Ser473-Akt磷酸化介導阿托伐他汀保護大鼠腦缺血再灌注損傷

陶希，盧偉，胡治平，宋濤，鄧景貴，蔡華安，王淑玲，劉佳

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Ser473-Akt磷酸化介導阿托伐他汀保護大鼠腦缺血再灌注損傷

陶希1，盧偉2，胡治平2，宋濤1，鄧景貴1，蔡華安1，王淑玲1，劉佳1

［摘要］目的探討Akt之Ser473位點（Ser473-Akt）磷酸化在阿托伐他汀保護大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用。方法40只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分成正常組（n=10）、假手術組（n=10）、缺血再灌注（I/R）組（n=10）和干預組（n=10）。采用線栓法制作大鼠腦缺血2h再灌注72h模型。正常組和假手術組不做任何處理，I/R組僅生理鹽水灌胃，干預組在再灌注后大鼠蘇醒時、24h、48h分別予生理鹽水配制的阿托伐他汀10mg/kg灌胃。72h時處死所有大鼠，留取腦標本分別行HE染色及TUNEL染色，Western blotting檢測腦前額葉皮質Akt及其Ser473-Akt表達。結果缺血再灌注72h后，干預組神經細胞形態(tài)學變化較I/R組減輕；干預組凋亡陽性細胞數顯著少于I/R組（t=-6.014，P＜0.001）；I/R組前額葉皮質Ser473-Akt較正常組和假手術組顯著增加（t＞20.327，P＜0.001），而干預組明顯高于I/R組（t=3.649，P=0.007）。結論Ser473-Akt磷酸化在阿托伐他汀的神經細胞保護中起重要作用，通過抑制凋亡減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。

［關鍵詞］腦缺血/再灌注；Ser473-Akt；磷酸化；阿托伐他?。患毎蛲?；大鼠

［本文著錄格式］陶希，盧偉，胡治平，等.Ser473-Akt磷酸化介導阿托伐他汀保護大鼠腦缺血再灌注損傷［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（6）：655-659.

CITED AS：Tao X，Lu W，Hu ZP，et al.Protective effect of Ser473-Akt phosphorylation mediated atorvastatin on cerebral ischemia -reperfusion injury in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（6）：655-659.

腦缺血再灌注損傷是一個非常復雜的病理生理過程。缺血后腦組織再灌注損傷與快速級聯(lián)反應有關，如氧化應激、鈣離子超載、凋亡基因激活、興奮性氨基酸與炎癥介質釋放等，這些機制均可加重原有的缺血損傷，導致神經細胞進一步死亡［1-3］。其治療一直是臨床上的難點。阿托伐他汀是多臟器缺血研究中比較熱門的藥物，具有非膽固醇依賴性的抗炎、抗興奮毒素、抗氧化、抗血小板聚集及免疫調節(jié)等多向性功能［4-6］，在臨床上已普遍應用于腦梗死急性期的治療及二級預防［7］?；A研究發(fā)現，阿托伐他汀對缺血再灌注大鼠腦組織有保護作用，其機制可能與下調12/ 15-LOX、p38MAPK及cPLA2表達，降低血腦屏障的通透性等有關［8］。但是，關于阿托伐他汀神經細胞保護作用的研究仍不夠深入，本研究從Akt之Ser473位點（Ser473-Akt）磷酸化角度探討其在凋亡抑制水平的保護作用。

1　材料和方法

1.1實驗動物及分組

40只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量220～250g，合格證號：SCXK（湖南）2009-0004，由湖南斯萊克景達有限公司提供。實驗前飼養(yǎng)1周。根據實驗動物保護協(xié)議和章程，所有大鼠在合適的溫度及濕度條件下自由飲水和進食。實驗前根據隨機數字表將大鼠分成正常組（n=10）、假手術組（n=10）、缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）組（n=10）和干預組（n=10）。

1.2方法

1.2.1造模

參考Longa提出的線栓法制作可逆性大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型并加以改進［9］。大鼠稱重，以10%水合氯醛350mg/kg腹腔麻醉，仰臥位固定于手術臺上，頸前緣備皮并絡合碘消毒，頸前正中切口約1.5cm，鈍性分離皮下組織，暴露右側頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）及頸內動脈（internal carotid artery，ICA），仔細分離迷走神經，結扎CCA近心端和ECA根部，微動脈夾夾住ICA，在CCA靠近分叉處置一絲線備用。在CCA距離分叉約2cm處剪一斜向切口，將標記好的前端圓鈍的栓線沿切口插入并經過分叉處進入ICA內，扎緊CCA分叉前預置的絲線，松開微動脈夾，繼續(xù)沿入顱方向緩慢插入栓線，微感阻力時即停止，插入深度距離CCA分叉處約（18.0±2.0）mm，表明栓線已經阻斷大腦中動脈主干血流。再將原分叉處備用線扎活結。縫合皮膚，栓線尾端固定于皮膚上。缺血達2h即小心抽出栓線，形成再灌注。在缺血期間及再灌注后2h保持肛溫（37±0.5）℃。

I/R組和干預組采用此MCAO模型。假手術組僅將栓線插入ICA約10mm，其余步驟相同。凡手術中動物死亡、蛛網膜下腔出血或無神經功能缺損者均視為模型制作失敗，不計在內，再以同一批次的大鼠制成合格模型后補足數量。

1.2.2神經功能缺損評分

采用Longa法進行神經功能缺損評分［10］。0分：正常，無神經損傷癥狀。1分：不能完全伸展左側前爪。2分：行走時向左側轉圈。3分：行走時向左側傾倒。4分：不能自發(fā)行走，或意識喪失。其中，0分和4分者被剔除。

1.2.3干預方法

正常組和假手術組不做藥物處理，干預組以適量生理鹽水稀釋的阿托伐他汀10mg/kg（輝瑞公司）灌胃，I/R組以等體積生理鹽水灌胃。灌胃時間：大鼠蘇醒時，再灌注后24h和48h。

1.2.4HE染色及TUNEL染色

再灌注72h，取各組大鼠5只，以10%水合氯醛350mg/kg腹腔麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，以鈍性針頭插入左心室，剪開右心耳，先以生理鹽水300ml快速沖洗，再以4%多聚甲醛PBS緩沖液400ml行心臟灌注，致肝臟變白時停止，取腦組織浸泡于4%多聚甲醛PBS緩沖液，4℃保存過夜，然后進行梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，片厚5 μm。取前額葉腦組織作為觀察對象。取相鄰組織分別行HE染色，顯微鏡下觀察腦組織的病理改變。每張切片用高倍鏡（400×）隨機觀察8個不同視野［11］。

根據TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（顯色法）（江蘇碧云天生物技術有限公司）進行染色。石蠟切片經梯度酒精脫蠟；滴加20μg/ml不含DNase酶的蛋白酶K，37℃溫箱作用15～30min，PBS洗滌；加新鮮配制的3%H2O2置室溫孵育10min，PBS洗滌；配制新鮮生物素標記液，在每個樣品上滴加標記緩沖液50 μl，置暗盒中保持切片濕潤，37℃孵育60min，PBS洗滌；滴加標記反應終止液0.2ml，室溫孵育10min，PBS洗滌；配制Streptavidin-HRP工作液及DAB顯色液，在每個樣品上滴加Streptavidin-HRP工作液50 μl，置暗盒中保持切片濕潤，室溫孵育30min，PBS洗滌；滴加DAB顯色液0.3ml，室溫孵育，根據顯色結果孵育適當時間，一般30～60min，PBS洗滌；常規(guī)梯度酒精脫水透明，封片。光鏡下，切片中呈棕褐色的為凋亡陽性細胞，高倍鏡下每張切片計數8個不同視野的陽性細胞數，取平均值。

1.2.5腦皮質標本的處理及Western blotting檢測

再灌注72h，取各組大鼠5只，以10%水合氯醛350mg/kg腹腔麻醉，開顱取腦，置于冰面上，快速分離距離額極5mm的梗死邊緣區(qū)腦皮質，取約組織200mg置-80℃冰箱保存。

取上述冰凍腦組織約50mg行液氮碾磨，經細胞裂解液充分處理，再冰上超聲、離心及變性等處理。采用BCA法（江蘇碧云天生物技術有限公司）檢測蛋白濃度。SDS-PAGE（美國BIO-RAD公司）分離蛋白質，并轉膜。將膜置于5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，室溫搖床約2h。將膜分別與Akt單抗（兔抗鼠，1：900，SIGMA公司）和Ser473-Akt單抗（兔抗鼠，1：800，SIGMA公司）結合，4℃孵育過夜。第二天以TBST液洗去一抗。再將膜與二抗（山羊抗兔，1：2000，北京中山金橋公司）充分結合約2.5h，洗去二抗。使用β-actin作為內參（北京中山金橋公司）。采用暗盒顯影設備及Quantity One軟件分析條帶相對灰度值，圖片以.tif格式保存。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有計量資料采用（±s）表示，兩獨立樣本間比較采用t檢驗。方差齊時，采用單因素方差分析；方差不齊時，采用Games-Howell方法分析。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1HE染色

正常組與假手術組額葉前皮質區(qū)結構正常，神經細胞排列緊密，胞漿豐富，核仁清晰。I/R組腦組織神經細胞稀疏、形態(tài)不規(guī)則，細胞皺縮，胞核固縮深染，甚至部分核消失。干預組上述改變有所減輕。見圖1。

2.2TUNEL染色

正常組及假手術組僅見極少TUNEL陽性細胞。I/ R組TUNEL陽性細胞散在于整個缺血半暗帶，分布欠均勻，部分區(qū)域相對集中，高倍鏡下胞核呈棕褐色的為陽性細胞。與正常組及假手術組比較，I/R組陽性細胞數顯著增加（P＜0.001）；干預組陽性細胞數顯著少于I/R組（P＜0.001）。見表1、圖2。

2.3Western blotting檢測

各組間Akt表達無顯著性差異（P＞0.05）。正常組和假手術組Ser473-Akt表達無顯著性差異（P＞0.05）。I/ R組Ser473-Akt表達較正常組和假手術組均顯著升高（P＜0.001）；干預組Ser473-Akt表達明顯高于I/R組（P＜0.01）。見表2、圖3。

圖1　HE染色觀察病理組織學（400×）

圖2　TUNEL染色檢測凋亡細胞（400×）

表1　各組TUNEL染色陽性細胞比較（n）

表2　各組Western blotting檢測Akt和Ser473-Akt的表達

圖3　各組Western blotting檢測Akt和Ser473-Akt變化

3　討論

PI3K/Akt信號通路對細胞增殖和凋亡起關鍵作用。PI3K是細胞內重要信號傳導分子，可被細胞因子、生長因子及激素等細胞外信號激活，Akt作為PI3K下游的主要靶因子，在促進細胞存活、增殖、代謝及抑制細胞凋亡等方面扮演重要角色。Akt分子由3部分組成，從氨基端（N-）至羧基端（C-），分別為PH域、激酶域和調節(jié)域。其中激酶域Thr308和調節(jié)域Ser473的磷酸化作用是激活Akt的必要條件［12-13］。一般認為，當細胞外因子與酪氨酸激酶受體結合后，PI3K移至漿膜并活化，再促使PIP2轉化為PIP3，并在細胞內聚集，后者與PDK1的PH域結合后，使PDK1活化，此時激酶域Thr308發(fā)生磷酸化（細胞膜外），之后是PDK2活化及Ser473的磷酸化（細胞質內）［13-14］。Kroner等研究發(fā)現，Thr308和Ser473的磷酸化作用是前后相繼進行的，互相獨立［15］。所以，Akt活性的最終實現需要Ser473的磷酸化，眾多研究中把測定Ser473-Akt的水平作為Akt活化的主要標志，可反映活性Akt的整體量［16-17］。本研究亦以此位點作為觀察Akt活性的標準。

研究發(fā)現，在大鼠腦缺血再灌注應激反應中，PI3K/Akt信號通路對細胞增殖及抗凋亡等發(fā)揮重要作用。其機制可能與以下幾點有關［18-20］。①參與糖原和蛋白質的合成，如糖原合成激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）是PI3K/Akt關鍵作用底物，其失活則抑制糖原合成。②促進細胞存活，如抑制P53活性，促進神經元存活；③抑制細胞凋亡，具體途徑包括Bad通路、caspase通路、FKHR通路及I κ K激酶等；④與其他信號通路交聯(lián)。這些下游信號蛋白在Akt被激活后發(fā)揮重要作用，從而促進細胞增殖及凋亡抑制。

阿托伐他汀是一種3-羥基-3-戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，具有非膽固醇依賴性的細胞增生分化、抗炎、免疫調節(jié)等多向性功能，是減少臨床心腦血管事件的關鍵藥物之一［4-7］。其中，PI3K/Akt信號通路亦是其作用機制的研究熱點之一。Cheng等研究GK大鼠心肌缺血再灌注，發(fā)現小劑量阿托伐他汀后處理可以明顯減輕心肌線粒體超微結構損傷，降低梗死面積，其機制可能與激活PI3K/Akt信號途徑有關［21］。Ding等體外培養(yǎng)大鼠乳鼠皮質神經元，再使用谷氨酸誘導皮質神經元凋亡，結果發(fā)現阿托伐他汀干預能對抗谷氨酸的毒性作用，減少神經元凋亡，增加細胞存活率，其機制也與激活PI3K/Akt信號通路有關［22］。阿托伐他汀對缺血腦組織及再灌注損傷的保護作用已被廣大研究者接受，但其保護作用是否亦與PI3K/Akt信號途徑有關，相關文獻報道較少。

本研究結果顯示，各組間總Akt表達水平無明顯差異，與既往研究結果一致［21-22］。正常組和假手術組均有少量Ser473-Akt表達，但兩組間比較無顯著性差異，排除了手術本身對蛋白表達的影響。I/R組缺血2h再灌注72h后，Ser473-Akt表達較前兩者明顯增加，提示Ser473-Akt作為內源性因子對大鼠腦缺血再灌注損傷72h時仍有自身保護效應。當使用阿托伐他汀10mg/kg干預后，我們發(fā)現缺血再灌注72h時Ser473-Akt表達較I/R組進一步增加，提示阿托伐他汀有促進Ser473-Akt磷酸化作用，有利于神經細胞增殖，減少凋亡，從而減輕缺血應激對腦組織的損傷。但是，阿托伐他汀促進Ser473-Akt磷酸化作用的上游機制尚不清楚。

根據HE染色，本研究發(fā)現阿托伐他汀干預可以明顯減輕再灌注所造成的腦組織病理損傷。同時，本研究采用TUNEL染色半定量分析了阿托伐他汀干預對凋亡細胞的影響，結果發(fā)現神經細胞凋亡明顯減少，提示阿托伐他汀保護鼠腦缺血再灌注損傷的機制與抑制神經細胞凋亡有關。據此，我們推測Ser473-Akt磷酸化可能在其中扮演著重要角色，進一步檢測Ser473-Akt下游凋亡相關蛋白的表達會更有意義。

綜上所述，Ser473-Akt磷酸化在阿托伐他汀的神經細胞保護中起重要作用，通過促進神經細胞增殖及凋亡抑制，從而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。其具體上下游機制有待進一步研究。

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Protective Effect of Ser473-Akt Phosphorylation Mediated Atorvastatin on Cerebral Ischemia -reperfusion Injury in Rats

TAO Xi1，LU Wei2，HU Zhi-ping2，SONG Tao1，DENG Jing-gui1，CAI Hua-an1，WANG Shu-ling1，LIU Jia1

1.Department of Rehabilitation Medicine，Mawangdui Hospital of Hunan Province，Changsha，Hunan 410016，China；2.the Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha，Hunan 410011，China

Correspondence to LIU Jia.E-mail：1270168367@qq.com

Abstract：Objective To investigate the effect of Ser473-Akt phosphorylation in the protection of atorvastatin to cerebral ischemia-reperfusion（I/R）injury in rats.Methods Forty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group（n=10），sham group（n=10），I/R group（n=10）and intervention group（n=10）.A model of cerebral ischemia-reperfusion in rats was establishied，with ischemia for 2 hours and reperfusion for 72 hours.The normal group and the sham group received no injury.I/R group was administered with normal saline only，and the intervention group received atorvastatin 10mg/kg prepared with normal saline at palinesthesia，24 and 48 hours after reperfusion.All rats were sacrificed 72 hours after reperfusion.HE staining and TUNEL staining were performed in the brain specimens.The expression of Akt and Ser473-Akt in the prefrontal cortex of the brain were detected with Western blotting.Results Compared with I/R group，72 hours after reperfusion，the damage of nerve cells significantly lessened in the intervention group；the apoptosis positive cells significantly reduced in the intervention group（t=-6.014，P＜0.001）.The expression of Ser473-Akt in prefrontal cortex was higher in I/R group than in the normal group and the sham group（t＞20.327，P＜0.001），and was higher in the intervention group than in I/R group（t=3.649，P=0.007）.Conclusion The Ser473-Akt phosphorylation plays an important role in the protection of atorvastatin in nerve cell through anti-apoptosis of nerve cells，and reducing cerebral I/R injury.

Key words：cerebral ischemia-reperfusion；Ser473-Akt；phosphorylation；atorvastatin；apoptosis；rats

［中圖分類號］R743.3

［文獻標識碼］A

［文章編號］1006-9771（2016）06-0655-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.007

基金項目：湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃項目（No.B2010-090）。

作者單位：1.湖南省馬王堆醫(yī)院康復醫(yī)學科，湖南省老年醫(yī)學研究所，湖南長沙市410016；2.中南大學湘雅二醫(yī)院神經內科，湖南長沙市410011。

作者簡介：陶希（1981-），男，漢族，安徽樅陽縣人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：腦血管病康復的基礎和臨床。通訊作者：劉佳，女，本科，主任醫(yī)師，主要研究方向：神經康復。E-mail：1270168367@qq.com。

收稿日期：（2015-12-01修回日期：2016-01-22）