白三葉根系分泌物的化感作用及其GC-MS分析

王曉英

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山063000)

白三葉根系分泌物的化感作用及其GC-MS分析

王曉英

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山063000)

為探明白三葉入侵禾本科草坪是否與其根系分泌物的化感作用有關(guān)，采用瓊脂培養(yǎng)法研究白三葉根系分泌物對高羊茅和草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長的化感作用及其作用機制，并采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對白三葉根系分泌物化學(xué)成分進行分析。結(jié)果表明，白三葉根系分泌物對高羊茅和草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長均有化感抑制作用，抑制程度不同，抑制率介于4.42%～53.16%。經(jīng)白三葉根系分泌物處理后，高羊茅和草地早熟禾幼苗超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性均受到抑制，丙二醛(MDA)含量升高，可溶性蛋白含量降低，過氧化氫酶(CAT)活性表現(xiàn)為高羊茅幼苗升高，而草地早熟禾幼苗受到抑制。用乙酸乙酯、正丁醇、乙醚萃取白三葉根系分泌物，共鑒定出66種化合物，主要是紫薇縮醛、油酸酰胺、壬醛、硬脂酰胺、2，4-二叔丁基苯酚、2，6-二叔丁基對甲酚?？梢?，白三葉根系分泌物的化感作用是其入侵禾本科草坪的原因之一。

化感作用； 白三葉； 高羊茅； 草地早熟禾； 根系分泌物； 氣相色譜-質(zhì)譜

白三葉(TrifoliumrepensL.)又稱白車軸草，為豆科(Leguminosae)車軸草屬(Trifolium)多年生地被植物，具有分枝多、適應(yīng)力強、生長速度快等特點，在園林綠化中可形成單一的植物群落。在多年的種植過程中發(fā)現(xiàn)，白三葉常入侵其他禾本科草坪，破壞禾本科草坪的均一性和觀賞性。白三葉除了與禾本科植物爭奪光照和水分外[1]，還具有化感作用。前人對白三葉化感作用的研究主要集中在植株浸提液[2-5]、揮發(fā)物[6]和腐解物[7]方面。關(guān)于白三葉根系分泌物的化感作用研究較少，僅余婷等[8]采用水培收集根系分泌物的方法對其進行了研究，但未對白三葉根系分泌物的實際濃度進行分析。

根系分泌是指健康完整的活體植株通過根系向生長基質(zhì)中釋放無機離子或者有機物的過程，它是自然界的普遍現(xiàn)象，也是化感物質(zhì)釋放的重要途徑[9]。根系分泌物不僅影響植物種子的萌發(fā)和幼苗生長，而且對植物幼苗的生理也有影響[10-11]。關(guān)于白三葉根系分泌物在生產(chǎn)中的實際濃度能否起到化感作用未見報道,為此本試驗采用瓊脂培養(yǎng)的方法收集白三葉根系分泌物，研究其在生產(chǎn)中的實際濃度對高羊茅和草地早熟禾種子萌發(fā)、幼苗生長、生理的影響，并采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)分析白三葉根系分泌物的化學(xué)組分，探討其與白三葉入侵禾本科草坪的關(guān)系，為園林綠化中植物配置提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

白三葉、高羊茅與草地早熟禾種子購自克勞沃公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 白三葉根系分泌物的獲得及處理 在無菌條件下將白三葉種子用0.1%的升汞溶液消毒8～10 min后，無菌水沖洗3～5次，再將種子浸入70%乙醇溶液中30 s，無菌水沖洗3～5遍后，將其播入裝有50 mL瓊脂培養(yǎng)基(7‰)的三角瓶中，每瓶約播入50粒種子，將三角瓶置于人工氣候箱中培養(yǎng)。前3 d，25 ℃暗培養(yǎng)；從第4天起在25 ℃、4 000 lx光照、12 h，20 ℃、暗培養(yǎng)、12 h的無菌條件下培養(yǎng)，45 d后取出白三葉幼苗，培養(yǎng)基中即含有白三葉根系分泌物。期間若發(fā)現(xiàn)有污染的培養(yǎng)瓶立即取出。通過稱質(zhì)量在培養(yǎng)基中補足被白三葉幼苗吸收的水分，融化培養(yǎng)基，使其混勻，即得到含有白三葉根系分泌物的培養(yǎng)基。對照組不播白三葉種子，其余處理相同。

1.2.2 白三葉根系分泌物對高羊茅和草地早熟禾化感作用的測定 高羊茅和草地早熟禾種子按照上述白三葉種子的消毒方法消毒后，播入含有白三葉根系分泌物的培養(yǎng)基中。高羊茅每瓶接種30粒種子，草地早熟禾每瓶接種50粒種子。以不含白三葉根系分泌物的培養(yǎng)基為對照(CK)。將接有高羊茅和草地早熟禾種子的培養(yǎng)基放入人工氣候箱中25 ℃、暗培養(yǎng)3 d，從第4天起在25 ℃、4 000 lx光照、12 h，20 ℃、暗培養(yǎng)、12 h條件下培養(yǎng)。從種子露白起每隔24 h記錄萌發(fā)的種子數(shù)，連續(xù)記錄7 d發(fā)芽率，計算發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。培養(yǎng)15 d后對受試植物幼苗的根長、苗高、保護酶活性、丙二醛(MDA)含量、可溶性蛋白含量進行測定。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性測定均參照《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》[12]；MDA含量參照趙世杰等[13]的方法測定；可溶性蛋白含量采用Bradford方法[14]測定。

抑制率(IR)=(對照值-處理值)/對照值×100%(IR<0表示促進，IR>0表示抑制)。

1.2.3 白三葉根系分泌物的提取及成分測定 將含有白三葉根系分泌物的培養(yǎng)基經(jīng)8層紗布擠壓、濾紙過濾后的液體，在45 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20 min，將濃縮后的提取液用細菌過濾器過濾，得到含有白三葉根系分泌物的提取液。

分別取5 mL白三葉根系分泌物提取液，加入1 mL乙酸乙酯、乙醚、正丁醇萃取，吸取1 μL萃取液進樣，用Shimadzu GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行GC-MS 分析。GC(TraceTM2000，CE Instrument Company)條件為，色譜柱：rxi-5ms石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度50 ℃，以15 ℃/min 的速率升至180 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min 升到220 ℃，保持15 min；載氣：He(99.99%)，柱流速0.8 mL/min；進樣口溫度：250 ℃。MS(Voyager，F(xiàn)innigan Thermo-Quest Company)條件：電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描質(zhì)量范圍39～450 amu。采用Xcalibur 1.2 版本軟件、NIST08.LIB和NIST08S.LIB譜圖庫兼顧色譜保留時間定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Excel 2007軟件進行，方差分析采用SPSS 19.0進行，文中數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉根系分泌物對高羊茅和草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長的化感作用

由表1可知，經(jīng)白三葉根系分泌物處理的高羊茅和草地早熟禾的種子萌發(fā)和幼苗生長均受到抑制，抑制程度不同。白三葉根系分泌物處理對高羊茅和草地早熟禾種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的抑制率分別為11.22%、5.79%、11.74%、27.45%和4.42%、19.17%、11.28%、21.43%。其中僅處理的高羊茅種子發(fā)芽率與對照相比差異顯著(P<0.05)，其余指標(biāo)與對照相比差異均不顯著。就2種受體植物來說，白三葉根系分泌物對高羊茅發(fā)芽率的抑制作用大于對發(fā)芽勢的抑制作用，而對草地早熟禾發(fā)芽勢的抑制作用大于對發(fā)芽率的抑制作用。白三葉根系分泌物處理后高羊茅和草地早熟禾苗高、根長均與對照差異顯著(P<0.05)，抑制率分別為44.76%、44.33%和33.22%、53.16%。白三葉根系分泌物對高羊茅苗高和根長的抑制作用相近，對草地早熟禾根長的抑制作用大于對其苗高的抑制作用。

表1 白三葉根系分泌物對高羊茅和草地早熟禾種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

注：*表示與對照相比差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 白三葉根系分泌物對高羊茅和草地早熟禾幼苗生理指標(biāo)的化感作用

由表2可知，經(jīng)白三葉根系分泌物處理后，高羊茅和草地早熟禾幼苗保護酶活性及可溶性蛋白含量均發(fā)生變化，變化程度不同。二者幼苗SOD、POD活性均受到抑制，抑制率在5.39%～28.96%。其中高羊茅幼苗SOD、POD活性與對照差異顯著(P<0.05)；草地早熟禾幼苗SOD活性與對照差異不顯著，POD活性與對照差異顯著(P<0.05)。高羊茅幼苗CAT活性經(jīng)白三葉根系分泌物處理后與對照相比顯著升高(P<0.05)，而草地早熟禾則顯著下降(P<0.05)。二者幼苗MDA含量均顯著升高(P<0.05)，分別較對照升高142.40%和297.59%，說明白三葉根系分泌物處理后受體植物膜脂過氧化作用加劇。可溶性蛋白是植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，經(jīng)白三葉根系分泌物處理后的高羊茅和草地早熟禾幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量均顯著降低。

表2 白三葉根系分泌物對高羊茅和草地早熟禾幼苗生理指標(biāo)的影響

2.3 白三葉根系分泌物的化學(xué)成分分析

白三葉根系分泌物提取液經(jīng)正丁醇、乙酸乙酯、乙醚萃取后進行GC-MS分析，得到總離子流色譜圖(圖1—3)。由圖1—3可見，不同萃取物中所含的物質(zhì)成分有差異。經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST08.LIB和NIST08S.LIB的計算機檢索，各組分分別鑒定出18、17、42種化合物，并采用面積歸一化法確定了它們的相對含量(表3)。

圖1 白三葉根系分泌物正丁醇萃取相總離子流色譜圖

圖2 白三葉根系分泌物乙酸乙酯萃取相總離子流色譜圖

圖3 白三葉根系分泌物乙醚萃取相總離子流色譜圖

白三葉根系分泌物正丁醇萃取組分共鑒定出18種化合物，主要包含烷烴、烯烴、酸、醛、酰胺、酚、酯、酮、醚等化合物，其中含量較高的為紫薇縮醛(84.29%)、油酸酰胺(1.54%)、丁酸丁酯(1.05%)、叔丁醚(1.00%)、壬醛(0.78%)等物質(zhì)。乙酸乙酯萃取組分共鑒定出17 種化合物，主要包含烴、酸、醛、酰胺、酚、含氮化合物類等，其中含量較高的為油酸酰胺(23.78%)、壬醛(13.65%)、硬脂酰胺(12.80%)、2，4-二叔丁基苯酚(10.04%)、2，2，4，6，6-五甲基庚烷(8.13%)等物質(zhì)。乙醚萃取組分共鑒定出42種化合物，主要包含烷烴、烯烴、酸、醛、酰胺、酚、酯、醇、含氮化合物、含硫化合物、苯類等，其中含量較高的為2，6-二叔丁基對甲酚(19.08%)、油酸酰胺(11.29%)、十四烷(4.62%)、2，2，4，6，6-五甲基庚烷(4.54%)等物質(zhì)。

表3 白三葉根系分泌物化學(xué)組分

3 結(jié)論與討論

白三葉是已被證實的具有化感作用的植物種類之一，其常入侵其他禾本科草坪，破壞禾本科草坪的均一性和觀賞性。本試驗采用更接近自然狀態(tài)下白三葉根系分泌物濃度的瓊脂培養(yǎng)方法研究其對高羊茅和草地早熟禾的化感作用。結(jié)果表明，白三葉根系分泌物對高羊茅和草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長均有抑制作用，抑制程度不同，抑制率在4.42%～53.16%，說明在自然狀態(tài)下白三葉根系分泌物含量對高羊茅和草地早熟禾具有化感抑制作用，與前人研究結(jié)果一致[8]；只是不同受體不同指標(biāo)在感受根系分泌物的化感作用時，表現(xiàn)的結(jié)果不一致。

抗氧化能力的提高與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是植物在逆境下得以生存的2種重要機制[15]。植物體內(nèi)SOD、POD和CAT等酶系的相互協(xié)調(diào)作用，使體內(nèi)活性氧維持在一個較低的水平上，從而避免活性氧對膜脂造成傷害。關(guān)于白三葉根系分泌物中化感物質(zhì)對抗氧化酶活性的影響，不同受體植物變化趨勢有差異。經(jīng)白三葉根系分泌物處理后，高羊茅和草地早熟禾幼苗SOD、POD活性均受到抑制，高羊茅幼苗CAT活性顯著升高，而草地早熟禾幼苗CAT活性則顯著下降，說明白三葉根系分泌物破壞了受體幼苗體內(nèi)的保護酶活性平衡，使其對自由基的清除能力降低，而受體植物幼苗體內(nèi)MDA含量均顯著升高，則進一步表明受體植物質(zhì)膜氧化加劇，細胞結(jié)構(gòu)及生理功能被破壞。

在逆境中，植物水解作用增強，合成作用減弱[16]；同時為保持細胞的滲透調(diào)節(jié)能力和保護細胞內(nèi)某些酶的活性，植物細胞自身會積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。白三葉根系分泌物處理使得受體植物幼苗可溶性蛋白含量均降低，這與前人研究結(jié)果一致[16]。有研究表明，逆境脅迫下植物體內(nèi)可溶性糖含量增加[17]，白三葉根系分泌物處理下受體植物體內(nèi)的可溶性糖含量是否增加以及其與可溶性蛋白含量降低的關(guān)系尚不清楚。因此，逆境下植物體內(nèi)可溶性蛋白的轉(zhuǎn)化分解過程需進一步研究。

本研究分別用乙酸乙酯、正丁醇、乙醚進行萃取，采用GC-MS方法對白三葉根系分泌物化學(xué)成分進行分析，結(jié)果表明，在3種萃取相中，鑒定出的根系分泌物種類多少依次為：乙醚>正丁醇>乙酸乙酯，這是根系分泌物在不同的萃取劑中溶解程度不同導(dǎo)致的。

化感物質(zhì)是一類具有生物活性的次生代謝物質(zhì)，一般分子量較小，結(jié)構(gòu)較簡單。3種萃取相中共鑒定出66種化合物，有烷烴、烯烴、酸、醛、酰胺、酚、酯、醇、酮、醚、含氮、含硫化合物、苯類等。酚類物質(zhì)為重要的水溶性化感物質(zhì)[18]，白三葉根系分泌物中酚類物質(zhì)有2種，分別是2,6-二叔丁基對甲酚和2,4-二叔丁基苯酚，二者均是已經(jīng)證實的具有化感作用的物質(zhì)[19-20]。根系分泌物中鑒定出的壬醛[21]、鄰苯二甲酸二丁酯[22-23]也已被證明對植物具有化感作用。根系分泌物中所含化合物種類最多的是烷烴，其化學(xué)性質(zhì)極為穩(wěn)定，不是生理活性物質(zhì)，故成分中的烷烴類可能不是白三葉根系分泌物中的化感物質(zhì)。有研究表明，硬脂酰胺對煙草沒有直接的化感作用[24]，其對禾草是否具有化感作用尚不清楚。紫薇縮醛在正丁醇相中含量較多，其是否具有化感作用尚不清楚。植物化感作用是幾個或幾類化感物質(zhì)綜合作用的結(jié)果，根據(jù)以上分析推測，白三葉根系分泌物中起化感作用的主要物質(zhì)可能是酚類、酯類和醛，多種化感物質(zhì)間具體的協(xié)同效應(yīng)方式，還需進一步研究。

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Allelopathic Effect and GC-MS Analysis of Root Exudates ofTrifoliumrepenseL.

WANG Xiaoying

(Department of Life Science，Tangshan Teachers College，Tangshan 063000，China)

The allelopathic effects of root exudates ofTrifoliumrepensL. on seed germination,seedling growth and seedling physiology of kentucky bluegrass and tall fescue were tested by agar culture in laboratory,aiming to approach whether the allelopathy effect exists in the invasion ofTrifoliumrepensL. to gramineous turfgrass.And the chemical components of the exudates were analyzed using GC-MS.The results showed that the root exudates ofTrifoliumrepensL. had allelopathic effects on seed germination and seedling growth of kentucky bluegrass and tall fescue,and the inhibition varied greatly,ranging from 4.42% to 53.16%.The exudates ofTrifoliumrepensL. reduced the activities of superoxide dismutase(SOD) and peroxidase(POD),as well as the content of soluble protein of the seedlings of kentucky bluegrass and tall fescue,and increased the content of malondialdehyde(MDA) of both seedlings.The activity of catalase(CAT) of the seedlings of kentucky bluegrass decreased,whereas that of the seedlings of tall fescue increased.Sixty six compounds in exudates ofTrifoliumrepensL. were identified after extracted by ethyl ether,ethyl acetate and n-butanol,including lageracetal,oleamide,nonanal,octadecanamide,2，4-di-tert-butyl-phenol，butylated hydroxytoluene,etal.We conclude that the allelopathy effect of root exudates is one of the reasons whyTrifoliumrepensL. invases to gramineous turfgrass.

allelopathic effect;TrifoliumrepensL.; tall fescue; kentucky bluegrass; root exudates; GC-MS

2015-11-02

唐山市科技計劃項目(15130264a)；唐山師范學(xué)院科學(xué)研究基金項目(2013D07)

王曉英(1984-)，女，山西運城人，實驗師，碩士，主要從事植物化感作用研究。E-mail：64979385@qq.com

S688.4

A

1004-3268(2016)05-0096-06