家福捕鳥蛛粗毒對(duì)DRG細(xì)胞上電壓門控離子通道的影響

胡朝暾，　周　熙，　肖　震

(1.懷化學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，湖南 懷化　418008；　2.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙　410081)

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家福捕鳥蛛粗毒對(duì)DRG細(xì)胞上電壓門控離子通道的影響

胡朝暾1,2，周熙2，肖震2

(1.懷化學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，湖南 懷化418008；2.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410081)

摘要：采用全細(xì)胞膜片鉗分析，測(cè)定了家福捕鳥蛛粗毒對(duì)DRG細(xì)胞上電壓門控鈉、鉀和鈣離子通道的影響.結(jié)果表明：粗毒對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)細(xì)胞上河豚毒素敏感型鈉通道、河豚毒素不敏感型鈉通道、電壓門控鉀通道、高電壓激活鈣通道和低電壓激活鈣通道都具有抑制作用.100 μg/mL的粗毒分別能夠抑制64.0%河豚毒素敏感型鈉電流、46.5%河豚毒素不敏感型鈉電流、44.2%電壓門控鉀電流和77.7%低電壓激活的鈣電流.50 μg/mL的粗毒能夠抑制大約74.9%高電壓激活的鈣電流.結(jié)果表明家福捕鳥蛛粗毒中可能存在開發(fā)為新型藥物和離子通道工具試劑的毒素分子.

關(guān)鍵詞：家福捕鳥蛛；蜘蛛毒素；膜片鉗分析；電壓門控離子通道；大鼠背根神經(jīng)節(jié)

蜘蛛由大約4億年前泥盆紀(jì)的蛛形綱祖先進(jìn)化而來(lái)[1].其毒腺分泌毒液用于防御天敵和捕殺獵物.國(guó)內(nèi)外的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)蜘蛛毒素主要是一類作用于離子通道及具有特定藥理學(xué)特性的新型化合物的多肽毒素[2-4]，是天然生物毒素的一個(gè)重要來(lái)源，具有開發(fā)為神經(jīng)生物學(xué)的工具試劑、治療特定疾病的新型藥物和殺蟲劑的潛能[5-8].目前，國(guó)際上已發(fā)現(xiàn)了一些來(lái)自蜘蛛毒素可用來(lái)作為某些疾病治療的先導(dǎo)分子[9].

家福捕鳥蛛(Selenocosmiajiafu)是一種生活在中國(guó)廣西、云南等熱帶山區(qū)毒性較強(qiáng)的蜘蛛.該種蜘蛛最先在云南被發(fā)現(xiàn)[10].筆者于2012年4月份在廣西寧明縣發(fā)現(xiàn)了該種蜘蛛并對(duì)其毒素開展了初步的研究.研究發(fā)現(xiàn)家福捕鳥蛛粗毒中多肽和蛋白質(zhì)種類豐富，從粗毒中鑒定得到了238個(gè)多肽和15種蛋白質(zhì)[11].毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明家福捕鳥蛛粗毒對(duì)小鼠的毒性較弱，主要是一類選擇性作用于昆蟲的蜘蛛毒素[12].作為新種蜘蛛的家福捕鳥蛛粗毒中可能包含一些具有特定藥理學(xué)活性或離子通道活性的毒素分子.因此，課題組開展了家福捕鳥蛛粗毒對(duì)DRG細(xì)胞上電壓門控離子通道活性影響的研究，希望能夠篩選得到這些潛在的毒素分子.

1材料與方法

1.1家福捕鳥蛛粗毒及SD大鼠

家福捕鳥蛛采自廣西寧明縣桐棉鄉(xiāng)的山地和農(nóng)區(qū)，置于預(yù)先放有含水海綿的肥皂盒內(nèi)活體帶回湖南，室內(nèi)人工飼養(yǎng).家福捕鳥蛛飼養(yǎng)于用網(wǎng)狀材料覆蓋的塑料桶中，每日給水，每個(gè)星期喂以豬肝(切成大小約1-2 cm3的大小)、蟑螂或面包蟲.采用電刺激的方法每?jī)蓚€(gè)星期采集毒液一次[9].毒液經(jīng)冷凍干燥成白色粉末即為粗毒，放入-20℃低溫存放.SD大鼠購(gòu)置于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué).

1.2溶液配制

DRG細(xì)胞培養(yǎng)液：稱取DMEM干粉346 mg和NaHCO374 mg，溶于20 mL雙蒸水后，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，如DMEM中不含HEPES，則需按2∶1的物質(zhì)的量之比加入.溶液配好后用99.9%的氧氣飽和10 min左右，溶液顏色變?yōu)槌燃t色即可，并于37 ℃水浴預(yù)熱備用.

消化液:稱取膠原酶56 mg和胰蛋白酶0.66 mg，用上述充氧飽和的DMEM培養(yǎng)液5 mL溶解后于37 ℃預(yù)熱備用.

消化抑制劑:胰蛋白酶抑制劑1.2 mg.

測(cè)定DRG細(xì)胞鈉電流的細(xì)胞外液(mmol/L)：NaCl 145，KCl 2.5，CaCl21.5，MgCl21.2，HEPES 10，D-glucose 10，pH用NaOH調(diào)至7.4；電極內(nèi)液(mmol/L)：CsCl 145，MgCl24，HEPES 10，EGTA 10，D-Glucose 10，ATP-Mg 2，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.4.

測(cè)定DRG細(xì)胞鉀電流的細(xì)胞外液(mmol/L)：NaCl 150，KCl 30，CaCl25，MgCl24，TTX 0.3，HEPES 10，D-glucose 10，pH用NaOH調(diào)至7.4；細(xì)胞內(nèi)液(mmol/L)：KCl 135，KF 25，NaCl 9，CaCl20.1，MgCl21，EGTA 1，HEPES 10，ATP-Na23，pH用KOH調(diào)至7.4.

測(cè)定DRG細(xì)胞鈣電流的細(xì)胞外液(mmol/L)：BaCl210，tetraethylammonium Chloride 125，TTX 0.3，HEPES 10，用TEA-OH調(diào)節(jié)pH至7.4；細(xì)胞內(nèi)液(mmol/L)：Cs-methane sulfonate 110，phosphocreatine 14，HEPES 10，EGTA 10,ATP-Mg 5,pH用CsOH調(diào)至7.4.

1.3大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞急性分離和培養(yǎng)

選取30 d左右，體重為180-200 g的SD昆明大白鼠斷頸處死，按照文獻(xiàn)[13]的方法解剖和急性分離培養(yǎng)DRG細(xì)胞.

1.4膜片鉗全細(xì)胞記錄

圖1　家福捕鳥蛛粗毒對(duì)DRG細(xì)胞上電壓門控鈉通道的影響(n=5)注：A、C分別表示對(duì)TTX-S型和TTX-R型鈉電流的影響，B、D分別表示TTX-S型和TTX-R型電流-電壓關(guān)系曲線

膜片鉗全細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前先用對(duì)應(yīng)的細(xì)胞外液更換細(xì)胞培養(yǎng)液.電極由拋光的玻璃電極經(jīng)電極拉制儀兩步拉制而成.電極入水前，給予一定的正壓，使電極尖端不易被堵塞，入水電阻1.8～3 MΩ為宜.入水后進(jìn)行電位補(bǔ)償.在顯微鏡下調(diào)節(jié)微操，使電極接近細(xì)胞，當(dāng)電極電阻增大0.3 MΩ左右時(shí)停止.給予持續(xù)負(fù)壓，當(dāng)電阻上升50 MΩ時(shí)停止，調(diào)為全細(xì)胞模式，給予-80mV的鉗制電壓以形成吉?dú)W(GΩ)封接，進(jìn)行快電容補(bǔ)償和串聯(lián)電阻補(bǔ)償(補(bǔ)償65%～70%).然后進(jìn)行電流記錄.離子通道電流經(jīng)過(guò)3 kHz和10 kHz的雙重過(guò)濾，采用P/4程序刪除電容電流和線性漏電流.電流的記錄和采集應(yīng)用Pulse+Pulsefit8.0軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采用SigmaPlot 10.0軟件完成.所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n為獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的次數(shù).

2結(jié)果與分析

2.1粗毒對(duì)DRG細(xì)胞電壓門控鈉通道活性的影響

電壓門控鈉通道是神經(jīng)和肌肉細(xì)胞快速去極化和動(dòng)作電位產(chǎn)生的基礎(chǔ)，動(dòng)作電位的產(chǎn)生首先就是鈉通道電流的內(nèi)流.研究發(fā)現(xiàn)電壓門控鈉通道與一些臨床疾病密切相關(guān).因此，電壓門控鈉通道是一些重要藥物分子作用的靶位點(diǎn)[14].根據(jù)鈉通道能否被河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)所阻斷，可將鈉通道分為兩大類，河豚毒素敏感型(TTX-sensitive，TTX-S)和河豚毒素不敏感型(TTX-resistant,TTX-R).1 nmol/L TTX能夠阻斷TTX-S鈉通道，當(dāng)TTX濃度達(dá)到0.1 mmol/L時(shí)，TTX-R鈉通道電流不能夠被阻斷[15].DRG細(xì)胞能夠表達(dá)這兩類鈉通道電流.采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，測(cè)定了家福捕鳥蛛粗毒對(duì)DRG細(xì)胞TTX-S和TTX-R鈉通道的影響.首先，分別選取大直徑(>35 μm)的DRG細(xì)胞和小直徑(<20 μm)的DRG細(xì)胞分別記錄TTX-S鈉通道和TTX-R鈉通道[16].實(shí)驗(yàn)時(shí)將膜電位鉗制在-80 mV，給予脈沖寬度為50 ms，以10 mV步幅遞增的去極化電壓刺激引出DRG細(xì)胞鈉電流.結(jié)果表明粗毒對(duì)DRG細(xì)胞上電壓門控鈉通道具有明顯的抑制作用.100 μg/mL粗毒能夠抑制64.0%±6.2%(n=5)TTX-S鈉電流和能夠延緩TTX-S鈉通道電流的失活(圖1A).另外，粗毒還改變TTX-S鈉通道I-V曲線，粗毒加入后去極化電流漂移了20 mV(從-10 mV到+10 mV)(圖1B).其次，也進(jìn)行了粗毒對(duì)TTX-R鈉通道活性的測(cè)定.選取直徑小的DRG細(xì)胞記錄得到鈉電流，當(dāng)加入200 nmol/L TTX時(shí)抑制掉TTX-S鈉電流，剩下的電流為TTX-R鈉電流.加入粗毒后TTX-R鈉電流出現(xiàn)明顯的抑制作用，100 μg/mL粗毒能夠抑制46.5%±3.8%(n=5)TTX-R鈉通道電流(圖1C).粗毒對(duì)TTX-R通道電流的I-V曲線也有影響，粗毒加入后峰電壓由-10 mV移到-20 mV(圖1D).說(shuō)明粗毒中有DRG細(xì)胞TTX-R鈉通道的抑制劑.眾所周知，DRG細(xì)胞表達(dá)的TTX-R鈉電流主要為Nav1.8和Nav1.9電流，這兩類鈉通道電流也是目前研究的熱點(diǎn).Nav1.8被認(rèn)為是和神經(jīng)性疼痛相關(guān)[17]，而Nav1.9通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性從而與炎癥反應(yīng)和疼痛調(diào)節(jié)緊密相關(guān)[18].因此，粗毒中可能具有潛在的開發(fā)為鎮(zhèn)痛活性的藥物分子.

2.2粗毒對(duì)DRG細(xì)胞電壓門控鉀通道活性的影響

背根神經(jīng)節(jié)(DRG)上表達(dá)多種鉀離子通道，有電壓激活鉀離子通道(Kv)、鈣激活的鉀通道(KCa)、內(nèi)向整流鉀通道(Kir)以及背景鉀通道(leak,K2P)等.這些通道有助于膜復(fù)極化，靜息膜電位，發(fā)燒的頻率和感覺神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)[19,20].在所有的鉀通道中，電壓激活鉀通道在細(xì)胞去極化回復(fù)到靜息狀態(tài)過(guò)程中起著重要的作用，對(duì)該通道的抑制能夠?qū)е聞?dòng)作電位幅度的加寬[21].將膜電位鉗制在-80 mV，給予脈沖寬度為500 ms，以10 mV步幅遞增的去極化到+60 mV電壓刺激引出DRG細(xì)胞電壓門控鉀電流.研究表明粗毒對(duì)DRG細(xì)胞上電壓門控鉀通道電流具有明顯的抑制作用，100 μg/mL粗毒能夠抑制44.2%±5.3%(n=5)鉀電流(圖2A).圖2B為粗毒加入前后電壓門控鉀通道電流-電壓關(guān)系曲線圖，從圖中可以看出粗毒改變了DRG細(xì)胞電壓門控鉀通道的起始激活電壓.濃度為100 μg/mL粗毒使得鉀通道的激活電壓由-50±2.6 mV變?yōu)?20±1.7 mV.粗毒加入前后鉀通道的半激活電壓分別為21.9±2.8 mV和25.5±2.0 mV.

圖2　家福捕鳥蛛粗毒對(duì)DRG細(xì)胞電壓門控鉀通道的影響(n=5)注：A表示對(duì)鉀通道電流的影響，B表示其電流-電壓關(guān)系曲線圖

2.3粗毒對(duì)DRG細(xì)胞電壓門控鈣通道活性的影響

電壓門控鈣通道廣泛存在于機(jī)體的不同類型組織細(xì)胞中，它通過(guò)調(diào)控Ca2+進(jìn)入細(xì)胞來(lái)影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、神經(jīng)分泌、神經(jīng)元興奮和基因表達(dá)的調(diào)控等生理過(guò)程.根據(jù)它們生理學(xué)和藥理學(xué)特征的不同，目前在脊椎動(dòng)物中鑒定發(fā)現(xiàn)了5種主要的鈣離子通道亞型(T、L、N、P/Q和R型)[22-24].高電壓激活鈣通道(L、N、P/Q和R型)需要很高的去極化電壓才能夠被激活，而且高電壓激活鈣通道與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放密切相關(guān).低電壓激活的鈣通道(T型鈣通道)具有在較低的鉗制電壓激活、快速失活的特征.它能夠調(diào)控神經(jīng)元和心肌細(xì)胞起搏器的重復(fù)性活動(dòng)[25].采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，將膜電位鉗制在-90 mV，給予脈沖寬度為150 ms，以10 mV步幅遞增的去極化電壓刺激引出DRG細(xì)胞電壓門控鈣通道電流，加入粗毒檢測(cè)其對(duì)鈣通道電流的影響.研究表明，家福捕鳥蛛粗毒對(duì)DRG細(xì)胞上電壓門控鈣通道具有明顯的抑制作用，濃度為100 μg/mL的粗毒能夠抑制大約65.4%±9.5%(n=5)鈣電流(圖3A).圖3B為DRG細(xì)胞電壓門控鈣通道電流電壓關(guān)系圖，從圖中可以看出粗毒對(duì)鈣通道電流的起始激活電壓、峰電壓和反轉(zhuǎn)電壓都沒有明顯的影響.

圖3　家福捕鳥蛛粗毒對(duì)DRG細(xì)胞電壓門控鈣通道的影響(n=5)注：A表示鈣通道電流，B表示電流-電壓關(guān)系曲線，C、D分別表示低、高電壓激活的鈣通道電流

另外，分別測(cè)定了粗毒對(duì)DRG細(xì)胞上高電壓激活的鈣通道和低電壓激活的鈣通道的影響.圖3C為粗毒對(duì)低電壓激活的鈣通道的抑制活性圖譜.將膜電位鉗制在-90 mV，給予脈沖寬度為150 ms，去極化到-20 mV電壓刺激引出低電壓激活的鈣通道電流，濃度為100 μg/mL的粗毒能夠抑制大約77.7%±9.9%(n=5)低電壓激活的鈣電流.T型鈣通道廣泛分布在神經(jīng)元疼痛通路中，與痛覺調(diào)制密切相關(guān).到目前為止還未發(fā)現(xiàn)專一性很好的T型鈣通道抑制劑.因此，如果能從家福捕鳥蛛粗毒中篩選到專一性很好T型鈣通道抑制劑是具有重要意義的.家福捕鳥蛛粗毒對(duì)低電壓激活的鈣通道具有抑制作用表明粗毒中可能含有T型鈣通道抑制劑的毒素分子.最后，發(fā)現(xiàn)粗毒對(duì)DRG細(xì)胞上高電壓激活的鈣通道也有明顯的抑制作用.將膜電位鉗制在-40 mV，給予脈沖寬度為150 ms，去極化到+10 mV電壓刺激引出高電壓激活的鈣通道電流，濃度為50 μg/mL的粗毒能夠抑制大約74.9%±2.8%(n=5)高電壓激活的鈣電流(圖3D).目前，已鑒定的幾種高電壓激活的鈣通道亞型在DRG細(xì)胞上都能夠表達(dá).N型鈣通道阻滯劑能夠有效的減輕因機(jī)械、化學(xué)和熱刺激引起的痛覺過(guò)敏和異常性痛疼[26].P/Q型鈣通道與一些特定疾病如癲癇，共濟(jì)失調(diào)和偏頭痛等直接有關(guān)[27].希望在家福捕鳥蛛粗毒中鑒定得到專一性很好的高電壓激活鈣通道的抑制劑.

3結(jié)論

蜘蛛毒素是選擇性作用于昆蟲和哺乳動(dòng)物具有重要生理功能的活性物質(zhì)的重要來(lái)源.家福捕鳥蛛粗毒是一類新型的到目前為止還未開發(fā)利用的蜘蛛毒素.課題組對(duì)這種粗毒的離子通道活性進(jìn)行了初步的分析.研究發(fā)現(xiàn)家福捕鳥蛛粗毒中含有一些對(duì)DRG細(xì)胞上電壓門控鈉、鉀和鈣離子通道有活性的神經(jīng)毒素，特別是粗毒對(duì)DRG細(xì)胞TTX-R通道和T型鈣通道具有抑制活性.進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)需要從粗毒中篩選和鑒定這兩種通道的抑制劑.現(xiàn)有研究為后續(xù)開展家福捕鳥蛛單一毒素分子的分離純化、結(jié)構(gòu)與功能研究提供了基礎(chǔ).

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Effects of Venoms from the Sqider Selenocosmia Jiafu on Voltage-gated Ion Channels in Rat Dorsal Root Ganglion Neurons

HU Zhao-tun1,2,ZHOU Xi2,XIAO Zhen2

(1.CollegeofBiologicalandFoodEngineering,HuaihuaUniversity,Huaihua,Hunan418008；2.CollegeofLifeSciences,HunanNormalUniversity,Changsha,Hunan410081)

Abstract：Selenocosmiajiafuis recently identified new species of spider in P.R.China.These medium bodied venomous spiders are distributed mainly in the hilly areas of southwest of China,mostly in Yunnan and Guangxi Province.The venom of this spider contains many components with different biological activities.In order to explore the utility of this rich source,researchers observed the effects of the venoms from the spiderSelenocosmiajiafuon voltage-gated ion Na+,K+and Ca2+channels in rat dorsal root ganglion neurons by voltage-clamp analysis.The venom could inhibit tetrodotoxin-sensitive sodium channels,tetrodotoxin-resistant sodium channels,voltage-gated potassium channel,high-voltage-activated calcium channels and low voltage-activated calcium channels in rat DRG neurons as revealed by voltage-clamp analysis.Crude venom at concentration of 100 μg/mL could inhibit 64.0%±6.2% tetrodotoxin-sensitive sodium current,46.5%±3.8% tetrodotoxin-insensitive sodium current,44.2%±5.3% voltage-gated potassium currents and 77.7%±9.9% low-voltage-activated calcium currents.At a concentration of 50 μg/mL,the venom could inhibit approximately 74.9%±2.8% of high voltage-activated calcium currents.It suggested that the venom might contain various channel antagonists,which could become candidates for valuable tools for investigation of ion channels and drug development.

Key words：Selenocosmiajiafu；spider venom；patch clamp analysis；voltage-gated ion channel；dorsal root ganglion(DRG)

收稿日期：2016-02-19

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳青年基金項(xiàng)目(13B087)；湖南省高校產(chǎn)業(yè)化培育項(xiàng)目(10CY014)；民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(HHUW2011-53,YYZW2014-1).

作者簡(jiǎn)介：胡朝暾，1977年生，男，湖南益陽(yáng)人，講師，博士，研究方向：藥用植物與蜘蛛毒素.

中圖分類號(hào)：Q599

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-9743(2016)05-0047-05