低能N+注入選育凝結(jié)芽孢桿菌高效生防菌株

顧鵬飛，吳 剛，胡永紅，王春曉，丁志雯，楊文革

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816)

低能N+注入選育凝結(jié)芽孢桿菌高效生防菌株

顧鵬飛，吳 剛，胡永紅，王春曉，丁志雯，楊文革

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816)

為了進一步提高凝結(jié)芽孢桿菌NJYHHWG 877005菌株的拮抗性能，獲得生防效果更好的菌株，利用低能N+注入菌株進行誘變，并通過平板對峙培養(yǎng)對誘變處理后的菌株進行篩選。結(jié)果表明，菌株存活率曲線遵循N+注入生物效應(yīng)的馬鞍型曲線，根據(jù)其存活率及突變率確定N+最佳注入能量為15 keV,最佳注入劑量為140×1013個/cm2。通過篩選獲得1株具有良好性狀的突變株L1，芽孢形成率達77.42%，對灰葡萄孢霉菌的抑制率高達87.81%，分別較原始出發(fā)菌株提高了23.79、11.71個百分點，且連續(xù)傳代培養(yǎng)8次，遺傳穩(wěn)定性良好。

凝結(jié)芽孢桿菌； N+注入； 誘變選育； 遺傳穩(wěn)定性； 抑菌率

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是近年來益生菌領(lǐng)域的后起之秀，除具有乳酸菌和雙歧桿菌等的保健功效外，還具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性，且具有較強的抑制腸道致病菌能力[1]。被用于微生態(tài)制劑的枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌雖名為減毒或無毒菌株，但安全性仍不如凝結(jié)芽孢桿菌。1992年美國FDA公布了5種芽孢桿菌可以用于飼料的安全菌株，凝結(jié)芽孢桿菌名列第1位[2]。凝結(jié)芽孢桿菌在國外已被廣泛應(yīng)用于保健、醫(yī)療、食品和畜牧等領(lǐng)域，是較具應(yīng)用潛力的芽孢桿菌菌種之一，但是在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用甚少。研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌通過分泌抗生物質(zhì)和生長競爭等方式在植物病害生物防治方面起著重要作用[3-4]；另外，凝結(jié)芽孢桿菌在生長過程中也可產(chǎn)生一些促進植物生長的物質(zhì)，例如玉米素、異戊烯基腺嘌呤和玉米素核苷等。然而由于符合工業(yè)化生產(chǎn)需求的優(yōu)良穩(wěn)定菌株缺乏，嚴重制約著其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用[5-6]。

離子注入誘變選育技術(shù)是20世紀80年代興起的一種綜合誘變技術(shù)，是集物理、化學(xué)誘變因子于一身的復(fù)合誘變方法，與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變因子相比，離子注入誘變除有能量、質(zhì)量沉積外，還有動量傳遞及電荷交換等效應(yīng)，可導(dǎo)致微生物的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定、易于獲得理想新種質(zhì)等特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微生物改良方面[7]。國內(nèi)外相繼有離子注入微生物后，獲得目標性能提高、遺傳穩(wěn)定菌株的研究報道[8-10]。

本研究利用N+注入誘變技術(shù)對凝結(jié)芽孢桿菌 NJYHHWG 877005菌株進行改良，考察了不同能量和劑量的N+注入對凝結(jié)芽孢桿菌 NJYHHWG 877005的誘變效應(yīng)，以期篩選出生物防治效果良好的菌株。

1 材料和方法

1.1 試驗菌種

實驗室自主篩選益生菌株：凝結(jié)芽孢桿菌NJYHHWG 877005。

病原真菌：灰葡萄孢霉菌，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所生物防治實驗室分離保存。

1.2 培養(yǎng)基

固體平板培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g/L、酵母膏5.00 g/L、NaCl 5.00 g/L、瓊脂粉20.00 g/L，pH值7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g/L、酵母膏5.00 g/L、NaCl 1.00 g/L、葡萄糖 60.00 g/L，pH值7.0～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨12.00 g/L、酵母膏15.00 g/L、葡萄糖22.00 g/L、MnSO4·H2O 0.000 2 g/L、CaCO30.02 g/L。

馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基：土豆200.00 g/L、蔗糖20.00 g/L、蛋白胨5.00 g/L、瓊脂粉20.00 g/L，pH值7.0～7.5。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)及誘變方法

1.3.1.1 菌種培養(yǎng) 平板培養(yǎng)：將凝結(jié)芽孢桿菌 NJYHHWG 877005菌種接到固體平板培養(yǎng)基中，溫度為37 ℃，培養(yǎng)時間為2～3 d。

種子培養(yǎng)：從培養(yǎng)好的平板中選取1個單菌落，轉(zhuǎn)接到100 mL種子培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)18 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液以5%接種量接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在180 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.1.2 N+注入誘變 取0.1 mL培養(yǎng)至指數(shù)生長期的發(fā)酵液，均勻涂布于無菌空白培養(yǎng)皿中，以在顯微鏡下觀察無相互重疊的細胞為最佳，用無菌風(fēng)吹干，采用LZD900多功能N+注入機進行N+注入。N+能量為10～20 keV，劑量為20×1013～200×1013個/cm2，靶室真空度為10-3Pa，以5 s脈沖式注入，間隔15 s。

1.3.1.3 誘變后培養(yǎng) 將經(jīng)過N+注入的培養(yǎng)皿取出，用1 mL無菌的生理鹽水進行洗脫，稀釋107倍后取0.1 mL涂布于固體平板培養(yǎng)基上，置37 ℃下培養(yǎng)，計算單菌落數(shù)目，統(tǒng)計其存活率以備篩選。

1.3.2 篩選方法

1.3.2.1 初篩 取一個潔凈的載玻片，于中央滴1滴無菌水，挑取處理后樣品生長的1個單菌落置載玻片上涂勻，在酒精燈火焰上烘干，用結(jié)晶紫染色1～2 min，在電子顯微鏡下觀察菌體及芽孢的形態(tài)。

1.3.2.2 復(fù)篩 挑取符合凝結(jié)芽孢桿菌菌落形態(tài)特征、長勢較好的單菌落進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測定活菌體數(shù)量、芽孢數(shù)量以及對灰葡萄孢霉菌的抑制率，最終挑選出一株性狀良好的菌株。相關(guān)測定方法如下：

①芽孢數(shù)量的測定 分別取1 mL經(jīng)80 ℃熱處理10 min和未經(jīng)熱處理的發(fā)酵液，稀釋107倍后轉(zhuǎn)移到固體平板培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)36～40 h，統(tǒng)計菌落數(shù)，分別為其芽孢數(shù)和活菌數(shù)，每個處理設(shè)置3個平行。

②抑菌率的測定 采用平板對峙法，待活化好的病原菌菌落長至1元硬幣大小時，用打孔器在邊緣打取直徑為8 mm的菌絲塊，挑入PSA平板中線外1/3處，培養(yǎng)24 h后，在同一中線的另1/3處接入10 μL發(fā)酵液(搖瓶培養(yǎng)30 h)，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，記錄病原菌菌落直徑，每個處理重復(fù)3次，以只接病原菌的平板作為對照。

1.3.3 突變率的計算 以出發(fā)菌株為對照，考察誘變后凝結(jié)芽孢桿菌對灰葡萄孢霉菌的抑制率。誘變后抑菌率較原始出發(fā)菌株低5%以上的為負突變株，高5%以上的為正突變株，介于兩者之間的視為無突變。負突變率是指負突變株占全部考察菌株的百分率，正突變率是指正突變株占全部考察菌株的百分率，總突變率為正突變率與負突變率之和。

2 結(jié)果與分析

2.1 N+注入對菌株存活率的影響

由存活率曲線(圖1)可以看出，隨著N+注入劑量的逐漸增加，菌株的存活率呈現(xiàn)先下降后短暫上升再下降，最后趨于零的趨勢，呈明顯的“馬鞍型”變化。在N+注入劑量達到140×1013個/cm2時，菌株的存活率最高，達44.9%，活菌數(shù)目達到4.12×109cfu/mL；而后存活率逐漸下降，當(dāng)注入劑量達到200×1013個/cm2時，菌株的存活率趨于零。

圖1 不同劑量N+注入對菌株存活率的影響

2.2 N+注入對菌株突變率的影響

2.2.1 不同能量N+注入對菌株突變率的影響 從圖2可知，不同注入能量對菌株的正突變率產(chǎn)生影響。當(dāng)N+注入能量小于15 keV 時，菌株的正突變率隨能量的增加而增加，而當(dāng)注入能量大于15 keV 時，正突變率反而下降，原因可能是能量太高使得細胞內(nèi)一些遺傳物質(zhì)損傷過于嚴重。注入能量為15 keV時誘變后菌株的正突變率為19.4%，明顯高于注入能量為10 keV和20 keV的正突變率，因此最佳注入能量為15 keV。

圖2 不同能量N+注入對菌株突變率的影響

2.2.2 不同劑量N+注入對菌株突變率的影響 由圖3可知，當(dāng)N+注入劑量逐漸增加時，凝結(jié)芽孢桿菌NJYHHWG 877005菌株的正突變率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與存活率的走勢大致相同，當(dāng)注入劑量達140×1013個/cm2時，正突變率達最大值(18.3%)。該菌株正突變率的最高點所對應(yīng)的注入劑量和由存活率推出的最佳注入劑量相吻合，據(jù)此可以確定最佳注入劑量為140×1013個/cm2。

圖3 不同劑量N+注入對菌株突變率的影響

2.3 性狀優(yōu)良菌株的篩選結(jié)果

將凝結(jié)芽孢桿菌NJYHHWG 877005發(fā)酵液在N+最佳注入能量15 keV、最佳注入劑量140×1013個/cm2下進行處理，而后進行平板培養(yǎng)，從表面濕潤、平坦，邊緣整齊而有光澤，長勢良好且符合凝結(jié)芽孢桿菌菌落形態(tài)特征的菌落中，挑取最好的10個菌落分別進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，用培養(yǎng)36 h的發(fā)酵液測定芽孢形成率及對灰葡萄孢霉菌的抑制率。

表1 原始菌株與各突變株的芽孢形成率及抑菌率 %

由表1可知，誘變后的菌株較原始菌株在芽孢形成率和抑菌率上均有所改變，其中突變株2的芽孢形成率最高，達83.66%；突變株5的抑菌率最高，達89.14%，但其芽孢形成率僅為45.71%。因芽孢形成率對于凝結(jié)芽孢桿菌的生物防治效果以及所開發(fā)的相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用，綜合考慮選擇突變株7為最佳誘變菌株，其芽孢形成率為77.42%，抑菌率達87.81%，較原始菌株分別提高了23.79、11.71個百分點，將該菌株命名為L1。

2.4 篩選菌株的遺傳穩(wěn)定性

對篩選出的突變株L1進行連續(xù)8代的傳代試驗，由圖4可知，原始菌株與突變菌株隨傳代次數(shù)的增加，對灰葡萄孢霉菌的抑制率雖稍有下降，但趨于平穩(wěn)，突變株L1的最高抑菌率達87.81%，傳至第8代其抑菌率依然可達到77.90%，證明該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖4 突變菌株L1的遺傳穩(wěn)定性

3 結(jié)論與討論

N+注入誘變的菌株存活曲線為馬鞍型曲線，與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法產(chǎn)生的菌株存活曲線呈指數(shù)型或肩型不同，相關(guān)研究表明，低能N+注入時離子能量沉積與動量傳遞等效應(yīng)對細胞表面具有損傷，隨N+注入劑量的增大能量沉積產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致生物膜與 DNA 等生物大分子損傷，菌株存活率下降，當(dāng)注入劑量繼續(xù)增加，持續(xù)注入的大量電荷堆積產(chǎn)生強庫侖斥力，對菌體產(chǎn)生一個“保護性屏障”，并且大量堆積的電荷形成一個弱電場，弱電場的刺激效應(yīng)可以激活菌體細胞內(nèi)的修復(fù)機制，增強細胞修復(fù)損傷的效率，于是存活率又有所回升，當(dāng)注入劑量繼續(xù)上升超出了細胞自身的修復(fù)能力時，存活率再次下降[11-13]。

本研究利用低能N+注入技術(shù)對凝結(jié)芽孢桿菌 NJYHHWG 877005菌株進行改良，考察了不同能量和不同劑量N+注入NJYHHWG 877005的誘變效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)不同突變株的菌落形態(tài)、芽孢形成率以及生防效果存在差異，這說明低能離子對凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生了生理生化類型的表型效應(yīng)[14]。通過在N+最佳注入能量15 keV、最佳注入劑量140×1013個/cm2下進行誘變處理，篩選出1株性狀優(yōu)良的高效生防菌株L1，其芽孢形成率和抑菌率分別較原始出發(fā)菌株提高了23.79、11.71個百分點。要得到更高效的優(yōu)良菌株，需要進一步的離子注入試驗，同時對突變株的發(fā)酵條件進行深入研究。

本試驗在篩選突變菌株時，采用的是突變菌株和灰葡萄孢霉菌對峙培養(yǎng)的方法，今后將對突變菌株產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)的種類及數(shù)量進行快速定量分析，提高篩選效率，為更好地利用離子注入技術(shù)提高生防菌的拮抗能力提供參考。

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Mutation Breeding of High-efficiency Biocontrol Strain ofBacilluscoagulansby Low Energy N+Ion Beam Implantation

GU Pengfei,WU Gang,HU Yonghong,WANG Chunxiao,DING Zhiwen,YANG Wenge

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China)

In order to improve the antagonistic ability ofBacilluscoagulansNJYHHWG 877005 and search for high-efficient mutant strains,the strain was induced by low energy N+ion beam implantation and the mutation strains were screened by confrontation experiments.It was found that the curve of survival took a “saddle shape” with N+ion dose increased.By the livability and mutation rate of the strain, the best induced mutation action was decided when the used energy and ions implantation dose were 15 keV and 140×1013N+/cm2.A fine strain L1 was obtained through screening.The forming rate of spore was up to 77.42%,and the inhibition rate of the mutant strain againstBotrytiscinereawas up to 87.81%,increased by 23.79 and 11.71 percentage points compared to the primitive strain,respectively.After eight generations of propagation,the mutant strain showed high genetic stability.

Bacilluscoagulans; N+ion beam implantation; mutation breeding; genetic stability; inhibition rate

2015-10-27

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(14)2057)；江蘇省科技支撐計劃(農(nóng)業(yè))項目(BE2014386)

顧鵬飛(1990-)，男，河南南陽人，在讀碩士研究生，研究方向：生物農(nóng)藥。E-mail：18351870291@163.com

*通訊作者：胡永紅(1968-)，女，江蘇如皋人，教授，博士，主要從事植物病蟲害防治研究。E-mail：yonghonghu11@126.com

S476.1;Q319+.2

A

1004-3268(2016)05-0087-04