遠(yuǎn)東偏頂蛤核糖體DNA第二轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）測(cè)序及分析

林杉杉+鮑相渤+劉忠穎+王超+楊慧花

摘要：利用通用引物成果擴(kuò)增了遠(yuǎn)東偏頂蛤核糖體DNA第二轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，并對(duì)其進(jìn)行了一致性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明：遠(yuǎn)東偏頂蛤ITS2序列全長(zhǎng)共245 bp，四個(gè)個(gè)體的序列無(wú)差異。與其他物種相比，與遠(yuǎn)東偏頂蛤一致性最高的物種為同屬的偏頂蛤，系統(tǒng)進(jìn)化樹中，遠(yuǎn)東偏頂蛤與同屬的其他兩個(gè)種聚為一支。本文研究結(jié)果為該種的遺傳進(jìn)化及多樣性研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：遠(yuǎn)東偏頂蛤；ITS2；系統(tǒng)進(jìn)化

遠(yuǎn)東偏頂蛤Modiolus kurilensis F.R.Bernard，1983 是廣泛分布于中日韓俄海域的大型雙殼貝類，隸屬于瓣鰓綱、貽貝目、貽貝科、偏頂蛤?qū)?，由于其形態(tài)學(xué)特征與來(lái)自歐洲的偏頂蛤 Modiolus modiolus （Linnaeus，1758） 模式標(biāo)本非常近似，致使很多人誤將遠(yuǎn)東偏頂蛤當(dāng)成偏頂蛤。2014年作者通過(guò)線粒體COI基因分析，確認(rèn)大連黃海北部所得標(biāo)本為遠(yuǎn)東偏頂蛤[1]。

真核生物核糖體 DNA （rDNA） 在染色體上的排列順序?yàn)?18S、5.8S、28S rDNA，其中18S與5.8S rDNA之間存在著一個(gè)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)被稱為第一轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1），而5.8S與28S rDNA之間的間隔區(qū)被稱為第二轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)與18S 、5.8S 和 28S rDNA 一起在基因組中組成多拷貝轉(zhuǎn)錄單元。其中兩個(gè)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)由于不加入成熟核糖體，進(jìn)化過(guò)程中的選擇壓力小，進(jìn)化速度較快，因而用于多種生物的進(jìn)化關(guān)系構(gòu)建、遺傳變異、近似種類的區(qū)分及雜交種的鑒定[2-5]。本文首次測(cè)定并報(bào)道了遠(yuǎn)東偏頂蛤大連群體的ITS2 序列全長(zhǎng)，并與近緣物種進(jìn)行了初步比較分析，旨在為該種的系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本文所用實(shí)驗(yàn)材料于2015年8月采自遼寧省大連市付家莊海域。個(gè)體解剖后，取閉殼肌保存于95%乙醇溶液中。

1.2試驗(yàn)方法

剪取適量樣本，去離子水浸泡以去除乙醇，采用TIANamp Marine animals DNA kit進(jìn)行基因組DNA提取。

兩個(gè)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的PCR擴(kuò)增引物序列分別為ITS-2A/ITS-2B：5' –GGGTCGATGAAGAA CGCAG -3' / 5' -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3'[6]。PCR擴(kuò)增體系為：TaKaRa LA Taq（5 U/μL）0.5 μL，10×LA Taq Buffer II（Mg2+ Plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mM each）8 μL，DNA模板50 ng，正反引物終濃度均為1.0 μM。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 2 min；33 個(gè)循環(huán)包括94 ℃/30 s，52 ℃/30 s，72 ℃/1 min；最終72 ℃/5 min 延伸。擴(kuò)增所得片段經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后送交上海生工行克隆測(cè)序。

從GenBank中下載貽貝科中其他物種的ITS2序列，去掉兩端5.8S及28S序列，用于比較分析，用DNAMAN計(jì)算遠(yuǎn)東偏頂蛤與其他物種ITS2序列的一致性，以蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）的ITS2序列為外群，采用PHYLIP軟件以鄰位相連法（neighbor joining） 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap=1 000）。

2結(jié)果與討論

2.1遠(yuǎn)東偏頂蛤ITS2序列

本實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了四個(gè)個(gè)體的ITS2 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的片段約500 bp（圖1），經(jīng)克隆測(cè)序，去除片段兩端的5.8S及28S序列，得到長(zhǎng)度為245 bp的ITS2全序列，四個(gè)個(gè)體擴(kuò)增片段序列完全一致，堿基序列及長(zhǎng)度無(wú)多態(tài)性（圖2）。

2.2遠(yuǎn)東偏頂蛤與其他物種ITS2序列的比較

利用DNAMAN計(jì)算了遠(yuǎn)東偏頂蛤與貽貝科其他物種及蝦夷扇貝ITS2序列的一致性，結(jié)果列于表1。結(jié)果顯示：貽貝科內(nèi)物種ITS2長(zhǎng)度在242-386bp之間，與遠(yuǎn)東偏頂蛤一致性最高的物種為其同屬的的兩個(gè)物種，其中Modiolus modiolus與遠(yuǎn)東偏頂蛤相比僅有3個(gè)堿基的缺失和3個(gè)堿基的突變。雖然貽貝Mytilus_edulis與遠(yuǎn)東偏頂蛤同屬一科，然而其ITS2一致性小于非同科的蝦夷扇貝，可能是由于貽貝的ITS2序列過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致了其與遠(yuǎn)東偏頂蛤序列一致性的嚴(yán)重降低。

ITS2在進(jìn)化過(guò)程中選擇壓力較小，致使其長(zhǎng)度及序列差異不僅存在于種間，還存在于同種的不同種群、同群體的不同個(gè)體間，甚至同一個(gè)體也存在堿基的突變[7]。喻達(dá)輝等在研究珠母貝屬 6個(gè)種的 ITS 2分子標(biāo)記時(shí)曾發(fā)現(xiàn)同種不同個(gè)體間存在少數(shù)堿基突變現(xiàn)象[8]。本研究雖然尚未發(fā)現(xiàn)個(gè)體間ITS2堿基的差異，但由于本實(shí)驗(yàn)僅以一個(gè)群體的四個(gè)樣本為材料，不能武斷地認(rèn)為該種ITS序列中不存在差異。

2.3貽貝科ITS2系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

在利用上述ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，同屬的物種基本分布于同一姊妹分支上，東方偏頂蛤與同屬的Modiolus modiolus 和Modiolus rectus聚為一支，而貽貝與同一亞科的Perna屬的兩個(gè)物種也分布在較近的分支上（圖3）。雖然個(gè)別分支置信度僅為60%，但其顯示出的進(jìn)化關(guān)系與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果保持一致。上述系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示了該科進(jìn)化的總體趨勢(shì)：貽貝科進(jìn)化分大分支，以貽貝亞科為代表的為一大分支，而另一分支則以偏頂蛤亞科代表。這一結(jié)果與Distel[9]使用18S序列研究該科進(jìn)化的結(jié)果相似。

圖3基于ITS2序列構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹

作者曾經(jīng)利用東方偏頂蛤ITS1序列進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)無(wú)論長(zhǎng)度還是堿基順序，不同物種ITS1均顯示出很大的差異，以此構(gòu)建的進(jìn)化樹與已有的分類系統(tǒng)大相徑庭，差異很大，而本文用ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹則與現(xiàn)有分類系統(tǒng)吻合的較好。孟學(xué)平等[10]曾經(jīng)使用ITS2序列構(gòu)建了蛤蜊科 3 種貝類的系統(tǒng)進(jìn)化樹，其顯示的進(jìn)化關(guān)系與使用16S序列構(gòu)建的相似。綜上所述，與ITS1相比，用ITS2構(gòu)建的進(jìn)化樹能更好地反映近緣物種的進(jìn)化關(guān)系。

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