進(jìn)口頭孢替安酯體內(nèi)外抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究

韓彬　劉立濤　邵振俊　柏楊　周黎明

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室，四川 成都　610041)

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進(jìn)口頭孢替安酯體內(nèi)外抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究

韓彬劉立濤邵振俊柏楊周黎明△

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室，四川 成都610041)

摘要目的：評價進(jìn)口頭孢替安酯體內(nèi)外抗菌作用。方法：進(jìn)口頭孢替安酯為試驗(yàn)藥，頭孢克洛、頭孢氨芐、頭孢克肟為對照藥，測試它們對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克伯桿菌的體外抗菌活性，即最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)；以小鼠為實(shí)驗(yàn)動物，用體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)來測量各個藥物的半數(shù)有效量(50% effective dose，ED50)。結(jié)果：對所選的三類細(xì)菌而言，較其它3種對照藥(頭孢克洛、頭孢克肟和頭孢氨芐)，進(jìn)口頭孢替安酯有更高的MIC；體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)口頭孢替安酯對大腸埃希菌ED50低于其他3種對照藥，對肺炎克雷伯菌及金黃色葡萄球菌的ED50也僅高于頭孢克肟，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌能力。結(jié)論：進(jìn)口頭孢替安酯對三類細(xì)菌的MIC高于其他3種對照藥，對大腸埃希菌的體內(nèi)抗菌活性高于其他3種對照藥，對肺炎克雷伯菌及金黃色葡萄球菌的體內(nèi)抗菌活性僅次于頭孢克肟。

關(guān)鍵詞：頭孢類抗生素；最低抑菌濃度；半數(shù)有效量

頭孢菌素類(Cephalosporins)是以冠頭孢菌培養(yǎng)液中分離的頭孢菌素C為原料，其側(cè)鏈經(jīng)過不同修飾而得到的一系列半合成抗生素[1]。其優(yōu)點(diǎn)是抗菌力強(qiáng)、抗菌譜廣、對厭氧菌有高效，毒副反應(yīng)低、臨床療效好、對酸及對各種細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶較穩(wěn)定等[2]，因而臨床應(yīng)用廣泛，用量處于逐年上升趨勢，在抗感染治療中占有十分重要的地位[3]，目前已發(fā)展至第四代。

頭孢替安屬第二代頭孢類抗生素[4]，已經(jīng)被制成多種劑型在臨床上作為一線抗生素使用。本研究中的進(jìn)口頭孢替安酯系注射用頭孢替安乙酯化而成的口服抗生素，自身并無抗菌作用，口服后在腸道粘膜迅速水解為頭孢替安而被吸收最終產(chǎn)生抗菌作用。目前我國所用的頭孢替安酯主要為日本武田藥品工業(yè)株式會社進(jìn)口產(chǎn)品，關(guān)于其研究報道還很少。

因此，本研究擬通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對進(jìn)口頭孢替安酯的抗菌作用進(jìn)行初步研究，以期為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品

日本市售頭孢替安酯批號：HG179；規(guī)格：100mg/(效價)片。日本武田藥品工業(yè)株式會社生產(chǎn)。頭孢克洛膠囊批號：0903001；規(guī)格：0.25 g/粒；華北制藥集團(tuán)制劑有限公司生產(chǎn)。頭孢氨芐膠囊批號：0812103；規(guī)格：0.25 g/粒；石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司生產(chǎn)。頭孢克肟片批號：031201；規(guī)格：0.25 g/片；深圳致君制藥有限公司生產(chǎn)。所有藥品保存條件為密封干燥保存；由成都市寶信生物科技有限公司提供

1.1.2細(xì)菌

革蘭陽性菌：臨床分離金黃色葡萄球菌；革蘭陽性菌：臨床分離大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌。以上菌株均由四川大學(xué)華西藥理教研室提供。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動物

普通健康昆明種(KM)小鼠370只，雌雄各半，四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物批準(zhǔn)號SCXK(川)-10-2006，體重18-22 g之間。正式實(shí)驗(yàn)前，所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由攝食、飲水適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)過程中遵循3R動物福利原則。

1.1.4試劑及儀器

羧甲基纖維素鈉：分析純；500 g；天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號：20050825。牛肉膏：BR生化試劑；500 g；北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20061106。蛋白胨：BR生化試劑；250 g；北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20090905。瓊脂粉：JAPAN進(jìn)口；Storage：RT。氯化鈉：分析純；500 g；天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號：20070602?？扇苄缘矸郏悍治黾?；500 g；成都宏博實(shí)業(yè)有限公司，批號：20001103。酪蛋白水解物：200 g；杭州微生物試劑有限公司，批號：20070213。MH培養(yǎng)基：牛肉浸膏：3 g；可溶性淀粉：1.5 g；酪蛋白水解物：17.5 g；蒸餾水：1000 ml；調(diào)pH至7.2，置于103.43 kPa高壓滅菌15 min。電子天平：Precisa，型號：XS125A-SCS。超凈工作臺：蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品。恒溫培養(yǎng)箱，錐形瓶，玻璃試管，10mlBP管，測容積玻璃容器，移液槍，注射器等。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)菌株分離純化

金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌均由臨床分離獲得，經(jīng)常規(guī)方法由分離鑒定，每株細(xì)菌應(yīng)經(jīng)瓊脂平板劃單個菌落分離純化，實(shí)驗(yàn)前挑去單一菌落于35～37℃下適當(dāng)培養(yǎng)后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2最低抑菌濃度(MIC)測定

采用二倍肉湯稀釋法[5]：制備抗菌藥物貯存液濃度為1280 mg·L-1。具體操作方法：排列14只試管，其中第1管內(nèi)加肉湯1.6 ml,其余各管加肉湯1 ml。吸取藥物原液0.4 ml加入第1管，充分混勻后吸出1.0 ml加入第2管依次至第13管，第13管棄去1.0 ml，第14管為不含藥物的生長對照。此時各管所含藥物分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06 mg·L-1。然后在每管內(nèi)加入制備好的菌懸液(105CFU·ml-1)1 ml，充分混勻。此時第1管至第13管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg·L-1。將所有試管置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h后，觀察結(jié)果并記錄最小抑菌濃度(MIC)。

1.2.3最小致死菌量(MLD)試驗(yàn)

將臨床分離的菌種進(jìn)行增殖，即實(shí)驗(yàn)用菌于感染前一天，挑取2-3個單菌落接種于2 ml MH肉湯，37℃培養(yǎng)6 h，取此菌液0.1 ml轉(zhuǎn)種于10 ml肉湯中，37℃培養(yǎng)18 h，該菌液即為原菌液，為對數(shù)生長期。增菌后的對數(shù)生長期菌液用無菌生理鹽水稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含5×108CFU·ml-1；該過程記錄原菌液的稀釋倍數(shù)，故可推算原菌液的細(xì)菌含量，再用5%酵母液稀釋原菌液，配成所需要的5個濃度，如：5×109、5×108、5×107、5×106、5×105CFU·ml-1，均需當(dāng)日新鮮配制使用。

取健康昆明種小鼠，體重18～22 g，隨機(jī)分組，每組10只小鼠，雌雄各半，每種菌需要5個實(shí)驗(yàn)組，再加上1個對照組，共計16組。吸取上述不同稀釋濃度菌液，分別腹腔注射入小鼠體內(nèi)，每鼠0.5 ml，感染后觀察7～14 d，并記錄小鼠死亡數(shù)，以引起小鼠100%死亡的最低菌量作為最小致死菌量(MLD)，用該菌量作為體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)的感染菌量。對照組腹腔注射0.5 ml無菌生理鹽水。

1.2.4體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)

試驗(yàn)用藥均用0.5%CMC(羧甲基纖維素)將所需試驗(yàn)的藥物制備成顆粒均勻的混懸液(口服灌胃用)。即在上述實(shí)驗(yàn)中求每種受試菌最小致死菌量(MLD)后，還需要得到每種藥物100%小鼠死亡與未出現(xiàn)死亡的劑量濃度，在該劑量范圍內(nèi)設(shè)5個劑量組，精確稱取藥物，按效價將其換算到藥物重量，用0.5%CMC將各受試藥物稀釋至所需濃度，制備成顆粒均勻的混懸液，劑量組間距為1：0.6。分別配備以下實(shí)驗(yàn)用藥：進(jìn)口頭孢替安酯、頭孢克洛、頭孢氨芐、頭孢克肟。

按照體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)方法[5]，四種抗生素每種藥物各需50只小鼠，再加1個對照組，共計210只小鼠。將小鼠試驗(yàn)前18 h停食供水，按體重隨機(jī)分組，每組10只小鼠，雌雄各半，分別于腹腔感染試驗(yàn)菌液，每鼠0.5 ml，感染后即刻按設(shè)計劑量口服灌胃給藥。四小時后，重復(fù)給藥一次，觀察并記錄小鼠死亡數(shù)，連續(xù)觀察7～14 d，根據(jù)小鼠死亡數(shù)，用SPASS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計算半數(shù)有效量ED50。

2結(jié)果

2.1最低抑菌濃度

經(jīng)過二倍肉湯稀釋法檢測，各類抗生素對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌的MIC值如下表所示。對此三類細(xì)菌而言，頭孢克肟顯示出最強(qiáng)的抗菌活性，進(jìn)口頭孢替安酯MIC不低于其他3種對照藥，如表1所示。

表1　最低抑菌濃度(MIC，mg·L-1)

2.2最小致死菌量

大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌的最小致死菌量分別如表2所示。

表2　最小致死菌量(MLD，CFU·ml-1)

2.3半數(shù)有效量

以上述菌量作為體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)的感染菌量。經(jīng)過體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)可看出，對大腸埃希菌的抗菌活性高于其他3種對照藥，對肺炎克雷伯菌及革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌的抗菌作用僅次于頭孢克肟，如表3所示。

表3　半數(shù)有效量(ED50，mg·kg-1)

3討論

頭孢類抗菌藥物發(fā)展迅速，新型的藥物不斷出現(xiàn)，在抗感染治療中占有非常重要的地位。在投入市場前，應(yīng)有充分的試驗(yàn)來證明新藥的抗菌潛力，以便大規(guī)模生產(chǎn)，使藥物的普及率提高。

頭孢替安酯的活性成份頭孢替安是第二代頭孢菌素[6]，抗菌特點(diǎn)是抗菌譜較第一代廣，對革蘭陽性菌的抗菌作用與第一代相近；對需氧革蘭陽性菌具良好抗菌作用，對部分腸桿菌科細(xì)菌亦具一定抗菌活性，且抗酶性能強(qiáng)，腎毒性也較小。目前而言，多數(shù)病原菌對包括頭孢替安在內(nèi)的第二代頭孢菌素仍然比較敏感，同時，頭孢替安在腎臟、膽汁、氣管分泌物和腹腔液中可具有較高的濃度,并且多以原形由尿中排泄[7]。因此，頭孢替安的有效劑型，應(yīng)用于包括下呼吸道感染、尿路感染、腹腔感染在內(nèi)的各種院外感染有著非常好的前景[8]。而且臨床上，醫(yī)生需嚴(yán)格掌握抗生素應(yīng)用原則及聯(lián)合應(yīng)用指征[9,10]，合理應(yīng)用抗生素，必要時，尤其是混合感染可聯(lián)合使用抗生素，同時意避免拮抗作用。這樣，口服抗生素劑型因?yàn)榻o藥、吸收方式有別于靜脈給藥劑型，在抗生素聯(lián)用過程中顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢，擁有一定的推廣意義。

我們以進(jìn)口頭孢替安酯為目標(biāo)研究藥物，選取了頭孢克洛、頭孢氨芐、頭孢克肟作為對照藥品，以期觀測進(jìn)口頭孢替安酯的體內(nèi)外抗菌活性。結(jié)果表明：在藥物敏感試驗(yàn)中，進(jìn)口頭孢替安酯對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌的MIC值都不低于其他3種對照藥，但仍顯示出較強(qiáng)的抗菌活性；而抗生素體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)中，進(jìn)口頭孢替安酯對大腸埃希菌抗菌作用強(qiáng)于所選全部對照藥；對肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌而言，進(jìn)口頭孢替安酯的抗菌活性也僅次于頭孢克肟，高于其他另外兩種對照藥，結(jié)果提示我們進(jìn)口頭孢替安酯是擁有較強(qiáng)的體內(nèi)抗菌活性的。

綜上所述，我們認(rèn)為進(jìn)口頭孢替安酯的抗菌表現(xiàn)已經(jīng)不輸于其他三類一線抗生素，值得臨床推廣。進(jìn)口頭孢替安酯的單獨(dú)使用，或和其他抗生素的聯(lián)用怎樣才能在盡量減輕藥物副反應(yīng)和相互作用的前提下到達(dá)藥物效價最大化，則需要更深入基礎(chǔ)和臨床研究。

參考文獻(xiàn)

1王榮耕. 頭孢類抗生素母核的改造[J]. 精細(xì)與專用化學(xué)品, 2003, 11(3): 12-14.

2劉旻虹,狄斌,劉文英. 頭孢菌素類抗生素——頭孢替坦的研究進(jìn)展[J]. 抗感染藥學(xué), 2008, 5(4): 209-214.

3羅圣平,易小紅,劉芳. 2004～2008年我院頭孢菌素類抗生素應(yīng)用分析[J]. 中國醫(yī)院用藥評價與分析, 2009, 9(2): 100-103.

4Imada A, Hirai S. Cefotiam hexetil[J]. Int J Antimicrob Ag, 1995, 5(2): 85-99.

5徐叔云主編. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2002, 1658-1665.

6Gehanno P, Loncle-Provot V, Le Kerneau J. Efficacy of cefotiam hexetil in acute maxillary sinusitis, with a short five day vs ten day treatment[J]. Med Maladies Infect, 2004, 34(10): 455-459.

7Brogard JM, Jehl F, Willemin B, et al. Clinical pharmacokinetics of cefotiam[J]. Clin Pharmacokinet, 1989, 17(3): 163-74.

8Maier H, Attallah M, Weidauer H. Efficacy and safety of cefotiam hexetil in the treatment of ear, nose and throat infections[J]. Arzneimittel-Forsch,1992, 42(7): 980-982.

9DhiwakarM, Eng CY, Selvaraj S, et al. Antibiotics to improve recovery following tonsillectomy: a systematic review[J]. Otolaryngol Head Nec, 2006, 134(3): 357-364.

10Llor C. Antibiotics should be given only to patientswith moderate-to-severe COPD[J]. Am J Med, 2006, 119(2): 186-187.

Antibacterial activity of imported cefotiam hexetil in the vivo &vitro trial

Han Bin, Liu Li-tao, Shao Zhen-jun, Bai Yang, Zhou Li-ming△

(Department of Pharmacology, West China School of Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

AbstractObjective：To evaluate the antibacterial activity of imported cefotiam hexetil in the vivo & vitro trial. Methods: Taking imported cefotiam hexetil as test drug, cefaclor, cephalexin and cefixime as the control drugs, we tested the antibacterial activities of them to Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Bacillus pneumonia Kerber in vitro experiments, namely, the minimum inhibitory concentration (MIC); and perform vivo protection test to measure 50% effective dose (ED50) of various drugs in mice experiments after injecting the above bacteria in peritoneal. Results: In vitro trial，imported cefotiam hexetil showed higher MICs than the rest three kinds of control drugs (cefaclor, cefixime and cephalexin); the ED50of imported cefotiam hexetil against Escherichia coli was lower than control drugs, and the ED50s against Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus were only higher than cefixime, imported cefotiam hexetil showed strong antibacterial capacity in vivo experiments. Conclusion: MICs of imported cefotiam hexetil against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Bacillus pneumonia Kerber were higher than the rest three kinds of control drugs In vitro experiments; imported cefotiam hexetil manifested strongest antibacterial activity to Escherichia coli and second and strongest antibacterial activity to Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae.

Key Words:Imported cefotiam hexetil; Minimum inhibitory concentration; 50% effective dose

作者簡介：韓彬，男，博士研究生，主要從事分子藥理學(xué)研究，Email：182420961@qq.com。 △通訊作者：周黎明，女，教授，主要從事分子藥理學(xué)研究，Email：zhou108@163.com。

(收稿日期：2016-5-26)