高效液相色譜法測(cè)定土壤中的二氯喹啉酸①

陳　虹，鐘　明，唐昊冶，韓　勇，靳　偉

（中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與環(huán)境分析測(cè)試中心，南京　210008）

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高效液相色譜法測(cè)定土壤中的二氯喹啉酸①

陳虹，鐘明，唐昊冶，韓勇，靳偉

（中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與環(huán)境分析測(cè)試中心，南京210008）

摘要：用50 ml甲醇︰0.05 mol/L硼砂溶液（pH = 10）（9︰1，v/v）作為提取劑對(duì)20 g（或適量）土壤樣品中殘留的二氯喹啉酸振蕩提取2 h，離心過(guò)濾后分取濾液25 ml濃縮，甲醇定容至2 ml，再用濾膜過(guò)濾后待測(cè)定；高效液相色譜儀（HPLC）以1.0 ml/min的甲醇︰1% 乙酸水溶液（55︰45，V/V）為流動(dòng)相，柱溫45℃，在238 nm的紫外光波長(zhǎng)下進(jìn)行二氯喹啉酸的外標(biāo)法定量。該方法精密度為6.0%，檢出限為0.012 mg/kg，不同類(lèi)型土壤的加標(biāo)回收率74.9% ～ 98.8%，能滿(mǎn)足有機(jī)分析要求。該方法既簡(jiǎn)捷易操作，又能滿(mǎn)足土壤中二氯喹啉酸低殘留量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；測(cè)定；土壤；二氯喹啉酸

二氯喹啉酸的測(cè)定方法主要有液相色譜法［6-7， 10-14， 21-24］、氣相色譜法［13， 21］、毛細(xì)管電泳法［25］等。其中液相色譜法（HPLC）測(cè)定更為廣泛，樣品前處理較為簡(jiǎn)單，若為水樣只需將其過(guò)濾膜后即可直接測(cè)定；但會(huì)出現(xiàn)低濃度水樣測(cè)定準(zhǔn)確與否這個(gè)問(wèn)題，需濃縮后測(cè)定。文獻(xiàn)報(bào)道采用毛細(xì)管電泳分析方法的則很少，其水樣的前處理類(lèi)似于液相色譜。但當(dāng)采用氣相色譜法（GC）測(cè)定時(shí)，需將二氯喹啉酸提取出來(lái)再酯化后才可以測(cè)定，前處理復(fù)雜，不過(guò)GCECD具較高的靈敏度，可以間接測(cè)定較低濃度的二氯喹啉酸。

對(duì)于土壤、植物等固體樣品，前處理則復(fù)雜得多，需將二氯喹啉酸以合適的溶劑提取出來(lái)后才能進(jìn)行儀器測(cè)定，相關(guān)研究文獻(xiàn)較少，王一茹等［21］采取硼砂緩沖液直接提取過(guò)濾測(cè)定的方法，該法所得提取液中二氯喹啉酸濃度低時(shí)HPLC法難測(cè)準(zhǔn)，且高濃度的硼砂鹽溶液濃縮難度較大，不適于目標(biāo)物的濃縮；不過(guò)作者對(duì)低濃度提取液采取柱富集、洗脫和衍生化后再GC法測(cè)定，盡管該法具有檢測(cè)限低的優(yōu)點(diǎn)，但過(guò)程非常繁瑣。陳澤鵬等［12］將硼砂緩沖液與甲醇 1︰2復(fù)配后再提取土壤，之后將提取液調(diào)成酸性后再用二氯甲烷液液萃取其中的二氯喹啉酸，經(jīng)濃縮換相后HPLC法測(cè)定，此液液萃取法似有不妥，因?yàn)槎揉崾请y溶于二氯甲烷的。針對(duì)這些問(wèn)題，本研究仍采用HPLC法，針對(duì)土壤樣品的前處理過(guò)程和儀器測(cè)定的相關(guān)條件，做了優(yōu)化，既確保了方法的簡(jiǎn)捷性，又滿(mǎn)足了土壤中二氯喹啉酸較低殘留量的測(cè)定，并對(duì)不同類(lèi)型的土壤進(jìn)行加標(biāo)培養(yǎng)后再測(cè)定，來(lái)確認(rèn)該方法的可行性。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑材料

儀器：超高壓液相色譜儀（Shimadzu UFLC-20A，配備二極管陣列檢測(cè)器（SPD）及熒光檢測(cè)器（FLD），日本）；烘箱（DGG-9240，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；電子天平（精確至0.000 1 g，德國(guó)Sartorius公司）；電子天平（精確至 0.001 g，上海良平儀器儀表有限公司）；振蕩器（ZD-16，南京英美爾科技開(kāi)發(fā)有限公司）；超純水機(jī)（艾科浦Aquapro，AJY-6000-U上海富雪生物科技有限公司）。

標(biāo)樣及試劑：二氯喹啉酸（甲醇中二氯喹啉酸，二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度＞99.7%，上海市農(nóng)藥研究所）；甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；蒸餾水（由本單位所屬的開(kāi)發(fā)公司統(tǒng)一制備供應(yīng)）；超純水（用蒸餾水由純水機(jī)制得）；硼砂（分析純，市售）；乙酸（GR，市售）。

液相色譜柱：Agilent（美國(guó)），Zorbax SB-C18，4.6 × 250 mm，5 μm。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

本研究基于以下原理選擇該方法，即采用一定量合適的提取劑對(duì)土壤樣品進(jìn)行振蕩提取，使吸附于土壤樣品中的目標(biāo)物盡量脫附擴(kuò)散至提取劑中；而后將提取液注入液相色譜儀，進(jìn)入色譜柱中的混合有機(jī)化合物在合適流動(dòng)相的洗脫下，與液相色譜柱中的固定相以吸附-解吸-吸附-解吸……的方式逐一分離，流出色譜柱，再流入檢測(cè)器得到各個(gè)化合物的電信號(hào)值，進(jìn)而達(dá)到復(fù)雜混合物的分離與分析。

土壤樣品預(yù)處理：稱(chēng)取10 g左右（精確至0.000 1 g）新鮮（風(fēng)干）土壤樣品于鋁盒中，105℃烘干稱(chēng)重后測(cè)得水分。同時(shí)稱(chēng)20 g（精確至0.001 g）土壤樣品于100 ml的三角瓶中，加入50 ml提取溶劑，并立即封蓋，振蕩提取。然后將提取液轉(zhuǎn)入離心管4 900 r/min離心8 min，濾紙過(guò)濾后分?。?6］25 ml清澈提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1 ml，再用甲醇定容至2 ml，并用0.45 μm的濾膜過(guò)濾后待液相色譜儀測(cè)定。

二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液： 稱(chēng)取合適量的二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇超聲溶解并定容，得二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。樣品測(cè)定的同時(shí)將購(gòu)得的二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為儀器質(zhì)控樣品。

液相色譜儀器分析條件：采用Agilent（美國(guó)）液相色譜柱，Zorbax SB-C18，4.6×250 mm，5 μm，參考文獻(xiàn)［21］里的流動(dòng)相條件對(duì)樣品進(jìn)行洗脫測(cè)定，即流︰動(dòng)相為甲醇1% 乙酸水溶液（pH ≈ 3.0）（55︰45，v/v），流速為1.0 ml/min，柱溫45℃，進(jìn)樣量20 μl，全波長(zhǎng)掃描，選取238 nm通道進(jìn)行外標(biāo)法峰面積定量。

2　結(jié)果與討論

2.1實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1提取溶劑選擇土壤對(duì)二氯喹啉酸有一定程度的吸附能力，但屬可逆吸附［27］。土壤中殘留的二氯喹啉酸可以通過(guò)溶劑提取的方式將其解吸出來(lái)，但是二氯喹啉酸在水中的溶解度非常小，可溶于部分有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮等，故需要土壤中二氯喹啉酸的提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化選擇，實(shí)驗(yàn)分別選擇甲醇、甲醇︰水（9︰1，v/v）、甲醇︰0.05 mol/L 硼砂溶液（pH = 10）（9︰1，v/v）和丙酮 4 種提取溶劑，對(duì)同一加標(biāo)濃度（0.8 mg/kg）的不含二氯喹啉酸的風(fēng)干 10目土壤樣品進(jìn)行提取，每種提取劑重復(fù) 3 次，所得平均回收率結(jié)果見(jiàn)圖 1。

圖1　提取溶劑選擇（n = 3）Fig. 1　Extraction solvent for choice

由圖1︰，溶劑甲醇0.05 mol/L硼砂溶液所提取的回收率最高，平均回收率可達(dá)97.3%，且重復(fù)性較好，完全滿(mǎn)足樣品的有機(jī)分析要求（通常認(rèn)為絕對(duì)回收率能達(dá)到80% ～ 120% 即可，最低不得低于50%）；提取劑甲醇︰水所提取的二氯喹啉酸的回收率次之，為85.7%，也能滿(mǎn)足有機(jī)分析的要求；而其他兩種提取劑的提取率則均較低，甲醇為54.1%，丙酮為9.04%。故選提取劑甲醇︰0.05 mol/L 硼砂溶液（pH = 10） （9︰1，v/v）最好。

二氯喹啉酸屬弱酸性物質(zhì)，其pKa = 4.35，當(dāng)提取劑加入土壤中后，其中pH為10的硼砂溶液對(duì)土壤的pH有調(diào)節(jié)作用，使體系處于弱堿性環(huán)境，而二氯喹啉酸在堿性環(huán)境下，會(huì)轉(zhuǎn)化為鹽的形式存在，在水中的溶解性得以較大提高，故提取劑︰甲醇0.05 mol/L硼砂溶液的回收率較高。選擇甲醇︰0.05 mol/L硼砂溶液的配比為 9︰1（v/v），則是考慮到若提取劑中的硼砂水溶液過(guò)多，不利于提取液的濃縮；特別是對(duì)于低濃度土壤樣品，濃縮液量大時(shí)可以加快濃縮速度，提高工作效率，所以選擇該配比9︰1（v/v）。

2.1.2振蕩時(shí)間優(yōu)化在振蕩提取時(shí)，二氯喹啉酸從土壤中解吸并擴(kuò)散到溶劑中需要一段時(shí)間，這段時(shí)間的長(zhǎng)短，對(duì)其擴(kuò)散到溶劑中的量會(huì)有影響，若太短，則會(huì)擴(kuò)散不完全，若太長(zhǎng)，一是資源的浪費(fèi)，二是可能會(huì)帶來(lái)?yè)p失，故需對(duì)振蕩時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化選擇，尋求合適的振蕩時(shí)間。實(shí)驗(yàn)選擇最佳提取溶劑甲醇︰0.05 mol/L硼砂溶液（pH = 10）（9︰1，v/v）對(duì)同一水平加標(biāo)土壤樣品分別振蕩提取 0.5、1、2、3 h，每一個(gè)振蕩時(shí)長(zhǎng)重復(fù) 3 個(gè)樣品，經(jīng)液相色譜儀測(cè)得平均回收率如圖 2。

圖2　振蕩時(shí)間優(yōu)化（n = 3）Fig. 2　Optimal shaking time

由圖2可以看出，振蕩提取2 h，所得的二氯喹啉酸的平均回收率最高，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最小，樣品提取的重復(fù)性較好，故選擇2 h作為振蕩提取最佳時(shí)長(zhǎng)。

2.1.3流動(dòng)相參考李麗春、王一茹等［6， 13， 21-22］的研究，本研究同樣選取甲醇和 1% 乙酸水溶液作為流動(dòng)相，經(jīng)標(biāo)樣及樣品反復(fù)測(cè)試優(yōu)化選擇后發(fā)現(xiàn)，在本研究條件下，流動(dòng)相甲醇︰1% 乙酸水溶液以 55︰45（v/v）等梯度洗脫，流速為 1.0 ml/min 時(shí)，二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)樣及土壤提取液的出峰較好，故選擇該流動(dòng)相配比。但當(dāng)測(cè)定土壤提取液時(shí)，如果二氯喹啉酸出峰處有干擾峰，則需進(jìn)行梯度洗脫，以期將干擾峰與二氯喹啉酸分離開(kāi)，便于對(duì)二氯喹啉酸準(zhǔn)確定性與定量。2.1.4檢測(cè)波長(zhǎng)采用二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)二氯喹啉酸進(jìn)行 190 ～ 400 nm 全波長(zhǎng)掃描，在保留時(shí)間4.6 min 的出峰處得到此時(shí)的紫外吸收光譜圖（圖 3）。由圖 3 可見(jiàn)，在 230 ～ 238 nm 處二氯喹啉酸均能得到較好的吸收，吸收峰強(qiáng)度相差不大。但考慮到溶劑及流動(dòng)相的吸收效應(yīng)，紫外光波長(zhǎng) 230 nm 時(shí)二氯喹啉酸的紫外吸收強(qiáng)度盡管較大些，但溶劑及流動(dòng)相的吸收也很大，故不選。而選用 235 nm 時(shí)，目標(biāo)物吸收峰強(qiáng)度及溶劑吸收峰強(qiáng)度均居中，238 nm 時(shí)目標(biāo)物紫外吸收峰強(qiáng)度開(kāi)始處于下行區(qū)，比 235 nm 時(shí)吸收要弱一些，但溶劑等吸收效應(yīng)則較低（圖 4）。二氯喹啉酸在這 3 個(gè)波長(zhǎng)下的吸收強(qiáng)度相差并不大，綜合考慮，本研究選取 238 nm 作為二氯喹啉酸定性定量時(shí)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3　二氯喹啉酸紫外吸收光譜圖Fig. 3　Ultraviolet absorption spectra of Quinclorac

圖4　不同波長(zhǎng)紫外光下二氯喹啉酸（1.5 mg/L）的液相色譜圖Fig. 4　Liquid chromatogram of Quinclorac （1.5 mg/L） under different wavelength ultraviolet

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及精密度

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：用電子天平（精確至 0.000 1 g）稱(chēng)取適量的二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇超聲溶解并定容至 50 ml，即得二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精確濃度值由具體稱(chēng)樣量及標(biāo)準(zhǔn)品的純度含量計(jì)算而得。本研究所配標(biāo)液為150 mg/L，分別移取合適的量稀釋定容后得濃度為0.6、1.5、3.0、4.5 和 6 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)系列溶液，并以外標(biāo)法校準(zhǔn)樣品中二氯喹啉酸的含量。液相色譜儀測(cè)定后所得校準(zhǔn)曲線(xiàn)方程及線(xiàn)性相關(guān)性見(jiàn)圖 5，曲線(xiàn)的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù) r ＞ 0.999，完全滿(mǎn)足分析要求。

儀器精密度：連續(xù)測(cè)定 1 mg/L 的二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 7 次，對(duì)其峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得儀器精密度為 2.0% ＜ 3%，滿(mǎn)足 JJG 705－2014 HPLC 二極管陣列檢測(cè)器精密度校準(zhǔn)要求，故滿(mǎn)足有機(jī)分析要求，分析結(jié)果是可靠的。

方法精密度：連續(xù)全流程分析 0.2 mg/kg 的二氯喹啉酸加標(biāo)土壤樣品 6 次，對(duì)校準(zhǔn)后所得樣品的濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得方法精密度為 6.0%，重復(fù)性較好，分析結(jié)果可靠。

圖5　二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig. 5　Standard curve of Quinclorac

檢出限：以S/N = 3，并與較低的相近濃度的校準(zhǔn)樣信號(hào)值相比較，算得儀器的檢出限為0.06 mg/L，根據(jù)樣品的全部處理過(guò)程算得該方法的土壤檢出限為0.012 mg/kg，故該方法完全滿(mǎn)足土壤中二氯喹啉酸的測(cè)定。

2.3不同類(lèi)型土壤樣品的加標(biāo)回收

采用本研究?jī)?yōu)化的方法對(duì)不同類(lèi)型的土壤樣品（空白均不含二氯喹啉酸殘留）進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　不同類(lèi)型土壤樣品加標(biāo)回收率（n = 3）Table 1　Recovery rates of Quinclorac in different type soil samples

由表1可看出，除宜興風(fēng)干土這一中性偏弱酸性土，其加標(biāo)土壤樣品在培養(yǎng)4 h和72 h后回收率略偏低（但均＞50%，且接近 80%），其他不同酸度的加標(biāo)土壤在培養(yǎng)不同的時(shí)長(zhǎng)后，依方法所測(cè)得的加標(biāo)回收率均可達(dá)90% 左右，表明此方法可行。而對(duì)宜興新鮮土壤樣品進(jìn)行加標(biāo)培養(yǎng)24 h和72 h 后，二氯喹啉酸的回收率均＞90%，表明本方法對(duì)鮮土和風(fēng)干土均適用。對(duì)淮安堿性土進(jìn)行低濃度加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，二氯喹啉酸的回收率為92.1%，結(jié)果良好，本法對(duì)低濃度土壤樣品仍適用。實(shí)際分析時(shí)，當(dāng)樣品中二氯喹啉酸殘留量低時(shí)，可適當(dāng)?shù)卦黾臃Q(chēng)樣量，若殘留量高，則可適當(dāng)減少稱(chēng)樣量。

2.4實(shí)際樣品的測(cè)定

為驗(yàn)證該方法的實(shí)用性，對(duì)送樣者送來(lái)的實(shí)際樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2見(jiàn)，該批次樣品二氯喹啉酸的殘留量均較低，其中S4樣品重復(fù)3次，其RSD% = 9%，符合有機(jī)樣品分析要求。而根據(jù)李儒海等［9］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)二氯喹啉酸施藥量在 150 g/hm2時(shí)，對(duì)后茬作物有輕度藥害；謝建平等［5］認(rèn)為施藥量在25 g/hm2以?xún)?nèi)是安全的，最多不超過(guò)50 g/hm2；而李麗春等［6］分析數(shù)據(jù)表明，發(fā)生藥害的土壤的二氯喹啉酸的殘留量為0.130 6 mg/kg。據(jù)此以土壤深度為50 cm，土壤密度約2.7 Mg/m3計(jì)，并且不考慮二氯喹啉酸的降解，以最大施入量50 g/hm2考慮，土壤中二氯喹啉酸的安全殘留量限值應(yīng)≤0.06 mg/kg，該殘留限值較低，故樣品S2、S3、S4和S5均有藥害的高度可能性，此類(lèi)土壤不宜種植對(duì)二氯喹啉酸敏感的后茬作物如茄科、豆科等。圖6是S2土壤樣品提取液的液相色譜圖。

表2　土壤樣品中二氯喹啉酸含量Table 2　Quinclorac contents in soil samples

圖6　土壤樣品S2提取液液相色譜圖Fig. 6　Liquid chromatogram of the extracts from soil sample S2

3　結(jié)論

綜上所述，本研究所建立的土壤中二氯喹啉酸殘留量檢測(cè)方法精密度為6%，檢出限為0.012 mg/kg，該方法對(duì)不同類(lèi)型的土壤加標(biāo)回收率為 74.9% ～ 98.8%，滿(mǎn)足相關(guān)分析要求，方法適用范圍廣；且該方法不僅簡(jiǎn)捷，還可以滿(mǎn)足土壤中低濃度二氯喹啉酸的測(cè)定。故最終確定為：用50 ml甲醇 ： 0.05 mol/L硼砂溶液（pH = 10）（9 ： 1，v/v）對(duì)20 g（或適量）土壤樣品振蕩提取2 h，然后離心過(guò)濾，分取濾液25 ml濃縮、甲醇定容至2 ml，濾膜過(guò)濾后待HPLC測(cè)定。HPLC儀器測(cè)定條件為：以1.0 ml/min的甲醇 ： 1%乙酸水溶液（55 ： 45，v/v）為流動(dòng)相，柱溫45℃，選取238 nm的紫外光波長(zhǎng)進(jìn)行外標(biāo)法定量。

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Determination of Quinclorac in Soil Samples with High Performance Liquid Chromatography （HPLC）

CHEN Hong， ZHONG Ming， TANG Haoye， HAN Yong， JIN Wei
（Soil and Environment Analysis Center， Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences， Nanjing210008， China）

Abstract：Quinclorac is an effective herbicide commonly used in rice plantation. But Quinclorac residue in soil probably brings teratogenesis to some Quinclorac sensitive rotation crops， like Solanaceae plants， Leguminosae emblements. So the residue in soil should be accurately detected. Quinclorac residue in soil sample was extracted on a to-and-fro shaker for 2 hours with 50 ml extractant， which was the mixture of methanol and 0.05 mol/L borax solution （pH = 10） at the ration of 9︰1 （v/v）. The extracts was centrifuged and subsequently filtered. 25 ml filtrate was concentrated to about 1 ml and then diluted to 2 ml with methanol for high performance liquid chromatography （HPLC） determination. Content of Quinclorac in extracts was calculated according to external standard method by HPLC under optimized condition. Briefly， 1.0 ml/min methanol： 1% （v/v） acetic acid solution （55︰45， v/v） was selected as mobile phase to elute the target compound for ultraviolet （UV） detection at 238 nm wavelength. The Quinclorac detection limit of this method was 0.012 mg/kg； the recovery rates of different type soil samples lingered in the scope of 74.9% - 98.8% with precision being 6.0% （n=6）. All demonstrate that the method meets the requirements of organic analysis. The method is relatively simple and easy to operate. As well as it can be used to analyze the low concentration of Quinclorac residue in soil sample.

Key words：HPLC； determination； Soil sample； Quinclorac

中圖分類(lèi)號(hào)：O65

DOI：10.13758/j.cnki.tr.2016.02.019

基金項(xiàng)目：①中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所所基金支撐課題項(xiàng)目（20752010028）資助。

作者簡(jiǎn)介：陳虹（1977—），女，江蘇沭陽(yáng)人，碩士，工程師，主要從事儀器分析及研究工作。E-mail： chenhong@issas.ac.cn