出芽短梗霉PA—2產(chǎn)除草活性物質(zhì)的初步分離

摘要：將出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）PA-2進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵液用等體積正丁醇萃取3次，正丁醇萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去溶劑后進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷和甲醇的混合液進(jìn)行梯度洗脫，每50 mL收集為1個餾分，共收集到50個餾分。生物測定結(jié)果表明，以二氯甲烷和甲醇（體積比20 ∶ 1）洗脫得到的餾分15～23對供試雜草野燕麥表現(xiàn)出了較強(qiáng)的活性，對野燕麥的除草抑制作用均為4級。合并餾分15～23，以二氯甲烷和甲醇（體積比15 ∶ 1）的混合液為展開劑進(jìn)行薄層層析，生物測定結(jié)果表明，Rf值范圍在0.19～0.83的活性條帶對野燕麥有不同程度的抑制活性。HPLC分析PA1條帶發(fā)現(xiàn)，該活性條帶主要含有2個組分，最大吸收峰在220 nm，其保留時間分別為59.015、65.948 min。

關(guān)鍵詞：出芽短梗霉；代謝產(chǎn)物；除草活性；分離純化；柱層析；薄層層析

中圖分類號：S482.4+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2016）06-0199-03

收稿日期：2015-04-27

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31160371、30860165）；國家科技支撐計劃（編號：2012BAD19B02）。

作者簡介：程亮（1978—），男，河南林州人，碩士，副研究員，主要從事雜草生物防治方面的研究。Tel：（0971） 5313283；E-mail：liangcheng1979@163.com?；瘜W(xué)除草劑從應(yīng)用至今已有70多年的歷史，在提高農(nóng)作物產(chǎn)量方面起到不可低估的作用。但從20世紀(jì)70年代中期以來，抗藥性雜草種類一直呈上升趨勢[1-2]。同時，隨著環(huán)境保護(hù)呼聲的日益提高，高毒性農(nóng)藥的大量使用對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境造成的負(fù)面影響已引起世界范圍的廣泛關(guān)注。為了保護(hù)人類生存的環(huán)境和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，除草劑的研制與使用將嚴(yán)格受到環(huán)境和生態(tài)的制約[3]。微生物除草劑因其對目標(biāo)雜草選擇性強(qiáng)、環(huán)境負(fù)荷小和安全性高等優(yōu)勢而成為近年來雜草生物防治研究中一個較活躍的領(lǐng)域。

近年來，以微生物天然產(chǎn)物開發(fā)生物源除草劑或新穎除草劑的先導(dǎo)化合物引起了雜草科學(xué)家和農(nóng)藥化家學(xué)的極大興趣。利用微生物天然產(chǎn)物開發(fā)除草劑，即將細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的、具有抑制某些雜草生物活性的次級代謝產(chǎn)物，加工成可以直接使用的形態(tài)。

農(nóng)藥工業(yè)發(fā)掘具有除草活性微生物產(chǎn)生的毒素的努力主要集中在非病原土壤微生物和腐生微生物上，而不是植物病原菌。從微生物天然產(chǎn)物分離得到的植物毒素在貯藏、應(yīng)用、制劑的相容性和半衰期方面都比活體微生物具有優(yōu)越性，施用分離出來的毒素不會使非靶標(biāo)植物染病，其藥效通常不依賴環(huán)境因素，便于預(yù)測。毒素在分子大小、化學(xué)種類（肽類、萜類、二酮吡嗪、大環(huán)內(nèi)酯、酚類）和寄主專一性（病原菌從完全專一寄生到非專一寄生）上差別很大[4]。

出芽短梗霉（Aureobacidium pullulans）別稱出芽茁酶、芽生側(cè)茁酶、黑酵母及短梗霉等，是一類類酵母真菌，具有酵母樣和真菌菌絲體2種形態(tài)，據(jù)其生理特征和孢子產(chǎn)生的特征等將之歸屬于半知菌門（Deuteromycophyta ）叢梗孢目（Moniliates）短梗霉菌屬（Aureodacidium）。出芽短梗霉可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如胞外多糖、酶、抗菌素、黑色素及單細(xì)胞蛋白等，是一種很有開發(fā)價值和應(yīng)用前景的多功能新型生物制品[5-13]。Prashanthi等從香澤蘭花序上分離到出芽短梗霉，該菌株代謝產(chǎn)物能引起香澤蘭花序烏霉癥狀、花蕾早凋謝和抑制種子萌發(fā)[14]。李永龍等從楊樹葉片上分離純化的出芽短梗霉PA-2菌株代謝物對一些雜草具有除草活性[15]。

本試驗以PA-2菌株為研究對象，利用樹脂柱層析、薄層層析及液相色譜等方法對該菌株除草活性組分進(jìn)行初步分離和純化，為深入研究除草活性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)奠定一定的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株

出芽短梗霉PA-2菌株。

1.2雜草

野燕麥（Avena fatua L.）。

1.3培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基（10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖和1 000 mL水）用于PA-2菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4試劑

正丁醇（分析純），天津市百世化工有限公司生產(chǎn)；甲醇（分析純），天津市北辰方正試劑廠生產(chǎn)；二氯甲烷（分析純），上海廣諾化學(xué)科技有限公司生產(chǎn)；柱層析硅膠（300～400目），山東煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司生產(chǎn)；硅膠制備板（20 mm×20 mm），山東煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司生產(chǎn)；甲醇（色譜純），德國默克公司生產(chǎn)。

1.5儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100，埃朗科技國際貿(mào)易（上海）有限公司生產(chǎn)；真空泵SHZ-DⅢ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；高效液相色譜儀，天津博納艾杰爾科技有限公司生產(chǎn)。

1.6除草活性物質(zhì)的分離純化

將培養(yǎng)好的斜面種子接種于已消毒的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)144 h，得到發(fā)酵液30 L。將發(fā)酵液于 5 000 r/min 離心20 min，將沉淀部分用10 L 80%丙酮浸泡過夜。冷凍離心去除沉淀，將上清液減壓旋轉(zhuǎn)濃縮去除丙酮，然后與發(fā)酵液合并。用等體積正丁醇萃取3次，合并正丁醇相濃縮至干，再用甲醇浸取2遍，過濾除去甲醇不溶物，真空濃縮除去甲醇，獲得粗品。

粗品經(jīng)硅膠柱層析分離，以二氯甲烷/甲醇不同的比例作洗脫液，分別為25 ∶ 1（1 500 mL）、15 ∶ 1（800 mL）、3 ∶ 1（500 mL）的流動相進(jìn)行洗脫，分部收集，根據(jù)生物活性跟蹤結(jié)果，將活性部分濃縮，得到淡黃色固體。用少量甲醇溶解，進(jìn)行TLC分離制備，展開液配比為二氯甲烷 ∶ 甲醇=15 ∶ 1，記錄除草活性物質(zhì)條帶Rf值，將具有除草活性最高的條帶刮下，用無水甲醇浸泡過夜，過濾，濾液減壓濃縮至10 mL左右，再用制備型HPLC進(jìn)一步分離純化（制備柱型號：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ，20 mm I.D.×250 mm，日本半井公司，流動相為甲醇 ∶ 水=5 ∶ 95，流速16 mL/min，檢測波長220 nm）。整個分離純化過程以除草活性為生物活性跟蹤。

1.7生物活性測定

硅膠柱層析分離所得餾分生物活性測定采用種子萌發(fā)抑制法：首先，1%次氯酸鈉對野燕麥種子消毒3 min，然后用無菌水沖洗3次，室內(nèi)晾干備用。在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中放入同皿底大小的雙層濾紙，滅菌后備用。在每皿中加入1 mL毒素稀釋液（為減少溶劑對種子萌發(fā)的影響，取粗毒素處理液 0.5 mL 均勻滴加到濾紙上，待濾紙完全干后再均勻滴加 0.5 mL 滅菌水），在上述處理的培養(yǎng)皿中均勻擺放20粒雜草種子，置于12 h光照/12 h黑暗、25 ℃條件下培養(yǎng)，并以滅菌水作對照，每個處理重復(fù)4次，3 d 后檢測種子萌發(fā)情況。

種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)以種子發(fā)芽長度超過種子長度計，按下列公式計算種子萌發(fā)抑制率。

種子萌發(fā)抑制率=（對照組種子萌發(fā)率-處理組種子萌發(fā)率）/對照組種子萌發(fā)率×100%。

除草抑制作用分級標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

2結(jié)果與分析

2.1粗毒素的柱層析和薄層層析

將除草活性物質(zhì)粗提物進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷和甲醇（體積比25 ∶ 1、15 ∶ 1、3 ∶ 1）的混合液對其進(jìn)行梯度洗脫，每50 mL收集為1個餾分，共收集到了104個餾分。將所收集到的餾分分別用甲醇稀釋，利用種子萌發(fā)抑制法對野燕麥進(jìn)行除草活性測定，結(jié)果表明柱層析后所得到的餾分都對野燕麥表現(xiàn)出不同程度的活性，其中餾分15～23對野燕麥的抑制作用達(dá)到了4級，其余餾分活性較弱，如餾分31、餾分32對野燕麥的抑制作用為3級，餾分4、餾分5等對野燕麥的抑制作用為2級，餾分1、餾分2等對野燕麥的抑制作用為1級。

15～23餾分合并濃縮，進(jìn)行薄板層析（圖1），在展開劑二氯甲烷 ∶ 甲醇為20 ∶ 1時，可以分離出大致5個條帶，其Rf分別為0.83、0.50、0.40、0.29、0.19，依次標(biāo)記為 PA1、PA2、PA3、PA4、PA5，分別將其刮下回收，用甲醇溶解，除去硅膠粉，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，甲醇定容后，分別取等量的各回收樣品對野燕麥進(jìn)行生物活性測定。

生物測定結(jié)果表明，PA-2所分離出的5個條帶對野燕麥都具有不同程度的除草活性，PA1條帶芽長抑制率為8373%，根長抑制率為93.37%；PA2條帶對野燕麥種子芽長抑制率為51.53%，根長抑制率為 74.35%；PA3條帶對野燕麥種子芽長抑制率為63.74%，根長抑制率為63.60%；PA4條帶對野燕麥種子芽長抑制率為73.39%，根長抑制率為7434%；PA5條帶對野燕麥種子的芽長抑制率為64.12%，根長抑制率為75.69%。PA1和PA5在波長為365 nm下吸收，顯示紫色色帶，PA2、PA3和PA4在波長為254 nm先吸收，顯示熒光色帶。

2.2HPLC分析

2.2.1檢測波長的選擇用紫外分光光度計對除草活性強(qiáng)的PA1條帶進(jìn)行紫外波譜區(qū)200～900 nm全波長掃描，以確定樣品的最大吸收波長，由圖2可見，在波長為220 nm處有較大的吸收峰，且無次級吸收，故在以下的HPLC分析時選用220 nm為分析波長。

2.2.2活性組分的 HPLC分析色譜分析條件：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ（20 mm I.D.×250 mm），流動相為甲醇 ∶ 水為 5 ∶ 95，流速16 mL/min，檢測波長220 nm，每次進(jìn)樣量15 μL。將PA-2的PA1條帶回收樣品通過有機(jī)濾膜，取樣 15 μL 進(jìn)行HPLC分析，由圖3可見，通過對圖譜的分析，可以看出在上述分析條件下該樣品可分離出2個較大的峰，其保留時間分別為59.015 min和65.948 min，可以看出保留時間是59015 min 的組分（標(biāo)記為A 峰）峰形較好，有點拖尾，后面有個保留時間為65.948 min的小峰（標(biāo)記為B峰）。分別將2個組分進(jìn)行收集制備，利用種子萌發(fā)抑制法測定其對野燕麥的活性（圖4為2個組分處理3 d的癥狀），可見2個組分峰都表現(xiàn)出了不同程度的除草活性，A峰對野燕麥種子的芽長抑制率為64.81%，根長抑制率為75.00%；B峰對野燕麥種子的芽長抑制率為62.96%，根長抑制率為52.34%。

3討論與結(jié)論

由于利用微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行除草劑開發(fā)的研究從本質(zhì)上是利用化合物的生物活性，類同于化學(xué)合成除草劑，所以更受到化學(xué)家們的重視。而深入研究微生物代謝產(chǎn)物，以期從中找到天然源的環(huán)保型化學(xué)除草劑之先導(dǎo)化合物，是天然產(chǎn)物利用研究的一個熱門領(lǐng)域。

已往研究曾采用薄層層析分離天然除草活性物質(zhì)[16]。但該法上樣量小，分離組分用于生測后難以有足夠的量進(jìn)行第2次分離。選用硅膠作固定相，二氯甲烷和甲醇混合溶劑作洗脫劑，對除草活性物質(zhì)進(jìn)行柱層析，取得了較好的分離效果。顯然本試驗采用柱層析方法對出芽短梗霉除草活性物質(zhì)進(jìn)行粗分是可行的。使用柱層析分離，上樣量大，能保證獲得足夠多的除草活性物質(zhì)進(jìn)行再分離純化以及生測和結(jié)構(gòu)鑒定。

生物活性跟蹤貫穿于整個提取過程中是必須的。根據(jù)除草活性物質(zhì)分離流程的不同與要求，采用的生測方法也多種多樣。本研究通過摸索，過柱子后獲得的餾分確定了用培養(yǎng)皿濾紙法來進(jìn)行活性跟蹤。隨后進(jìn)行薄層層析板生物活性測定，確定薄層板上的除草活性條帶區(qū)域，達(dá)到進(jìn)一步去除雜質(zhì)的目的。同時研究還發(fā)現(xiàn)，有些除草活性組分中的物質(zhì)在254、365 nm紫外光下幾乎無吸收或者吸收很弱，但在別的波長下卻有最大吸收。因此，用薄層層析分離除草活性物質(zhì)時不應(yīng)只刮取在254、365 nm下有熒光帶的部分生測，還應(yīng)刮取熒光帶之間無熒光的部分進(jìn)行生測，以防某些無熒光的活性物質(zhì)在分離過程中損失。采用柱層析分離，因為收集洗脫液是連續(xù)的，有助于發(fā)現(xiàn)一些在紫外光下無吸收的次生代謝產(chǎn)物。但柱層析缺點是不直觀，將薄層層析和柱層析相結(jié)合有助于解決這一問題。最后HPLC分析制備獲得的除草活性組分的量較少，故采用容器直徑較小的瓶蓋進(jìn)行生物活性測定。

本試驗利用薄層層析的方法，得到了5個條帶，并分別測定了其對野燕麥的除草活性，對5條帶回收樣品都進(jìn)行了HPLC分析，但除PA1條帶外，其他樣品的色譜圖分離效果不太理想，文中未列出。筆者認(rèn)為5個條帶的組分差別較大，其物化性質(zhì)也必存在諸多差異，故在同一條件下進(jìn)行HPLC分析時，其分離度難免會受到影響，同時，PA1的HPLC結(jié)果顯示，A峰和B峰2個保留時間分別為59.015 min和 65.948 min，這2個峰還是沒有完全分開，可能是難分離物質(zhì)，要求在今后分離工作中不斷選擇和試驗分離效果較好的洗脫劑或展開劑，選擇適宜的洗脫方法對除草活性物質(zhì)進(jìn)行分離。為了達(dá)到較好的分離目的，特別到了分離后期，不僅可以改變流動相，也可以改變固定相。所以對其分離條件的進(jìn)一步探索仍需進(jìn)行，此部分試驗也正在進(jìn)行中。

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