍體。眾所周知，純合二倍體植物的四倍體幾乎是不育或育性很低，由于甜葉菊是異花授粉植株，人們常常通過優(yōu)良單株選擇、擴大優(yōu)良單株群體而實現(xiàn)雜交培育新品種，本試驗所用的二倍體新品種材料正是這種類型的材料，因此，其四倍體尚表現(xiàn)出一定的育性。

2.2不同倍性植株農(nóng)藝性狀比較

表2　不同倍性甜葉菊植株農(nóng)藝性狀比較

注：同列不同小寫字母表示5%差異顯著水平(表3同)。Note：Small letters show significant difference atP<0.05 levels.

表2結(jié)果顯示，三倍體與四倍體、二倍體間在農(nóng)藝性狀表現(xiàn)上存在一定的差異。甜葉菊植株隨著染色體倍性的增加，其株高減小，但莖粗、葉長、葉寬、葉厚度、節(jié)間距卻增加，二倍體與三、四倍體之間差異顯著，不過三倍體與四倍體之間除了葉間距外，其它農(nóng)藝性狀差異并不顯著，這在一定程度上提高了三倍體的生物學產(chǎn)量，表現(xiàn)出一定的育種目標潛能。此外，葉片的顏色也隨著倍性的變化也發(fā)生了一定的變化，二倍體植株葉片淡綠，三倍體、四倍體植株葉片呈濃綠，見圖8～9。

圖7二倍體植株

Fig.7The plant of diploid;

圖8三倍體植株

Fig.8The plant of triploid;

圖9四倍體植株

Fig.9The plant of tetraloid

2.3不同倍性甜葉菊植株葉片糖苷含量比較及分析

表3　甜葉葉片糖苷含量比較

表3結(jié)果表明，不同倍性甜葉菊在糖苷含量及品質(zhì)上存在明顯的差異，與二倍體相比，除RA/(RA+ST)指標外，三倍體與四倍體的各項指標均表現(xiàn)出顯著差異。綜合來看，各種成分糖苷含量隨倍性增加而增加，表現(xiàn)出多倍體的基本特征，即內(nèi)含物合成量增加，體現(xiàn)出倍性育種的潛在價值。根據(jù)前人的研究結(jié)果，RA苷的味質(zhì)是最接近蔗糖，甜度也最高的，而其他糖苷的味質(zhì)都有后苦味或者強苦味，若產(chǎn)品中RA苷的含量高，產(chǎn)品的味質(zhì)就會比含其他糖苷高的更好，甜味更純正[9]。結(jié)合表2結(jié)果數(shù)據(jù)看，盡管三倍體RA含量沒有四倍體含量高，但其生物學產(chǎn)量遠高于四倍體，單位種植面積的糖苷收獲量依然超出四倍體，通過大量的雜交選育，最終獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的三倍體無性品種潛力巨大。

2.4甜葉菊主要性狀間的相關(guān)性分析

對甜葉菊的主要數(shù)量性狀間的相關(guān)系數(shù)測定結(jié)果如下表4。甜葉菊的各個農(nóng)藝性狀中，莖粗與葉長、葉寬、葉厚和節(jié)長均呈負相關(guān)關(guān)系，其中，莖粗與葉長、葉寬負相關(guān)顯著；株高與莖粗呈正相關(guān)關(guān)系，但未達到顯著水平；葉長、葉寬和葉厚呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別高達0.679和0.897。

對于甜葉菊的品質(zhì)指標，RA苷與莖粗、株高呈負相關(guān)，但遠遠沒有達到顯著水平，說明這兩個農(nóng)藝性狀對RA苷的含量影響不大；與葉長、葉寬、葉厚和節(jié)長呈正相關(guān)關(guān)系，其中，與節(jié)長的相關(guān)系數(shù)高達0.664，達到顯著水平。ST苷、總苷和RA/ST與各農(nóng)藝性狀間相關(guān)均不顯著。ST與RA苷雖然呈負相關(guān)關(guān)系，但未達到顯著水平，說明兩者含量雖有此消彼長的趨勢，但并不顯著，這一點與楊文婷等[15]的研究結(jié)果是一致。

表4　甜葉菊主要數(shù)量性狀的相關(guān)系數(shù)

3結(jié)論與討論

通過四倍體與二倍體雜交，成功地培育出三倍體甜葉菊植株。細胞學鑒定表明，三倍體細胞染色體數(shù)為33條(2n=33),與二倍體相比，植株氣孔大、莖桿粗壯、葉片大而厚實且呈深綠色，在許多農(nóng)藝性狀上與四倍體相似，但其生物學產(chǎn)量(單株葉片干重)卻遠高于四倍體，這與二倍體相近。

三倍體在糖苷含量及糖苷成分上介于二倍體與四倍體之間。四倍體與二倍體雜交后代中，來自四倍體母本的種子植株均為三倍體，而來自二倍體母本的種子植株近8%為三倍體，同時四倍體母本植株收獲的種子量較二倍體母本植株收獲的種子量要少很多，表明四倍體育性較差，特別是花粉的育性，因此，培育三倍體無性品種以二倍體為父本、四倍體為母本較為合適。三倍體植株優(yōu)良的農(nóng)藝性狀展現(xiàn)了其重要的潛在育種價值。

農(nóng)藝性狀中節(jié)長、葉片對糖苷RA的影響達到顯著水平，其他性狀雖然均有影響，但未達到顯著水平，而ST與各農(nóng)藝性狀的相關(guān)性均不顯著，說明在高RA品種的選育上節(jié)長、葉片可以作為一個重要指標。

由于多倍體植株普遍具有植株形態(tài)巨大、葉片厚實、葉片數(shù)多、抗性強、細胞內(nèi)次生代謝物含量更加豐富等特點，因此在植物育種上占有重要的地位，很多植物的多倍體育種成果已經(jīng)在生產(chǎn)上得到了廣泛的應(yīng)用，如四倍體甜菜、八倍體小黑麥等生產(chǎn)實例已廣為人知。但甜葉菊的四倍體植株在田間的生長表現(xiàn)卻不理想，盡管其葉片、莖干、花等方面表現(xiàn)出多倍體的巨大性特點，但前期苗生長緩慢、植株相對矮小、葉數(shù)量較少，后期雖然在植株高度上與原二倍體差異縮小，但生物學產(chǎn)量(干葉產(chǎn)量)卻較低，無法達到生產(chǎn)應(yīng)用價值[11,13]。Shuichi等[9]的研究結(jié)果給甜葉菊多倍體育種帶來了希望，也指明了甜葉菊倍性育種的方向。他們以二倍體為父本、四倍體為母本，不僅成功獲取了42株三倍體植株，這些植株葉片、花、氣孔等均較二倍體植株大，而且從中篩選出7株高RA(rebaudioside-A)糖苷含量的三倍體植株[9]，RA糖苷是甜菊糖的主要成分，甜度很高且口感最接近蔗糖。本試驗研究雖然未能篩選出高糖苷含量的三倍體植株，但所獲三倍體已經(jīng)在農(nóng)藝性狀方面繼承了部分二倍體和四倍體各自的優(yōu)良性狀，相信隨著四倍體親本基因型種類的不斷豐富及雜交后代群體的擴大，定會篩選出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的三倍體無性新品種。

在甜葉菊傳統(tǒng)育種方法上，通常是篩選出優(yōu)良的單株親本進行繁殖、雜交、篩選，從而獲得優(yōu)良的雜交新品種。由于甜葉菊為嚴格的異花授粉植物，自花授粉不結(jié)實，親本自身從基因型上看也是雜合的，因而雜交后代新品種不同個體間的基因型實際上不可能是一致的，只是雜交后代所形成的新品種群體表現(xiàn)上優(yōu)良而已——群體改良。因此，通過秋水仙素誘變所得到的四倍體實質(zhì)上只能是異源多倍體或部分同源多倍體，四倍體尚有部分育性，但育性較差[8-9]，本試驗結(jié)果也驗證了這一結(jié)論。甜葉菊四倍體、三倍體細胞遺傳特征及其對農(nóng)藝性狀表達的影響和對糖苷合成控制機理等問題尚有待于進一步深入研究。

甜葉菊的糖苷品質(zhì)是由多個農(nóng)藝性狀因素共同決定的，明確各種農(nóng)藝性狀對營養(yǎng)品質(zhì)的主次關(guān)系，對選育優(yōu)良的甜葉菊品種具有重要的意義，同時也為甜葉菊的育種提供重要的依據(jù)。本研究測定了的不同倍性甜葉菊糖苷含量，并將初步判斷的優(yōu)良二倍體品種與其多倍體一起進行主要數(shù)量性狀間的相關(guān)系數(shù)的測定，結(jié)果顯示了農(nóng)藝性狀中只有節(jié)長、葉片對糖苷RA的影響達到顯著水平，其他性狀雖然均有影響，但未達到顯著水平，而ST與各農(nóng)藝性狀的相關(guān)性均不顯著，說明在高RA品種的選育上節(jié)長、葉片可以作為一個重要指標。

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(責任編輯：李孟良)

收稿日期：2016-02-18

基金項目：校企橫向合作項目“甜葉菊新品種‘惠農(nóng)一號’的繁育與推廣”。

作者簡介：程曉紊(1992-)，女，安徽省渦陽縣人，在讀碩士研究生，主要從事甜葉菊生物技術(shù)及育種應(yīng)用研究；*通讀作者：崔廣榮，教授，E-mail:cuigr64@sina.com。

中圖分類號：S566.9

文獻標識碼：A

文章編號：1673-8772(2016)03-0025-06

SteviaTriploid Breeding and Agronomic Traits Analysis

CHENG Xiao-wen, ZHU Ping, CUI Guang-rong*

(College of Agronomy，Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Abstract：Objective and mothods:The triploid plants of stevia were produced by mating diploid and tetraploid parents which were induced with colchicine treatments. And the agronomic traits of the triploid were compared with the diploid and tetraploid. Results: the results of cell identification showed that the size of the stomata of the triploid was between the diploid and the tetraploid, and the chromosome number of root tip cell was 33(2n=33). The stevia triploid breeding got success. The studies of agronomic traits and determining of glycoside contents indicated that the plant height and the quantity of leaf were similar to the diploid but higher than the tetraploid. The size and thickness of leaf were bigger than the diploid plant, but smaller the the tetraploid. Meanwhile, there were some differences in the contents and the quantity of glycoside in the triploid compared with their parents. Conclusion: the triploid characters of agronomic traits and glycoside contents showed its potential impotent value in production.

Key words:Stevia rebaudiana Bertoni; Triploid breeding; Agronomic traits