輪作模式對植煙土壤酶活性及真菌群落的影響

陳丹梅, 段玉琪,楊宇虹, 晉　艷, 袁　玲,*

1 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶　400716 2 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明　650031

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輪作模式對植煙土壤酶活性及真菌群落的影響

陳丹梅1, 段玉琪2,楊宇虹2, 晉艷2, 袁玲1,*

1 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400716 2 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明650031

摘要:種植模式顯著影響土壤理化生物學(xué)性質(zhì)，并與作物土傳真菌病害的發(fā)生密切相關(guān)。試驗(yàn)選擇云南省具有代表性的紅壤，設(shè)置烤煙-休閑-玉米(T-B-M)、烤煙-油菜-玉米(T-C-M)、烤煙-油菜-水稻(T-C-R)和烤煙-苕子-水稻(T-V-R)等4種輪作模式，利用化學(xué)、酶學(xué)分析及454高通量測序技術(shù)，研究了土壤養(yǎng)分、酶活性及真菌群落結(jié)構(gòu)，旨在為烤煙的合理輪作提供科學(xué)依據(jù)。經(jīng)16a的不同輪作種植后，土壤pH變化于5.6—6.4之間，仍然適合種植水稻、玉米、油菜和烤煙等多種作物。在T-V-R處理的土壤中，烤煙產(chǎn)量、煙葉產(chǎn)值和上中等煙比例最高，有機(jī)質(zhì)比原初提高45.11%，堿解氮、有效磷和微生物量碳氮顯著增加，蔗糖酶、脫氫酶、脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性也顯著高于其它輪作模式，說明T-V-R改善了土壤生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)了微生物繁衍，數(shù)量增加，活性增強(qiáng)。土壤真菌的18S rDNA讀數(shù)依次為13097(T-B-M)、11345(T-C-M)、12939(T-C-R)和13763(T-V-R)，分別代表530、378、395和581種(類)的真菌，由子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門、壺菌門和尚待鑒定的真菌等構(gòu)成，其中尚待鑒定的真菌屬種和子囊菌門占絕大部分。在不同輪作處理的土壤中，前15種優(yōu)勢真菌的豐富度變化于29.46%—62.86%之間，優(yōu)勢菌株的相似性極低，說明土壤真菌的種群結(jié)構(gòu)因輪作模式不同而異。T-V-R處理土壤中的真菌多樣性指數(shù)最高，優(yōu)勢度指數(shù)最低，說明T-V-R輪作的土壤適合多種真菌的繁殖生長，種群數(shù)量增加。多種真菌共同存在，互相制約，可防止病原真菌過度繁殖，降低作物發(fā)生真菌病害幾率。從作物產(chǎn)量和產(chǎn)值、土壤有機(jī)質(zhì)、養(yǎng)分和真菌種群結(jié)構(gòu)看，T-V-R優(yōu)于其它3種輪作模式，值得推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：輪作；土壤；養(yǎng)分；真菌；多樣性

同一作物或近緣作物長期連續(xù)種植會(huì)造成土壤養(yǎng)分異常積累或過度消耗，病原微生物迅速繁衍，化感物質(zhì)積累，土壤微生物種群結(jié)構(gòu)失衡，作物產(chǎn)量品質(zhì)降低和病害嚴(yán)重發(fā)生等[1]。因此，多種作物輪作輔以休閑一般優(yōu)于種植單一作物，研究不同輪作模式對土壤物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)的影響，可為合理輪作提供科學(xué)依據(jù)。

在我國熱帶和亞熱帶地區(qū)，通常采用一年三熟或兩年五熟的高強(qiáng)度土壤利用模式，需要大量施用化肥，導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)減少，結(jié)構(gòu)破壞，病害嚴(yán)重[2]。馬鈴薯長期連作后，根際土壤中的細(xì)菌數(shù)顯著低于其他種植模式，但真菌則相反，作物發(fā)生真菌病害的風(fēng)險(xiǎn)提高[3]。玉米連作年限不同，根際微生物的數(shù)量、種群和多樣性也不一樣。隨著連作時(shí)間延長，它們的數(shù)量和種群減少，多樣性逐漸降低[4]。烤煙長期連作，提高黑脛病和青枯病的發(fā)病率，降低煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量[5]。相反，輪作則能有效中斷病原菌寄主，降低作物病害發(fā)生率[5- 7]。值得注意的是，輪作模式不同，對土壤物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)的影響也不一樣。連續(xù)5a實(shí)施水稻-油菜輪作，土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著高于水稻-小麥和水稻-黑麥草輪作[8]。在我國東北黑土上，實(shí)施黃瓜連作、小麥-黃瓜和毛苕子-黃瓜輪作，輪作顯著增加根際細(xì)菌種類，但減少結(jié)瓜后期的真菌種群，尤以毛苕子-黃瓜輪作最為顯著[9]。微生物是土壤的重要組成部分，釋放多種酶類，參與土壤有機(jī)質(zhì)降解、腐殖質(zhì)合成和養(yǎng)分循環(huán)等生物化學(xué)過程[10]。土壤微生物數(shù)量和種群隨種植植物的種類不同而發(fā)生變化，作物根系分泌物和凋落物對土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響[11]，并與土傳病害密切相關(guān)[12]。

在微生物生態(tài)學(xué)研究中，利用Roche Genome Sequencer FLX測序平臺(tái)進(jìn)行454高通量測序是重要的分子生物學(xué)手段。該方法通過測定微生物保守性較高的16S rDNA和18S rDNA序列，并與基因庫中的已知序列進(jìn)行對比，能準(zhǔn)確、快速、靈敏地確定待測微生物屬種。自454高通量測序技術(shù)應(yīng)用以來，已檢測出數(shù)百至數(shù)千種土壤微生物，是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所獲得微生物數(shù)量的數(shù)十倍甚至數(shù)百倍。此外，該方法還能檢測出不可培養(yǎng)的微生物[13]。云南省是我國烤煙主產(chǎn)區(qū)，烤煙輪作比例達(dá)80%以上，煙地夏季主要輪作玉米和水稻，分別占種植面積的64.7%和27.6%，冬季一般種植油菜和綠肥或休閑[14]。選擇科學(xué)的輪作模式有益于減輕連作障礙，是保持土地生產(chǎn)力和保障整個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)健康和持續(xù)發(fā)展的重要措施[15]。因此，本研究以云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的長期輪作試驗(yàn)為對象，采用化學(xué)、酶學(xué)方法及454高通量測序技術(shù)，揭示了云南煙區(qū)主要輪作模式對作物產(chǎn)量和產(chǎn)值、土壤養(yǎng)分、酶活性及真菌種群結(jié)構(gòu)的影響，為合理選擇烤煙輪作模式奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研究和試驗(yàn)基地位于北緯24°14′，東經(jīng) 102°30′，海拔1680 m，年均溫度15.9℃，年降雨量918mm，雨季(4—9月)降雨量占全年的79.5%，年日照時(shí)數(shù)2072h。供試土壤為云南省典型、具有代表性的砂質(zhì)紅壤，基礎(chǔ)土壤的pH6.4，有機(jī)質(zhì)10.70 g/kg，全氮0.54 g/kg，全磷0.11 g/kg，全鉀6.43 g/kg，有效氮82.0 mg/kg，有效磷 9.01 mg/kg，有效鉀160.0 mg/kg。

1.2試驗(yàn)處理

試驗(yàn)始于1998年，設(shè)置云南普遍采用的4種種植模式，包括烤煙-休閑-玉米(T-B-M)、烤煙-油菜-玉米(T-C-M)、烤煙-油菜-水稻(T-C-R)和烤煙-苕子-水稻(T-V-R)等。小區(qū)面積28m2，重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列?？緹?、玉米和水稻一般在5月初移栽，苕子和油菜秋末播種。根據(jù)當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)情況，烤煙施用純氮105kg/hm2，P2O574 kg/hm2，K2O 263 kg/hm2；油菜施用純氮90kg/hm2，P2O530 kg/hm2；玉米和水稻施用純氮112.5kg/hm2，P2O540 kg/hm2；苕子施用純氮75kg/hm2。此外，水稻、玉米和油菜秸稈全部切碎還田；綠肥收割多次，未徹底收割的殘樁全部翻壓入土。在烤煙種植季節(jié)，基肥由N∶P2O5∶K2O=10∶10∶25烤煙專用肥提供，施氮量占施肥總量的70%；剩余30%的氮素由烤煙專用追肥(N∶P2O5∶K2O = 10∶0∶25)提供，在移栽后7—10d和30—40d均分兩次穴施。在玉米、油菜及苕子種植季節(jié)，化學(xué)氮磷分別由尿素和過磷酸鈣提供。其中，玉米和油菜70%的氮和全部磷肥作基肥，剩余30%的氮分別在油菜云苔期和玉米大喇叭口期作追肥穴施，苕子全施基肥。

1.3土樣采集與分析

在不同輪作模式中，栽種或休閑是其中的重要環(huán)節(jié)，它們均可能改變土壤理化生物學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而影響后季作物-烤煙生長發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)。因此，試驗(yàn)于2014年春季油菜和苕子旺長期，采集0—20cm的耕層土壤(含休閑處理)，揀去雜物。部分土壤立即液氮冷凍備測微生物量碳氮和真菌18S rDNA序列，另取部分土壤風(fēng)干，常規(guī)分析土壤pH、有機(jī)質(zhì)和堿解氮、有效磷和有效鉀[16]。微生物量碳氮采用氯仿熏蒸-0.5mol/L K2SO4提取，用K2Cr2O7氧化法測碳和腚酚藍(lán)比色法測氮[17]。分別用3,5-二硝基水楊酸比色法、磷酸苯二鈉比色法、腚酚藍(lán)比色法、高錳酸鉀滴定容量法和TTC比色法測定土壤蔗糖酶、磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶和脫氫酶活性[18]。

提取土壤樣品中的真菌18S rDNA，接著采用真菌18S區(qū)段中V5—V7區(qū)的通用引物0817F(5′- TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)和1196R(5′- TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。再參照454高通量測序方法，純化、定量和均一化真菌18S rDNA，送上海美吉生物科技有限公司利用Roche Genome Sequencer FLX測序平臺(tái)進(jìn)行測序[19]。然后，對有效序列進(jìn)行去雜、修剪、去除嵌合體序列等過濾處理，得到優(yōu)化序列，通過聚類分析形成分類單元(operational taxonomic units, OTUs)，采用BLAST程序?qū)Ρ菺enBank(http://ncbi.nlm.nih.gov)中的已知序列，根據(jù)97%的相似度確定18S rRNA基因序列對應(yīng)的真菌屬(種)名稱。

于2014年烤煙收獲季節(jié)，分葉位采收煙葉，三段式烘烤，按煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)定價(jià)，記錄上、中、下等煙葉產(chǎn)量，均價(jià)和產(chǎn)值。

1.4數(shù)據(jù)處理

利用土壤真菌屬(種)數(shù)(OTUs)和18S rDNA序列數(shù)(Reads)計(jì)算土壤真菌的種群特征值，包括多樣性指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)。

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H的計(jì)算公式為：

式中,Sobs為得到的OTUs的總數(shù)量；ni為真菌i的OTUs數(shù)量；N為得到的真菌的總數(shù)量。

Simpson優(yōu)勢度指數(shù)D的計(jì)算公式為：

式中,Sobs為得到的OTUs的總數(shù)量；ni為真菌i的OTUs數(shù)量；N為得到的真菌的總數(shù)量[20- 21]。

真菌豐富度為某種真菌的18S rDNA讀數(shù)占真菌18S rDNA總讀數(shù)的百分?jǐn)?shù)[22- 23]。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行基本計(jì)算，SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性水平為P≤ 0.05。

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1煙葉產(chǎn)量、產(chǎn)值和上中等煙比例

在T-V-R處理的土壤中，煙葉的產(chǎn)量、產(chǎn)值和上中等煙比例都為最高，煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值相比T-C-M處理分別增加了22.88%和25.30%；與T-C-R處理相比，上中等煙比例提高了3.62%(表1)。

表1　不同輪作模式對烤煙產(chǎn)量，產(chǎn)值和上中等煙比例的影響

T-B-M：烤煙-休閑-玉米輪作 flue-cured tobacco-blank-maize crop rotation；T-C-M：烤煙-油菜-玉米輪作 flue-cured tobacco-canola-maize crop rotation；T-C-R：烤煙-油菜-水稻輪作 flue-cured tobacco-canola-rice crop rotation；T-V-R：烤煙-苕子-水稻輪作 flue-cured tobacco-vetch-rice crop rotation; 表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；在同一列中，有不同小寫字母者表示差異顯著，(P≤ 0.05)

2.2土壤pH、有機(jī)質(zhì)與有效養(yǎng)分

在不同輪作的土壤中，pH、有機(jī)質(zhì)和有效養(yǎng)分含量都不同程度的增加或無顯著變化(表2)。與原始土壤相比，T-B-M和T-C-M處理使土壤pH值顯著增加，最高為6.4，T-V-R和T-C-R處理對土壤的pH值無顯著影響；T-C-M、T-C-R和T-V-R分別使有機(jī)質(zhì)增加25.49%、16.23%和45.11%，T-B-M則無顯著變化；T-V-R顯著增加土壤堿解氮含量，為原始土壤的1.32倍；4種輪作處理均提高有效磷含量，為原始土壤的1.12—3.67倍；T-B-M的有效鉀含量最高，其余3種輪作的有效鉀含量與原始土壤相似。

表2　不同輪作模式對土壤pH、有機(jī)質(zhì)和有效養(yǎng)分的影響

表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；在同一列中，有不同小寫字母者表示差異顯著，(P≤ 0.05)

2.3土壤酶活

不同輪作模式對土壤酶活的影響各不相同(表3)。在T-V-R處理的土壤中，蔗糖酶、磷酸酶、脫氫酶、過氧化氫酶以及脲酶活性最高；在T-B-M、T-C-M和T-C-R處理的土壤中，蔗糖酶和脲酶活性分別變化于36.07—39.05和0.63—0.65之間，處理之間無顯著差異；在T-C-M處理的土壤中，磷酸酶和脫氫酶活性低于其余3種輪作處理；T-B-M和T-C-R處理的土壤中，過氧化氫酶活性無顯著差異，但顯著低于T-C-M和T-V-R。

表3　不同種植模式對土壤酶活性的影響

表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；在同一列中，有不同小寫字母者表示差異顯著(P≤ 0.05)

2.4微生物生物量

圖1可見，在T-V-R處理的土壤中，微生物碳含量最高，為170.0mg/kg；T-C-M和T-C-R處理微生物碳含量次之但無顯著差異，為117.2—119.4mg/kg；T-B-M最低，僅為61.9mg/kg。微生物氮含量的變化趨勢則有所不同，T-V-R和T-C-M含量最高，達(dá)到8.9—9.4mg/kg，其次為T-B-M，T-C-R含量最低。實(shí)施不同輪作處理后，土壤微生物量碳氮比變化于7.5—19.1之間。

圖1　種植模式對土壤微生物碳氮含量的影響Fig.1　Influence of rotation treatments on microbial C and N in soilT-B-M：烤煙-休閑-玉米輪作 flue-cured tobacco-blank-maize crop rotation；T-C-M：烤煙-油菜-玉米輪作 flue-cured tobacco-canola-maize crop rotation；T-C-R：烤煙-油菜-水稻輪作 flue-cured tobacco-canola-rice crop rotation；T-V-R：烤煙-苕子-水稻輪作 flue-cured tobacco-vetch-rice crop rotation

圖2　不同輪作處理的土壤中，真菌稀釋性曲線　Fig.2　Fungi rarefaction curves in soil under different rotation treatments

2.5土壤真菌2.5.1真菌稀釋曲線

隨機(jī)抽取測序樣品中的18S rDNA讀數(shù)(reads)，以真菌屬(種)數(shù)(OTUs)為縱坐標(biāo)，18S rDNA讀數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得稀釋曲線(圖2)[24]。結(jié)果表明，抽樣讀數(shù)大約在1500以下時(shí)，細(xì)菌種(屬)類數(shù)迅速增加；讀數(shù)在1500—4000之間，細(xì)菌種(屬)數(shù)緩慢增加；讀數(shù)超過4000之后，其種(屬)類數(shù)的增長逐漸趨于平緩。但是，細(xì)菌稀釋曲線因輪作處理不同而異，T-V-R最高，T-B-M次之，T-C-R和T-C-M最低，且?guī)缀踔丿B。

2.5.2真菌門類

在T-B-M、T-C-M、T-C-R和T-V-R處理的土壤中，454-高通量測序分別獲得了13097，11345，12939和13763個(gè)18S rDNA 序列，分別代表530、378、395和581種真菌(OTUs)，歸屬于子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)和尚待鑒定的類型 (表4)。其中，T-B-M、T-C-M和T-C-R 3個(gè)處理中待定真菌OTUs數(shù)量最多，占總OTUs數(shù)的46.03%—53.40%，其次是子囊菌門，比例為34.53%—37.22%；T-V-R處理中子囊菌OTUs數(shù)量最多，占總數(shù)的45.78%，其次是未知類型，占總數(shù)的39.76%。4個(gè)處理中，接合菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門合計(jì)約占總量的12.08%—15.61%。

表4　不同輪作處理土壤中真菌OTUs數(shù)量

*表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)；在同一行中，有不同小寫字母者表示差異顯著(P≤ 0.05)

2.5.3優(yōu)勢真菌

在各輪作處理的土壤中，前15種優(yōu)勢真菌的豐富度合計(jì)占總量的29.46%—62.86%，尚待鑒定的真菌豐富度高達(dá)6.21%—45.75%。其中，在T-C-M和T-C-R處理中，待定菌株最多，高達(dá)9株，累計(jì)豐富度分別為45.75%和41.09%；其次是T-B-M處理，待定真菌有7株，豐富度為21.92%；在T-V-R處理中，待定菌株數(shù)量最少，僅有5株，豐富度為6.21%(表5)。

在前15種優(yōu)勢菌株中，4種處理之間真菌屬(種)的相似性極低，無共同存在的真菌屬(種)，且每種處理特有的真菌種類均超過9種(表5)。此外，待定真菌-4(unclassified fungi-4)共同存在于T-B-M、T-C-R和T-V-R 3個(gè)處理中；枝孢菌(Cladosporium)同時(shí)存在于T-C-R和T-V-R處理中；T-B-M和T-V-R處理共有的真菌是尖孢鐮刀菌(Fusarium_oxysporum)、接合菌-1(Zygomycota-1)、鐮刀菌(Fusarium)和鏈格孢菌(Alternaria)；T-C-M和T-C-R處理共有的真菌為待定真菌-7(unclassified fungi-7)、待定真菌-10(unclassified fungi-10)、待定真菌-12(unclassified fungi-12)、待定真菌-14(unclassified fungi-14)。

2.5.4真菌群落特征值

在T-V-R的土壤中，真菌多樣性指數(shù)最高，高達(dá)5.34；T-B-M次之，為4.97；T-C-M和T-C-R最低，變化于4.10—4.28之間。但是，優(yōu)勢度指數(shù)T-C-R最高，達(dá)到0.04；T-V-R最低，僅0.01(表6)。

3討論

有機(jī)質(zhì)是土壤的重要成分，顯著影響土壤物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)。秸稈還田既可補(bǔ)充土壤有機(jī)質(zhì)和作物需要的養(yǎng)分，又能改良土壤理化生物學(xué)性質(zhì)[25]。在16年的長期輪作過程中，每年都有大量的秸稈還田，土壤有機(jī)質(zhì)和有效養(yǎng)分含量提高或無顯著變化，說明在高強(qiáng)度輪作種植條件下，輔以秸稈還田或冬季休閑均可保持或提高土壤生產(chǎn)力。此外，各輪作處理的有效磷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過原始土壤，故適量減施磷肥很有必要。土壤pH值變化于5.6—6.4，都處于適合多種作物生長的pH值范圍內(nèi)[26]。綜合作物產(chǎn)量、產(chǎn)值、土壤pH、有機(jī)質(zhì)和有效養(yǎng)分的狀況，以T-V-R種植模式最佳。

土壤有機(jī)質(zhì)是微生物的碳源和氮源[27]。在輪作處理的土壤中，每年都實(shí)施秸稈還田，各種作物秸稈腐解所釋放的有機(jī)質(zhì)組成具有多樣性，可滿足多種微生物，尤其是異養(yǎng)型微生物-真菌對碳源和養(yǎng)分的需要。在實(shí)施T-V-R輪作的處理中，水旱輪作，嫌/好氣交替，創(chuàng)造了適合多種微生物繁衍的不同土壤環(huán)境；加之烤煙、水稻和苕子的近緣性小，有機(jī)成分差異較大，可滿足不同微生物的碳源和營養(yǎng)需要，有益于它們的繁殖生長。此外，油菜為直根系，而苕子為須根系，后者根系發(fā)達(dá)，能分泌大量的單(多)糖、氨基酸和有機(jī)酸等碳水化合物，向根際微生物提供碳源，促進(jìn)其生長繁殖[28]。因此，在T-V-R土壤中，微生物量碳氮最高，18S rNDA讀數(shù)最大，真菌屬(種)類最多，土壤酶活性最強(qiáng)。脫氫酶、脲酶和磷酸酶活性與土壤微生物量呈顯著正相關(guān)，推測與土壤微生物的分泌作用有關(guān)，類似前人研究結(jié)果[29- 30]。

表5　在不同輪作土壤中，15種優(yōu)勢真菌的豐富度

表6各輪作處理土壤真菌群落特征值

Table 6Characteristic values of fungal communities in soil under different rotation treatments

種植模式Rotationmodals多樣性指數(shù)Diversityindex優(yōu)勢度指數(shù)DominantindexT-B-M4.97b0.02cT-C-M4.28c0.03bT-C-R4.10c0.04aT-V-R5.34a0.01d

表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)；在同一列中，有不同小寫字母者表示差異顯著，(P≤ 0.05)

在不同輪作處理的土壤中，微生物碳氮比相差2.5倍以上，意味著土壤微生物的組成結(jié)構(gòu)各不相同。本文采用454高通量測序方法，揭示了真菌從門類到屬(種)的組成、優(yōu)勢菌株、豐富度和多樣性特征等。結(jié)果表明，稀釋性曲線呈迅速增加-緩慢增加-逐漸平緩的變化趨勢，說明18S rDNA的樣本量和測序數(shù)據(jù)合理，準(zhǔn)確地反映了樣本中的真菌數(shù)及組成情況；稀釋曲線的峰值高低不一，意味著輪作處理影響了土壤真菌的多樣性。一般認(rèn)為，多樣性指數(shù)表示生物群落中的物種多寡，數(shù)值愈大表示群落中的物種越豐富；優(yōu)勢度指數(shù)越大，生物群落內(nèi)的奇異度越高，優(yōu)勢種群突出[31]。生物種群豐富和多樣性指數(shù)高是生態(tài)環(huán)境健康穩(wěn)定的重要表現(xiàn)[32]。在健康穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境中，生物多樣性指數(shù)較高，優(yōu)勢度指數(shù)較低。T-V-R顯著提高真菌群落的多樣性指數(shù)，但降低優(yōu)勢度指數(shù)。因此，T-V-R處理的土壤生態(tài)環(huán)境較好，使之適合多種真菌的繁殖生長，種群數(shù)量增加。多種真菌共同存在，互相制約，可防止某些病原真菌過度繁殖，抑制作物病害的發(fā)生。值得注意的是，454高通量測序表明，在不同種植模式的土壤中，真菌的豐富度因輪作處理和它們的種類不同而異，存在378—581種(屬)的真菌，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了目前的常規(guī)培養(yǎng)、磷脂脂肪酸和PCR-DGGE能達(dá)到的水平。此外，用形態(tài)和生理生化方法鑒定微生物需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，程序復(fù)雜，耗時(shí)長，容易出現(xiàn)誤判。說明454高通量測序檢測靈敏度高，鑒定準(zhǔn)確性可靠，更能深入研究土壤真菌的組成和群落結(jié)構(gòu)。本項(xiàng)研究表明，18S rDNA讀數(shù)和真菌OTUs以T-V-R最高，T-C-M最低，說明T-V-R土壤中的真菌數(shù)和屬(種)類最多。

除了待定真菌外，子囊菌占各處理真菌的絕大多數(shù)，都為40%左右甚至超過40%以上。經(jīng)16a不同輪作后，4種輪作處理的土壤中，前15種優(yōu)勢菌株的相似性極低，說明長期輪作極大地改變了土壤中真菌的組成及類型。需要指出的是，土壤真菌參與土壤有機(jī)質(zhì)礦化，分解進(jìn)入土壤的作物殘?bào)w和有機(jī)肥中的有機(jī)質(zhì)，供給植物營養(yǎng)[33]。但是，大多數(shù)真菌同時(shí)也為植物病原菌，引起多種真菌病害。例如，子囊菌引起根腐、莖腐、果(穗)腐和枝枯等；鐮刀菌普遍為植物真菌性病害；葡萄肉坐菌幾乎能危害所有果樹，如香蕉蕉腐病、桃樹流膠病等；座囊菌是我國主要的果樹病菌，引起香蕉葉斑病，梨葉斑病，葡萄黑痘病等；鏈格孢菌95%以上兼性寄生于植物，引起多種植物病害，如小麥葉枯病，玉米大斑病，茄子早疫病，白菜黑斑病等；炭角菌廣泛分布于全球各地，在熱帶和亞熱帶地區(qū)尤為常見，能引起桑、茶、櫟、蘋果根腐病和黑腐病等[34]。從防治作物土傳真菌病害的角度看，合理輪作是完全可能和必要的。

4結(jié)論

總之，4種輪作方式均有益于保持或提高土壤肥力和土地生產(chǎn)力。從作物產(chǎn)量、產(chǎn)值、土壤有機(jī)質(zhì)、有效養(yǎng)分、酶活性、微生物量、真菌種群結(jié)構(gòu)和多樣性等方面看，烤煙-苕子-水稻輪作最佳，是值得推廣的一種種植模式。

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Influence of crop rotation on enzyme activities and fungal communities in flue-cured tobacco soil

CHEN Danmei1, DUAN Yuqi2, YANG Yuhong2, JIN Yan2, YUAN Ling1,*

1CollegeofResourcesandEnvironment,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China2YunnanTobaccoAgricultureResearchInstitute,Kunming650031,China

Abstract：Rotation practices have significant influences on the chemical, physical, and biological properties of soils, as well as on the occurrence of crop diseases caused by soil fungi. A long-term rotation experiment was set up in a red soil area of the Yunnan province with four rotation models: flue-cured tobacco-blank-maize (T-B-M), flue-cured tobacco-canola-maize (T-C-M), flue-cured tobacco-canola-rice (T-C-R), and flue-cured tobacco-vetch-rice (T-V-R). Chemical and enzymatic analysis and 454 pyrosequencing were used to study changes in nutrients, enzymes activities, and fungal colony structures in order to provide a scientific basis for the rational use of rotation of flue-cured tobacco. After 16 years of crop rotation, the soil pH changed from 5.6 to 6.4, which is still suitable for the cultivation of flue-cured tobacco, canola, rice, and maize. The yield, output value, and quality of flue-cured tobacco were increased significantly, and organic matter was increased by 45.11% under the condition of T-V-R treatment. Similar changes were also found in available nitrogen and phosphorus, soil microbial biomass carbon and nitrogen, and activities of sucrase, dehydrogenase, urease, phosphatase, and catalase. This suggests improvement of the soil ecological environment, promotion of microbial reproduction, and increases in microbial numbers and activities. The reads of fungal 18S rDNA sequences were 13097 in the soil with T-B-M, 11345 with T-C-M, 12939 with T-C-R, and 13763 with T-V-R, representing 530378395, and 581 fungal genera or species, respectively. All fungi belonged to Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota, Chytridiomycota, or unidentified groups, with the majority belonging to Ascomycota. The abundance of the top 15 predominant fungi accounted for 29.46%—62.86% of the total abundance, and less similarity was found in the tested soils, indicating variation in fungal colony structure in the soils with variable rotation models. T-V-R showed the highest Shannon diversity index but the lowest Simpson index of fungal communities, implying that the soils with T-V-R were favorable for the reproduction and growth of multiple fungi and increment of their groups. The co-presence of a variety of fungi in a soil could result in reciprocal inhibition and prevent their over-reproduction, thereby decreasing the possibility of the crops being infected by pathogenic fungi. With respect to crop yield, organic matter in soils, nutrients, and fungal community structure, T-V-R was superior to the other three rotation models, which could be encouraged in the tobacco-growing areas in Yunnan Province.

Key Words:rotation; soil; nutrient; fungus; diversity

基金項(xiàng)目:云南省煙草公司項(xiàng)目(2013YN11); 國家煙草專賣局項(xiàng)目(110201302016); 科技部“973”項(xiàng)目(2013CB127405)

收稿日期:2014- 11- 05; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015- 08- 24

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: lingyuanh@aliyun.com

DOI:10.5846/stxb201411052183

陳丹梅, 段玉琪,楊宇虹, 晉艷, 袁玲.輪作模式對植煙土壤酶活性及真菌群落的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(8):2373- 2381.

Chen D M, Duan Y Q, Yang Y H, Jin Y, Yuan L.Influence of crop rotation on enzyme activities and fungal communities in flue-cured tobacco soil.Acta Ecologica Sinica,2016,36(8):2373- 2381.