人參皂苷Rg1對實驗性精索靜脈曲張大鼠睪丸生精細胞凋亡及Bcl-2、caspase-3表達的影響

李洋洲，張大田

(1.錦州醫(yī)科大學 研究生學院，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，遼寧 錦州 121000)

人參皂苷Rg1對實驗性精索靜脈曲張大鼠睪丸生精細胞凋亡及Bcl-2、caspase-3表達的影響

李洋洲1，張大田2Δ

(1.錦州醫(yī)科大學 研究生學院，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，遼寧 錦州 121000)

目的 研究人參皂苷Rg1對精索靜脈曲張(varicocele，VC)大鼠睪丸生精細胞Bcl-2、caspase-3表達的影響，探討其對VC相關(guān)不育癥的作用及機制。方法 選取Wistar雄性大鼠32只，隨機分為4組：假手術(shù)組、VC組、低劑量人參皂苷Rg1組(5 mg/kg)、高劑量人參皂苷Rg1組(10 mg/kg)，每組8只。精索靜脈曲張模型構(gòu)建采用Turner法，造模4 w后，人參皂苷干預組分別灌胃不同劑量人參皂苷Rg1，假手術(shù)組及VC組灌胃等體積0.9%NaCl溶液，每天1次，灌胃4w后處死大鼠，切取左側(cè)睪丸組織樣本，分別采用TUNEL法、免疫組化法來檢測細胞凋亡和Bcl-2、caspase-3的表達。結(jié)果 人參皂苷Rg1干預組大鼠睪丸組織Bcl-2的表達較VC組升高，低于假手術(shù)組，高劑量人參皂苷Rg1組Bcl-2的表達高于低劑量人參皂苷Rg1組(P<0.05)；人參皂苷Rg1干預組大鼠睪丸組織caspase-3的表達較VC組降低，高于假手術(shù)組，高劑量人參皂苷Rg1組caspase-3的表達低于低劑量人參皂苷Rg1組(P<0.05)；假手術(shù)組細胞凋亡指數(shù)最低，人參皂苷Rg1干預組細胞凋亡指數(shù)低于VC組，高劑量人參皂苷Rg1組細胞凋亡指數(shù)低于低劑量人參皂苷Rg1組(P<0.05)。結(jié)論 人參皂苷Rg1可顯著提高睪丸生精細胞抑制凋亡因子Bcl-2的表達，同時下調(diào)凋亡執(zhí)行因子caspase-3的表達，從而降低精索靜脈曲張大鼠睪丸生精細胞凋亡。

精索靜脈曲張；細胞凋亡；人參皂苷Rg1；Bcl-2；caspase-3

精索靜脈曲張(varicocele，VC)是指精索內(nèi)靜脈因靜脈回流障礙或解剖因素所導致的蔓狀靜脈叢的迂曲、擴張和異常伸長[1]。青壯年多發(fā)，輕者多無癥狀，重者引起陰囊墜脹或墜痛，甚至影響睪丸的生精功能，進而導致精液異常，是男性不育的主要原因之一。盡管對其致男性不育的機制已進行了大量相關(guān)的臨床及實驗研究，但具體的致病機制仍未完全闡明。精索靜脈曲張可通過引起血管活性物質(zhì)增加、睪丸微循環(huán)障礙、氧自由基增多、NO、缺氧、免疫異常及生精細胞凋亡等多種途徑共同作用導致男性不育[2]。在細胞分子學方面的研究，主要集中在生精細胞凋亡。精索靜脈曲張時抑制凋亡因子Bcl-2的表達減少，作為凋亡執(zhí)行因子的caspase-3的表達增加，加劇了睪丸生精細胞的凋亡，從而造成生精功能障礙，影響生育能力[3]。

人參皂苷是人參內(nèi)提取的一種固醇類化合物，是人參的主要活性成分，具有廣泛的藥理應用。近年的研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1不但具有抗氧化、促進神經(jīng)和血管再生等作用[4]，而且還具有抗細胞凋亡以及生精保護方面作用。微觀上，人參皂苷Rg1可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達、降低活性氧水平、抑制caspase-3的激活等途徑，發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。宏觀上，人參皂苷Rg1能在一定程度上改善睪丸組織的結(jié)構(gòu)損傷，從形態(tài)學上直觀顯示了其對睪丸組織有不同程度的修復作用，保護睪丸的正常生精功能[5]。本研究通過檢測人參皂苷Rg1對VC大鼠睪丸組織Bcl-2和caspase-3的表達及對生精細胞凋亡的影響，旨在探討人參皂苷Rg1對于VC所致生精細胞異常凋亡是否具有保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人參皂苷Rg1(純度99%，購自上海融禾醫(yī)藥發(fā)展科技有限公司)，Bcl-2、caspase-3單克隆抗體和SP試劑盒(包含生物素標記二抗)、DAB顯色劑(購自北京中杉金橋公司)，枸櫞酸緩沖溶液(自配)，TUNEL檢測試劑盒(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，自配)，蘇木素和伊紅染液(碧云天生物技術(shù)有限公司)。Leica組織切片機(德國RMZ125型)、DP72型光學顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗大鼠的分組及處理、VC模型的構(gòu)建 選擇年齡為6 w的雄性Wistar大鼠32只(SPF級，購自錦州醫(yī)科大學實驗動物中心)，體質(zhì)量150～200 g之間，隨機分為4組：假手術(shù)組、VC組、低劑量人參皂苷Rg1組、高劑量人參皂苷Rg1組，每組各8只。制作實驗性左側(cè)精索靜脈曲張大鼠模型。

模型制作采用Turner法[6]：10%水合氯醛(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒鋪巾。左側(cè)腹直肌旁0.5 cm縱切口，逐層分離進入腹腔。向右側(cè)推開腹腔內(nèi)各個臟器，顯露左腎靜脈、腎臟、腎上腺靜脈，于精索靜脈內(nèi)側(cè)，將一根直徑約0.55 mm的輸液器針頭與左腎靜脈一起結(jié)扎，結(jié)扎不易過度用力，能順利拔出輸液器針頭即可，拔出過程注意避免損傷周圍血管及組織。1號絲線逐層縫合切口，腹腔內(nèi)注射適量的青霉素溶液用以控制感染。假手術(shù)組只模擬手術(shù)過程，分離并顯露左腎靜脈，不予結(jié)扎。造模4 w后麻醉開腹，若左側(cè)精索靜脈明顯擴張(直徑大于0.1 cm)且兩側(cè)腎臟重量相似，則說明造模成功。整個實驗中，造模手術(shù)過程大鼠死亡1只，術(shù)后飼養(yǎng)過程中死亡1只，造模失敗2只，以上均使用備用大鼠隨機增補至各組，最終有32只大鼠進入本實驗。

造模4 w以后，各組大鼠分別作如下處理：①假手術(shù)組：0.9%NaCl溶液1 mL/100 g，每天1次，灌胃；②VC組：0.9%NaCl溶液1 mL/100 g，每天1次，灌胃；③低劑量人參皂苷Rg1組：人參皂苷Rg1 5 mg/kg，用0.9%NaCl溶液稀釋至0.5 mg/mL，每天1次，灌胃；④高劑量人參皂苷Rg1組：人參皂苷Rg1 10 mg/kg，用0.9%NaCl溶液稀釋至1 mg/mL，每天1次，灌胃；持續(xù)灌胃4 w后，4組大鼠均處死并切取左側(cè)睪丸組織做后續(xù)處理。

1.2.2 HE染色 切取的左側(cè)睪丸組織放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內(nèi)固定，然后于酒精溶液內(nèi)脫水、二甲苯溶液內(nèi)透明，石蠟包埋，制作5 μm組織切片。常規(guī)HE染色。

1.2.3 Bcl-2、caspase-3表達的檢測 各組睪丸組織的固定、取材、制片過程同上。免疫組化采用SP法來檢測Bcl-2和caspase-3凋亡蛋白在睪丸組織中的表達，所有標本在同一條件下染色、DAB顯色，Bcl-2、caspase-3單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1:100，以PBS緩沖液代替假手術(shù)組一抗。免疫組化陽性表達為細胞質(zhì)或細胞核上出現(xiàn)棕色顆粒。用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測量和分析免疫組化灰度值，分析Bcl-2、caspase-3在大鼠睪丸組織中的表達，灰度值與陽性表達成正相關(guān)，即陽性表達越強則灰度值越大。

1.2.4 TUNEL法檢測生精細胞凋亡指數(shù) 各組睪丸組織的固定、取材、制片過程同上。嚴格按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。用光學顯微鏡計數(shù)500個細胞并計數(shù)其中凋亡細胞的數(shù)量。凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)定義為100個細胞中凋亡細胞的平均個數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 假手術(shù)組大鼠睪丸組織生精上皮結(jié)構(gòu)完整，管腔內(nèi)可見大量各級生精細胞，細胞間排列緊致有序；VC組大鼠睪丸組織染色可見生精上皮皺縮，支持細胞及各級生精細胞均顯著減少，細胞聚集成團塊狀，生精小管管腔間隙增大；高劑量人參皂苷Rg1組大鼠睪丸生精上皮略變薄，支持細胞及各級生精細胞相對減少，細胞間排列較為稀疏；低劑量人參皂苷Rg1組的表現(xiàn)劣于高劑量組，但兩藥物組變化均較VC組輕。見圖1。

圖1 各組睪丸組織HE染色(×200)A：假手術(shù)組；B：VC組；C：低劑量人參皂苷Rg1組；D：高劑量人參皂苷Rg1組Fig.1 Results of HE staining in testicular tissue of rats in each group(×200)A:Sham operation; B:Varicocele model; C:Low-dose ginsenoside Rg1; D:High-dose ginsenoside Rg1

2.2 Bcl-2、caspase-3表達 在各級生精細胞細胞質(zhì)和細胞核中Bcl-2、caspase-3均有表達，免疫組化陽性表達即為細胞質(zhì)和細胞核出現(xiàn)棕黃色，以精母細胞最為明顯，見圖2、圖3。人參皂苷Rg1干預組大鼠的Bcl-2表達高于VC組，低于假手術(shù)組；低劑量人參皂苷Rg1組大鼠Bcl-2表達低于高劑量人參皂苷Rg1組(P<0.05)。人參皂苷Rg1干預組大鼠caspase-3的表達低于VC組，高于假手術(shù)組；低劑量人參皂苷Rg1組大鼠caspase-3的表達高于高劑量人參皂苷Rg1組(P<0.05)。各組免疫組化平均灰度值見表1。

圖2 各組睪丸組織Bcl-2表達(×400)A：假手術(shù)組；B：VC組；C：低劑量人參皂苷Rg1組；D：高劑量人參皂苷Rg1組Fig.2 Expression of Bcl-2 in testicular tissue of rats in each group(×400)A:Sham operation; B:Varicocele model; C:Low-dose ginsenoside Rg1; D:High-dose ginsenoside Rg1

圖3 各組睪丸組織caspase-3表達(×400)A：假手術(shù)組；B：VC組；C：低劑量人參皂苷Rg1組；D：高劑量人參皂苷Rg1組Fig.3 Expression of caspase-3 in testicular tissue of rats in each group(×400)A:Sham operation; B:Varicocele model; C:Low-dose ginsenoside Rg1; D:High-dose ginsenoside Rg1

組別Bcl-2caspase-3AI(%)假手術(shù)組109.54±2.37137.04±2.957.10±2.80VC組128.86±2.56*117.39±2.92*20.28±0.69*低劑量人參皂苷Rg1組122.02±1.75*#124.42±0.86*#15.78±1.84*#高劑量人參皂苷Rg1組117.20±2.70*#△130.05±2.11*#△11.37±3.23*#△F值93.9199.2746.53

*P<0.05，與假手術(shù)組比較，compared with sham operation；#P<0.05，與VC組比較，compared with varicocele model post-treatment；△P<0.05，與低劑量人參皂苷Rg1組比較，compared with low-dose ginsenoside Rg1

2.3 TUNEL法檢測結(jié)果 假手術(shù)組見生精小管內(nèi)少量胞核呈棕色的凋亡細胞，主要是初級精母細胞；VC組可見管腔內(nèi)各級生精細胞數(shù)量均減少，排列稀疏、紊亂，在各級生精細胞均可見胞核呈棕色的凋亡細胞；人參皂苷Rg1干預組的生精細胞排列較紊亂，細胞數(shù)略減少，可見散在棕色凋亡細胞，以初級精母細胞為主，見圖4。人參皂苷Rg1干預組AI值均低于VC組，高于假手術(shù)組，高劑量人參皂苷Rg1組AI值低于低劑量人參皂苷Rg1組(P<0.05)。各組凋亡指數(shù)見表1。

圖4 各組睪丸組織生精細胞凋亡情況(×400)A：假手術(shù)組；B：VC組；C：低劑量人參皂苷Rg1組；D：高劑量人參皂苷Rg1組Fig.4 Apoptosis of spermatogenic cells in testicular tissue of rats in each group(×400)A:Sham operation; B:Varicocele model; C:Low-dose ginsenoside Rg1; D:High-dose ginsenoside Rg1

3 結(jié)論

精索靜脈曲張是青年男性人群中常見的一種泌尿生殖疾病，WHO把其列為男性不育的首要原因[7]。精索靜脈曲張可通過引起血管活性物質(zhì)增加、睪丸微循環(huán)障礙、氧自由基增多、NO、缺氧、免疫異常等多種途徑共同作用進而導致男性不育，而上述這些途徑均可間接或直接的誘發(fā)生精細胞異常凋亡[8]。細胞凋亡是多種內(nèi)外因素激活細胞內(nèi)預存的死亡程序而導致的細胞死亡的過程，這一過程涉及很多基因的表達以及相互調(diào)控[9]，正常的機體活動中也存在細胞凋亡，這是機體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本方式。在正常生精過程的各個階段存在自發(fā)或誘發(fā)的生精細胞凋亡，以此來維持生精細胞和支持細胞間的適當比例，從而保證正常的生育能力[10]。精索靜脈曲張發(fā)生時，多種內(nèi)外因素可以直接或間接地誘發(fā)生精細胞發(fā)生異常凋亡，從而導致生精過程中精子生成減少，進而可能導致不育。Simsek等[11]的研究中，采用TUNEL法檢測睪丸組織樣本，結(jié)果顯示VC組凋亡細胞的比率(14.7%)明顯高于對照組(2%)。潘連軍等[12]研究表明，VC大鼠的各級生精細胞的凋亡都有明顯的增加，caspase-3的表達也明顯升高，而且這種變化在對側(cè)睪丸組織中也有呈現(xiàn)。成建軍等[13]的研究顯示，實驗性左側(cè)精索靜脈曲張大鼠睪丸組織抑凋亡因子Bcl-2的表達隨著VC持續(xù)時間的增加而減少，凋亡效應因子CytC、caspase-3的表達以及細胞凋亡指數(shù)都隨著VC持續(xù)時間的增加而增加。綜上可見，精索靜脈曲張時抑制凋亡因子 Bcl-2的表達減少，作為凋亡執(zhí)行因子的caspase-3的表達增加，從而加劇了睪丸生精細胞的凋亡，造成生精功能障礙，影響生育能力。本實驗研究中也證實精索靜脈曲張可降低Bcl-2表達(P<0.05)，提高caspase-3的表達(P<0.05)，進而影響生精細胞凋亡。目前對于精索靜脈曲張致不育的機制已進行了大量的研究，但關(guān)于此藥物治療的研究報道卻相對較少，而且作為主要手術(shù)療法，對于精索靜脈相關(guān)不育癥的治療效果并不理想，術(shù)后患者精液質(zhì)量改善率僅有65%左右[14]，仍有相當一部分患者精液質(zhì)量并沒有明顯改善，因此尋找一種藥物來輔助或替代手術(shù)來治療VC相關(guān)不育癥成為臨床需要。

人參皂苷Rg1是近年來相關(guān)領(lǐng)域的一個研究熱點，是人參皂苷的主要活性成分之一，其不但具有抗氧化、促進神經(jīng)和血管再生等作用，而且還具有抗細胞凋亡以及生精保護方面作用。張大雷等[15]研究表明人參皂苷可以通過抗氧化作用阻止生殖細胞的脂質(zhì)過氧化和清除自由基并維持正常的抗氧化體系，從而保護氧化應激所導致的睪丸生精細胞的氧化損傷。許慧等[16]對人參皂苷Rg1及其代謝產(chǎn)物對生精保護作用的研究顯示：人參皂苷Rg1可顯著降低損傷睪丸組織的活性氧水平并能在一定程度上改善棉酚造成的睪丸組織的結(jié)構(gòu)損傷，提示其對精子生成有明顯保護作用，從形態(tài)學上直觀顯示了其對睪丸組織有不同程度的修復作用，從而保護睪丸的正常生精功能。Li等[17]、Cho等[18]研究證實人參皂苷Rg1可通過調(diào)制凋亡相關(guān)基因的表達、降低活性氧水平、抑制caspase-3的激活等途徑，發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。

本實驗結(jié)果表明，人參皂苷Rg1可以顯著提高睪丸生精細胞Bcl-2的表達，同時下調(diào)caspase-3的表達，減少精索靜脈曲張所致的生精細胞凋亡，形態(tài)學上也直觀地顯示了其對睪丸組織損害的修復作用，對提高VC患者的生精功能有重要意義，也為臨床探索VC相關(guān)不育癥的治療提供了新思路。該實驗對人參皂苷Rg1對于VC所致的生精細胞凋亡是否具有保護作用及其機制進行了初步的探究，其具體藥效濃度和作用時間還不十分確定，仍有待進一步研究。

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(編校：王儼儼)

Effect of ginsenoside Rg1 on spermatogenic cell apoptosis and expressions of Bcl-2 and caspase-3 in adolescent rats with experimentally induced varicocele

LI Yang-zhou1, ZHANG Da-tian2Δ

(1.School of Graduates, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China; 2.Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the apoptosis of spermatogenic cell in rats with experimentally induced varicocele.MethodsA total of 32 adolescent male Wistar rats were included and randomly divided into 4 groups, including sham operation, left varicocele induced, left varicocele induced and low-dose ginsenoside Rg1(5 mg/kg), left varicocele induced and high-dose ginsenoside Rg1 (10 mg/kg), 8 rats in each group.The experimentally induced varicocele was established by Turner method.4 weeks after modeling, the two treatment groups

ginsenoside Rg1 of different dosages by gavage and sham operation and left varicocele induced group received the same volume of NS by gavage, once daily.4 weeks after gavaging, the rats were sacrificed then tissue from left testicle were taken, and the spermatogenic cell apoptosis was detected by TUNEL and Bcl-2 and caspase-3 expressions were detected by immunohistochemistry.ResultsThe protein level of Bcl-2 in ginsenoside Rg1 intervention group was significantly higher than varicocele group, and it was obviously higher in high-dose ginsenoside Rg1 group than low-dose ginsenoside Rg1 group (P<0.05).However, the expression of caspase-3 in ginsenoside Rg1 intervention group was significantly lower than varicocele group, but was higher than sham operation, the expression of caspase-3 in high dose ginsenoside Rg1 group was obviously lower than low dose ginsenoside Rg1 group (P<0.05).The apoptotic index was lowest in sham operation, and which was significantly lower in ginsenoside Rg1 intervention group than varicocele group, and the apoptotic index in high-dose ginsenoside Rg1 group was obviously lower than low-dose ginsenoside Rg1 group (P<0.05).ConclusionGinsenoside Rg1 could significantly reduce the testicular sperm cells apoptosis in experimental varicocele rats, raise the Bcl-2 gene expression and inhibiting the expression of caspase-3.

varicocele; apoptosis; ginsenoside Rg1; Bcl-2; caspase-3

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.11

遼寧省教育廳科學研究項目(L2014337)

李洋洲，男，碩士，研究方向：泌尿外科學，E-mail: 18841609821@163.com；張大田，通信作者，男，碩士，教授，研究方向：精索靜脈曲張及腎癌，E-mail：jzzdt@sohu.com。

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