基于血清代謝組學(xué)的2型糖尿病大鼠運動干預(yù)的定量生物學(xué)研究

李蕾　劉承宜

摘 要：基于血清代謝組學(xué)和定量差異探討2型DM大鼠的運動干預(yù)機(jī)制。Sprague dawley大鼠分為正常對照組（NC）、DM模型組（DMC）和DM運動干預(yù)組（DME）。DMC和DME組大鼠予以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，以40 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素造模穩(wěn)定1周。DME組大鼠實施游泳運動干預(yù)8周。采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC/Q-TOF MS）技術(shù)對不同組別大鼠的血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，利用定量差異對代謝組學(xué)獲得的生物標(biāo)記物進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示：1）DME組、DMC組和NC組的血清代謝譜明顯分離，表明DME組血清代謝譜與DMC組和NC組之間有顯著的變化；2）血清中精氨酸、脯氨酸-甜菜堿、二十碳五烯酸、亞麻酸、丙基肉堿、單甘油酸酯（24：6）、肉毒堿、1-磷酸鞘氨醇、葡糖酸、和磷酸膽堿（20：3）共10種代謝產(chǎn)物在DMC組和NC組間存在顯著性定量差異（l>0.80），除了單甘油酸酯（24：6）和磷酸膽堿（20：3）外，8周游泳訓(xùn)練可以將DME大鼠體內(nèi)的其它8種物質(zhì)恢復(fù)到與NC組沒有顯著性差異（l<0.47）。結(jié)果表明：（1）游泳訓(xùn)練可以完全康復(fù)2型DM大鼠。（2）多不飽和脂肪酸和精氨酸代謝有望成為今后研究運動干預(yù)2型DM機(jī)制的新鮮靶點。

關(guān) 鍵 詞：運動醫(yī)學(xué)；2型糖尿病；運動干預(yù)；代謝組學(xué)；定量差異；大鼠

中圖分類號：G804.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-7116（2016）04-0140-05

Quantitative biological study of exercise intervention on type 2 diabetes mellitus

rats based on serum metabonomics

LI Lei1，LIU Cheng-yi2

（1.School of Physical Education，Huaibei Normal University，Huaibei 235000，China；2.Laboratory of Laser Sports Medicine，School of Physical Education，South China Normal University，Guangzhou 510006，China）

Abstract： In order to probed into the mechanism of exercise intervention on type 2 diabetes mellitus （DM） rats based on serum metabonomics and quantitative difference， the authors divided Sprague Dawley rats into a normal control group （NC）， a DM control group （DMC） and a DM exercise group （DME）， fed the rats in groups DMC and DME with high-sugar high-fat feed for 4 weeks， and intraperitoneally injected them with streptozotocin at a dose of 40 mg/kg body weight for 1 week in order to stabilize model establishment， implemented swimming intervention on the rats in group DME for 8 weeks， carried out a metabonomic analysis on the serum of the rats in different groups by using ultra performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry （UPLC/Q-TOF MS）， screened biomarkers acquired from the metabonomic analysis by utilizing quantitative difference， and revealed the following findings： 1） there was a clear separation of serum metabolic profile of the rats in groups DME， DMC and NC， indicating that there was a significant change in serum metabolic profile between the rats in group DME and the rats in groups DMC and NC； 2） between the rats in groups DMC and NC， there was a significant quantitative difference in Arginine， Proline betaine， Eicosapentaenoic acid， Linolenic acid， Propionyl-L-carnitine， MG（24：6）， Carnitine， Sphingosine-1-phosphate， Gluconic acid and PE（20：3）（l>0.80）， except MG（24：6） and PE（20：3） were completely recovered after 8-week exercise intervention（l<0.47）. The said findings indicate the followings： 1） swimming training can fully rehabilitate type 2 DM rats； 2） polyunsaturated fatty acid and arginine metabolism are hopefully to become new targets of study of the mechanism of exercise intervention on type 2 DM in the future.

Key words： sports medicine；type 2 diabetes mellitus；exercise intervention；metabonomics；quantitative difference；rat

DM運動干預(yù)研究已經(jīng)有90年的歷史了[1]。然而，對運動療法的防治機(jī)理仍缺乏系統(tǒng)深入的認(rèn)識；其臨床療效對疾病死亡率的影響依然不大。這可能與傳統(tǒng)的“還原論”思維指導(dǎo)下的實驗方法不足有一定關(guān)系[2]（微觀靶點繁多，整體靶點不明確）；也可能與傳統(tǒng)的完全依賴零假設(shè)統(tǒng)計檢驗（Null Hypothesis Statistical Testing，NHST）有一定關(guān)系[3-4]。

“代謝組學(xué)”是指對生物體內(nèi)相對分子質(zhì)量小于1 000的低相對分子質(zhì)量代謝物的變化進(jìn)行檢測、確定、定量和分類，尋找它們在類型和數(shù)量上的變化與生理病理變化之間的關(guān)系和動態(tài)規(guī)律[5]。鑒于運動干預(yù)機(jī)制具有多靶點、非特異性、成組調(diào)節(jié)的特點，有學(xué)者認(rèn)為可以把“代謝組學(xué)”方法作為運動人體科學(xué)研究中的一個有力的新工具，并定義為“運動代謝組學(xué)”（sportomics）[2，6]。2型DM作為代謝性疾病的典型，是代謝組學(xué)方法非常適宜的研究對象。在利用代謝組學(xué)技術(shù)研究運動干預(yù)代謝紊亂的相關(guān)文獻(xiàn)中，急性運動的偏多，慢性運動的很少。尤其是缺乏對慢性疾病動物模型的長期的、縱向的研究?？墒?，已有的代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示，疾病和干預(yù)后機(jī)體的代謝紊亂物質(zhì)及代謝通路繁多，缺乏有效的篩選方法鎖定差異代謝物，導(dǎo)致機(jī)制闡釋泛泛而無針對性。因此，也限制了代謝組學(xué)方法在干預(yù)效應(yīng)研究中的應(yīng)用。劉承宜等[7-8]引入黃金分割常數(shù)來度量差異，并提出了定量差異的概念，為差異代謝物的篩選和更好地闡釋運動效應(yīng)的定量生物學(xué)內(nèi)涵提供了方法學(xué)支撐。

因此，本研究依據(jù)文獻(xiàn)報道建立2型DM大鼠模型[9]，采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（ultra-performance liquid chromatogra phy/quadrupole-

time-of-flight mass spectrometry，UPLC /Q-TOF MS）分別對大鼠的血清樣本進(jìn)行測試分析，通過原始數(shù)據(jù)提取、歸一化處理、多維統(tǒng)計等對樣本進(jìn)行模式識別，比較分析不同組別大鼠的代謝狀態(tài)，尋找運動干預(yù)改善2型DM大鼠內(nèi)源性代謝變化的生物標(biāo)記物及其相關(guān)代謝途徑，并利用定量差異對2型DM大鼠運動干預(yù)的生物標(biāo)記物進(jìn)行篩選，探討運動干預(yù)2型DM大鼠的定量生物學(xué)內(nèi)涵，為評價運動干預(yù)2型DM大鼠的治療作用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物造模與取材

40只雄性Sprague dawley（SD）大鼠（140～160 g），購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，飼養(yǎng)于揚州大學(xué)動物實驗中心，每日光照12 h，室溫（24±0.8） ℃，相對濕度60 %，自由飲水?dāng)z食。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，通過隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)選取30只大鼠予以高糖高脂飼料（73.5%的基礎(chǔ)飼料、13%豬油、1%的膽固醇、0.5%膽鹽、8%蔗糖和4%的大豆粉，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）喂養(yǎng)4周，之后以40 mg/kg實施腹腔注射STZ造模，觀察大鼠飲食、體質(zhì)量、尿量等生理指標(biāo)，穩(wěn)定1周后剪尾取血測定空腹血糖和隨機(jī)血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L為2型DM大鼠造模成功[9]。另10只大鼠給予適量生理鹽水腹腔注射對照，設(shè)為正常對照組（normal control，NC），普食喂養(yǎng)至實驗結(jié)束。

造模成功率約70%以上，結(jié)果與文獻(xiàn)報道相一致[9]。將造模成功的21只大鼠按血糖水平高低分成若干個區(qū)組，然后將每個血糖范圍的大鼠隨機(jī)分到兩個組。其中10只作為DM模型組（diabetes mellitus control，DMC），普食喂養(yǎng)8周至實驗結(jié)束。另11只作為DM運動干預(yù)組（diabetes mellitus exercise，DME），普食喂養(yǎng)，游泳運動干預(yù)，共8周，每周訓(xùn)練6 d，休息1 d，訓(xùn)練時間從20～60 min不等的逐漸適應(yīng)，到適應(yīng)后90 min/d。8周后，運動組末次運動禁食12 h后，所有大鼠苯巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血，離心取血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma公司（貨號：S0130）；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC/MS）級乙腈、超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）級甲醇購自Merck公司（Dannstadt，Gennany）；甲酸購自CNW公司；其余試劑為市售分析純。實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

1.3 實驗儀器

儀器分析平臺為UPLC/Q-TOF MS（Agilent，1290 Infinity LC，6530 UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS），分離色譜柱為C18色譜柱（Agilent，100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。FRESCO 17離心機(jī)（ThermoFisher Scientific）；SK5200HP超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Mettler AE240天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；EYEL MG-2200氮吹儀（TOKYO RIKA KIKAL C0LTD）；Tissuelyser-24研磨儀（上海凈信科技）；VORTEX渦旋儀（LABNET）。

1.4 UPLC/Q-TOF MS實驗流程

1）血清樣本前處理。樣本常溫下解凍后，移液槍精準(zhǔn)移取100 μL樣本，置于1.5 mL的離心管，采用甲醇沉淀蛋白，加入0.5 mL低溫甲醇，采用超聲破碎，低溫離心（15 000 r/min，5 min），吸取上清液；殘渣中再次加入0.5 mL的低溫甲醇，重復(fù)上述步驟，合并上清液。取200 μL上清液于進(jìn)樣小瓶中待測。

2）色譜分離及質(zhì)譜條件。柱溫為40 ℃；流速0.4 mL / min；流動相組成A（水+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）、B（乙腈+質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1 %甲酸）；線性梯度洗脫條件：0～2 min，5% B；2～17 min，5%～95 % B；17～19 min，95% B。進(jìn)樣量為4 μL，自動進(jìn)樣器溫度4 ℃。

鎖定質(zhì)量（Lock mass）使用亮氨酸-腦啡肽，以確保質(zhì)量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。正離子模式下產(chǎn)生[M+H]+離子556.2771 u。負(fù)離子模式下產(chǎn)生[M-H]-離子554.2615 u。

1.5 原始數(shù)據(jù)處理與多維統(tǒng)計分析

使用基于R平臺的XCMS軟件對LC/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行濾噪、峰對齊、歸一化等預(yù)處理，然后將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P軟件（11.0 demo version，Umetrics AB，Ume，Sweden）進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘-判別分析法（orthogonal partial least-square discriminant analysis，OPLS-DA）等多維統(tǒng)計分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理和信息挖掘。

1.6 潛在生物標(biāo)記物的挖掘及鑒定

本實驗尋找OPLS模型中的VIP（Variable Importance in the Projection）值，然后再進(jìn)行單維t檢驗，綜合VIP>1和P值（P<0.05）最終確定差異性表達(dá)代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數(shù)據(jù)庫（http：//metlin.scripps.edu/）（比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量mass），將獲得的二級質(zhì)譜圖與候選化合物進(jìn)行比對分析，鑒定化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.7 定量差異

劉承宜等[8-9]提出了定量差異的概念：對于任何兩個數(shù)x和y，它們之間的相對差異可以用l來度量，稱為l級定量差異：

l=│logτ（x/y）│=│lg（x/y）/lgτ│

基因組學(xué)[10]和蛋白質(zhì)組學(xué)[11]要求基因或蛋白質(zhì)上調(diào)后的倍數(shù)超過1.5或2.0，下調(diào)后的倍數(shù)低于0.667或0.5，相應(yīng)l的量級為0.84或1.44，顯然與分子細(xì)胞水平的l量級（0.80，1.27）比較接近，但后者比前者更加精細(xì)，當(dāng)然有待實驗的進(jìn)一步驗證。本實驗依據(jù)定量差異對鑒定出的差異代謝物進(jìn)行篩選。

2 研究結(jié)果及分析

2.1 動物造模期體質(zhì)量特征和變化

體質(zhì)量定量差異的顯著性量級為（0.27，0.47）[7-8]。如表1所示，高脂時（1）的模型組體質(zhì)量定量上顯著低于正常組（l>0.27），之后逐漸接近；注射STZ造模后，模型組大鼠體質(zhì)量迅速下降（l>0.27），且伴隨有飲水量和尿量明顯增多，毛色暗淡、缺乏光澤，精神萎靡，鼠籠潮濕，攝食量在短暫減少后有所增加，提示2型DM大鼠模型造模成功。另外，除了高脂時（2）之外，對照組與模型組的體質(zhì)量的統(tǒng)計差異和定量差異完全一致。

2.2 運動對2型DM大鼠的改善作用

血糖定量差異的顯著性量級為（0.80，1.27）[7-8]。如表2所示，NC組實驗期間體質(zhì)量穩(wěn)步增加（P<0.05，l>0.47），空腹血糖變化不明顯（l<0.80）。DMC組實驗期間體質(zhì)量幾乎不變（l<0.27），呈現(xiàn)消瘦、多飲、多食和多尿的“三多一少”癥狀，空腹血糖沒有顯著性變化（l<0.80）。經(jīng)過8周的運動干預(yù)，DME組大鼠表現(xiàn)為消瘦癥狀顯著減輕，體質(zhì)量不增的狀況得到改善（P<0.05，l>0.27），同時空腹血糖水平顯著低于干預(yù)前（P< 0.05；l<0.80）。

2.3 三組大鼠血清樣本的PCA模型

主成分回歸產(chǎn)生的權(quán)重矩陣反映的是預(yù)測變量X之間的協(xié)方差，可以反映樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)變異度大小。模型參數(shù)為R2X=0.611；Q2=0.404。R2X代表模型的解釋率，大于0.4表示模型可靠。PCA得分表明，3組能夠達(dá)到較好地分離，且DME組位于DMC和NC組之間。

2.4 定量差異篩選結(jié)果

本實驗依據(jù)定量差異對鑒定出的差異代謝物進(jìn)行篩選，得到10個代謝物信息，如表3所示。相比于NC組大鼠，DMC組大鼠體內(nèi)的精氨酸（Arginine，Arg）、肉毒堿（Carnitine）、丙基肉堿（Propionyl-L-carnitine，PLC）、1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-phosphate，SPP）和葡糖酸（Gluconic acid）有顯著性升高（l<0.80），二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、亞麻酸（linolenic acid，LA）和脯氨酸-甜菜堿（Proline betaine）顯著性降低（l<0.80），經(jīng)過8周游泳訓(xùn)練后，DME組大鼠體內(nèi)的這些物質(zhì)恢復(fù)到與NC組沒有顯著性差異（l<0.47）。

相比于NC組大鼠，DMC組大鼠體內(nèi)的單甘油酸酯（Monoglyceride，MG）（24：6）（MG（24：6））和磷酸膽堿（Phosphatidylethanolamines，PE）（20：3）（PE（20：3））都有非常顯著性升高（l>1.27），經(jīng)過8周游泳訓(xùn)練后，DME組大鼠體內(nèi)的這些物質(zhì)都有非常顯著性降低，但還沒有恢復(fù)到NC組的水平。

3 討論

3.1 定量差異

本研究討論的體質(zhì)量屬于機(jī)體水平，l的顯著性量級為（0.27，0.47）。從表1可以看出，除了高脂時（2）之外，統(tǒng)計檢驗和l分析的結(jié)果完全一致。統(tǒng)計檢驗無法區(qū)分造模時和造模后，但l分析可以。造模時存在顯著性差異，造模后則存在非常顯著性差異。從表2可以看出，在干預(yù)期間，NC組體質(zhì)量非常顯著增加（l>0.47），但DMC組保持不變，DME組可以部分恢復(fù)體質(zhì)量，但與NC組差一個量級（0.27< l<0.47）。

本研究討論的血糖和代謝組分屬于細(xì)胞分子水平，l的顯著性量級為（0.80，1.27）。從表2可以看出，干預(yù)期間，NC組和DMC組的血糖水平都保持不變（l<0.80），但DME組血糖顯著降低（l>0.80），而且最后血糖水平與相應(yīng)的NC組沒有顯著性差異（l<0.80）。

3.2 生物標(biāo)記物的定量生物學(xué)內(nèi)涵

大鼠體內(nèi)不能自行合成LA和EPA等多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），必須直接從食物中攝取或由前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與生產(chǎn)C20 PUFA相關(guān)性較大的是△6去飽和酶和Elovl2延長酶[13]?！?去飽和酶是一種膜結(jié)合脂肪酸脫飽和酶，能催化脂肪酸碳鏈中C-C單鍵轉(zhuǎn)換成C=C雙鍵[14]。Elovl2延長酶屬于ELOVL家族，可以將飽和、單飽和脂肪酸延長為PUFA[15]。它的同源體Elovl3第一個被發(fā)現(xiàn)，且與棕色脂肪增生和非顫抖性產(chǎn)熱有關(guān)[16]。本實驗中，DMC組大鼠體內(nèi)LA和EPA含量較NC組非常顯著性降低（l>1.270），可能是因為DM大鼠體內(nèi)物質(zhì)代謝分解加快，脂肪消耗較大所致，機(jī)體盡可能動員脂肪，提高脂肪酸利用率，肉毒堿含量也較NC組相應(yīng)增加。運動是否引起了脂肪酸碳鏈延長和脂肪酸脫氫反應(yīng)代謝途徑中的Elovl2延長酶和△6去飽和酶的活性，從而參與調(diào)控脂類合成和氧化代謝，值得關(guān)注和研究。該方向的研究可能為運動調(diào)節(jié)脂肪酸代謝在代謝性疾病防治作用中的貢獻(xiàn)提供機(jī)制參考。

Ramírez-Zamora等[17]測定2型DM不正規(guī)治療患者和健康對照者血清和紅細(xì)胞中Arg、鳥氨酸（Ornithine，Orn）、瓜氨酸（Citruline，Cit）、尿素（Urea）等指標(biāo)含量發(fā)現(xiàn)，DM患者改變了代謝物在血清和紅細(xì)胞之間的分布。紅細(xì)胞調(diào)節(jié)氮代謝，可能是通過上調(diào)Arg的血清代謝水平實現(xiàn)的。本實驗中，DMC組大鼠體內(nèi)Arg含量較NC組非常顯著性升高（l>0.80）。與Ramírez-Zamora等[17]人體研究結(jié)果還是吻合的。同時，也可能是2型DM大鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)分解加速，導(dǎo)致內(nèi)源性Arg來源增多，而降解不足，其平衡被打破，導(dǎo)致血清含量顯著升高。8周的運動干預(yù)可以下調(diào)Arg含量至正常組水平，可能與運動促進(jìn)了大鼠機(jī)體內(nèi)源性Arg的動態(tài)平衡有關(guān)?？赡苁沁\動中Cit調(diào)節(jié)了內(nèi)源性Arg的動態(tài)平衡[18]?？梢?，骨骼肌作為運動的動力器官，骨骼肌Arg / NO代謝途徑在運動條件下的反應(yīng)和適應(yīng)以及與血液Arg/NO、及肝臟Urea循環(huán)之間的關(guān)系可成為今后研究運動改善代謝性疾病機(jī)制的新的關(guān)注點。

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