芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式及其影響因素分析

吳彥慶，趙大球，陶　俊

（揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院/江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 22509）

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芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式及其影響因素分析

吳彥慶，趙大球，陶俊

（揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院/江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 22509）

摘要：【目的】芍藥花色的優(yōu)劣影響其觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，研究芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用偏好性和密碼子使用模式的影響因素，為芍藥花色調(diào)控基因在mRNA翻譯、轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)、新基因表達(dá)與功能預(yù)測(cè)以及分子生物進(jìn)化研究提供參考?！痉椒ā扛鶕?jù)前期芍藥花色嵌合體品種‘金輝’轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選的6 345個(gè)芍藥花色調(diào)控基因，并根據(jù)CDS序列特征和大于300 bp原則進(jìn)行過濾后最終獲得的2 234個(gè)基因序列作為研究對(duì)象，利用Mobyle軟件計(jì)算GC含量、第1與2位密碼子的平均GC含量（GC12）、第3位密碼子的GC含量（GC3s）、有效密碼子數(shù)ENC、密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI、相對(duì)同義密碼子使用度RSCU等密碼子偏性指標(biāo)，其次進(jìn)行中性繪圖（GC12 vs. GC3）、ENC-GC3s繪圖以及PR2（Parity Rule 2）繪圖分析，并運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法探討突變壓力和選擇作用對(duì)密碼子使用模式的影響程度，最后以5％CAI值作為高、低表達(dá)樣本組，計(jì)算這兩個(gè)樣本組的同義密碼子相對(duì)使用度，利用卡方檢驗(yàn)Chi-square test分析兩組之間的顯著性差異來確定最優(yōu)密碼子?！窘Y(jié)果】芍藥花色相關(guān)基因的密碼子GC3s含量為46.37％，大部分基因GC含量主要分布在30％—55％；中性繪圖分析表明GC3s與GC12呈極顯著的正相關(guān)（R2=0.202，P＜0.01）；ENC-GC3s繪圖表明大部分基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線周圍，也有一部分基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方較遠(yuǎn)的位置，同時(shí)大部分基因（ENCexp-ENCobs）/ENCexp比值集中分布在0.0—0.4；PR2繪圖分析顯示密碼子第三位T的使用頻率高于A，C使用頻率高于G，表明嘌呤（A和G）與嘧啶（T和C）的使用頻率并不均衡；對(duì)應(yīng)性分析COA（Correspondence Analysis）表明，第一軸上顯示了38.09％的差異，其他3個(gè)軸分別為18.42％、15.09％、14.59％，表明芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式評(píng)價(jià)以第一軸（Axis 1）為主；突變壓力和選擇作用分析發(fā)現(xiàn)，第一主軸與GC3s、CAI的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著正相關(guān)（R2=0.736，P＜0.01；R2=0.286，P＜0.01）；利用△RSCU和卡方顯著性檢驗(yàn)的方法，確定了21個(gè)為芍藥花色調(diào)控相關(guān)基因的最優(yōu)密碼子，其中18個(gè)以G或C結(jié)尾，僅CGU、GGU等2個(gè)密碼子以U結(jié)尾。【結(jié)論】芍藥花色調(diào)控基因的最優(yōu)密碼子多數(shù)以G/C結(jié)尾，并且密碼子使用模式主要受到堿基差異（R2=0.736）和基因表達(dá)水平（R2=0.286）共同作用的影響，其中堿基差異占主導(dǎo)因素。本研究了解了芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式情況，為通過密碼子改造開展芍藥花色遺傳改良以及分子進(jìn)化研究提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：芍藥；花色調(diào)控基因；密碼子使用模式；影響因素

聯(lián)系方式：吳彥慶，E-mail：yqwu19880928@126.com。通信作者陶俊，E-mail：taojun@yzu.edu.cn

0 引言

【研究意義】遺傳密碼是連接DNA和蛋白質(zhì)的重要橋梁，每種氨基酸至少對(duì)應(yīng)一個(gè)遺傳密碼子（一般不超過6個(gè)），編碼同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子。同義密碼子在使用頻率中存在一定的差異，這種現(xiàn)象稱為密碼子使用偏好性（codon usage bias，CUB），并且在某一特定物種或者基因中比較傾向使用的同義密碼子稱為最優(yōu)密碼子（optimal codons）［1］。不同物種間基因組的 CUB現(xiàn)象可能不同，表明這些物種在進(jìn)化過程中可能受到的突變壓力和選擇作用的影響不同［2］，因此，密碼子偏好性的量化，能夠幫助有效理解物種機(jī)體的進(jìn)化發(fā)展［2］，同時(shí)密碼子偏好性的分析還能夠有效的幫助同義密碼子使用偏性相關(guān)機(jī)制的理解［3］。其次，密碼子偏性的分析有助于了解轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制，在預(yù)測(cè)外源基因的最適宿主和通過改良外源基因以提高其表達(dá)水平等方面也具有重要生物學(xué)意義［4］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】影響密碼子偏好性的因素較多，目前主要集中在突變壓力（如GC含量［5］、基因堿基組成［6］）和選擇作用（如基因表達(dá)水平［7］、tRNA豐度［8］、蛋白結(jié)構(gòu)與長(zhǎng)度［9］、翻譯的起始信號(hào)［10］）兩個(gè)方面。目前密碼子偏好性的研究在不斷發(fā)展，從研究方向來看，對(duì)于特定基因密碼子偏好性，以前主要研究原核生物以及低等真核生物中密碼子偏好性對(duì)基因表達(dá)的影響［11］，隨后開始關(guān)注高等動(dòng)植物的密碼子偏好性［4，12］，而對(duì)于基因組密碼子偏好性來說，到目前為止主要集中在單細(xì)胞和模式生物中，包括大腸桿菌（Escherichia coli）［13］、酵母（Yeast）［14］、衣原體（Chlamydiae）［15］、新桿狀線蟲（Caenorhabditis）、果蠅（Drosophila）和擬南芥（Arabidopsis）［16］等。從研究理論來看，密碼子偏好性現(xiàn)象存在2種理論，即中性理論和選擇-突變-漂變學(xué)說［17］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）為芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬植物，是原產(chǎn)中國(guó)的傳統(tǒng)名花，與花中之王牡丹并稱為“花中二絕”，有“花相”之美譽(yù)，目前關(guān)于芍藥基因密碼子偏好性分析的報(bào)道相對(duì)較少［18］。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的不斷成熟，許多物種的基因組信息被揭示，然而芍藥基因組信息目前尚未公布，課題組前期利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）在芍藥花色嵌合體品種‘金輝’中篩選出6 345個(gè)花色調(diào)控相關(guān)的差異基因［19］，作為本次分析密碼子使用模式的研究對(duì)象。芍藥花色的優(yōu)劣不僅影響到觀賞植物的觀賞價(jià)值，而且直接關(guān)系到其商業(yè)開發(fā)價(jià)值，因此，分析芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式對(duì)芍藥花色育種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用多元統(tǒng)計(jì)分析（multivariate statistical analysis）方法探討芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式以及其影響因素，不僅對(duì)提高芍藥花色基因的外源表達(dá)水平具有指導(dǎo)意義，同時(shí)也為今后深入研究芍藥花色調(diào)控的分子機(jī)制和改善芍藥花色育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)來源

芍藥花色嵌合體品種‘金輝’花瓣材料，于2013 年5月采自揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院芍藥種質(zhì)資源圃，課題組前期對(duì)其進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，2014年完成測(cè)序工作和數(shù)據(jù)分析。6 345個(gè)芍藥花色調(diào)控基因序列來自芍藥花色嵌合體品種‘金輝’的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）［19］，為了降低取樣誤差，編寫C程序?qū)π蛄羞M(jìn)行篩選處理，提取滿足下列條件的CDS序列共2 234條：以ATG為起始密碼子；并以TAA、TAG 或TGA為終止密碼子；編碼序列長(zhǎng)度大于300 bp［20］。

1.2 堿基組成分析及中性繪圖

利用 Mobyle軟件［21］（http：//www.molbiol.ox.ac. uk/cu，version 1.4.2）計(jì)算每個(gè)基因序列的堿基組成，并統(tǒng)計(jì)以下指標(biāo)：（1）第3位密碼子各堿基含量（A3s、U3s、C3s、G3s）；（2）第1密碼子GC含量（GC1）與第2位密碼子GC含量（GC2）；（3）密碼子整體GC含量（GC）；第1與2位密碼子的平均GC含量（GC12）；（4）第三位密碼子的GC含量（GC3s）。中性繪圖（neutrality plot）即GC12與GC3s的相關(guān)性分析，是衡量選擇與突變對(duì)密碼子使用模式影響程度的一種分析方法，繪圖以GC12位縱坐標(biāo)，GC3s為橫坐標(biāo)。如果GC12與GC3s之間呈顯著相關(guān)，則說明密碼子3個(gè)位置上堿基組成無(wú)差異，密碼子的使用主要受到突變壓力的影響；如果GC12與GC3s相關(guān)性不顯著，說明密碼子第1、2位和第3位堿基組成不同，基因組GC含量高度保守，密碼子的使用更多地是受選擇作用的影響［22］。

1.3 同義密碼子使用偏好性分析

有效密碼子數(shù)ENC（effective number of codon），是評(píng)估基因整體密碼子偏好性的一個(gè)有效指標(biāo)，其數(shù)值范圍為20（每個(gè)氨基酸只使用一個(gè)同義密碼子的極端偏好情況）到61（每個(gè)同義密碼子被平均使用的無(wú)偏好情況），ENC值越小表明密碼子偏好性越強(qiáng)［23］。目前研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)ENC值小于或者等于35時(shí)，基因密碼子具有顯著的使用偏好性［24］。密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI （codon adaptation index）是評(píng)估密碼子偏好性程度從而揭示基因表達(dá)水平的一個(gè)重要指標(biāo)［25］，CAI數(shù)值范圍在0—1，其數(shù)值越大表明密碼子偏好性越強(qiáng)。相對(duì)同義密碼子使用度RSCU（relative synonymous codon usage）是指某一特定密碼子在使用頻率與其無(wú)偏好性使用時(shí)預(yù)期頻率之間的比值，也是衡量密碼子偏好性程度的有效指標(biāo)［26］，RSCU比值等于1說明該密碼子無(wú)使用偏好性，若RSCU比值大于1說明該密碼子的使用頻率較高。本研究中2 234條基因序列的ENC、CAI以及RSCU值均由Mobyle軟件中CodonW程序進(jìn)行計(jì)算。

1.4 ENC繪圖分析

ENC繪圖（ENC-plot）以ENC值為縱坐標(biāo)，GC3s為橫坐標(biāo)，是分析各基因密碼子使用特征，并探究基因堿基組成和密碼子偏好性之間關(guān)系的一個(gè)有效手段［23］。ENC-plot被廣泛用于分析影響密碼子使用的主要因素：如果密碼子偏好性只受突變壓力的影響，基因沿標(biāo)準(zhǔn)曲線分布或落在標(biāo)準(zhǔn)曲線附近；如果密碼子偏好性只受到選擇作用的影響，基因應(yīng)該落在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方較遠(yuǎn)的位置。

1.5 對(duì)應(yīng)性分析

對(duì)應(yīng)性分析COA（correspondence analysis）是利用多元統(tǒng)計(jì)方法探究樣本各變量之間的關(guān)系，從而揭示影響芍藥花色調(diào)控基因密碼子使用模式的主要因素，COA分析基于RSCU值將樣本中所有基因按密碼子的使用頻率分布在一個(gè)59維（64個(gè)密碼子去除3個(gè)終止密碼子以及甲硫氨酸和色氨酸的密碼子）的向量空間［27］。

1.6 PR2繪圖分析

在計(jì)算第3位密碼子核苷酸含量（A3s、U3s、C3s、G3s）基礎(chǔ)上，分別計(jì)算A3/（A3+U3）與G3/（G3+C3）值，PR2（Parity Rule 2），繪圖是以A3/（A3+U3）為縱坐標(biāo)，G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)［28］。

1.7 最優(yōu)密碼子測(cè)定

本研究中最優(yōu)密碼子的確定參照YANG［29］的分析方法，最優(yōu)密碼子的選擇以CAI值為偏性標(biāo)準(zhǔn)，確定高低表達(dá)樣本。具體方法如下：通過密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）對(duì)所篩選出的所有序列進(jìn)行排序，從排列好樣本總數(shù)的前后端各取5％作為高、低表達(dá)樣本組，計(jì)算這兩個(gè)樣本組的同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU），利用卡方檢驗(yàn)Chi-square test分析兩組之間的顯著性差異，將高表達(dá)組中RSCU值極顯著高于低表達(dá)組（P＜0.01）的密碼子定義為最優(yōu)密碼子。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

利用Mobyle軟件中CodonW程序計(jì)算所有基因序列堿基組成和密碼子偏好性指標(biāo)，利用 SPSS 18.0 （http：//www.spss.com/）軟件基于Spearman方法進(jìn)行相關(guān)性和卡方檢驗(yàn)Chi-square test分析。

2 結(jié)果

2.1 GC含量分布以及中性繪圖

密碼子偏好性 CUB很大程度上受到各基因整體堿基含量的影響，整體GC含量往往反映了方向性突變的強(qiáng)弱，尤其是同義密碼子的主要差別體現(xiàn)在第3位堿基上（GC3s）［30］。在2 234個(gè)芍藥花色調(diào)控基因序列中，GC含量變化范圍為24.6％—73.6％（標(biāo)準(zhǔn)差SD=6.56），其中大部分基因GC含量主要分布在30％—55％（圖1）。整體來看，平均GC和AU含量分別為46.26％和53.74％。GC1為37.05％， GC2為29.90％，GC3s為46.37％，GC3s含量與整體基因編碼區(qū)一致，與GC1和GC2存在一定的差異。中性繪圖分析（Neutrality analysis）以GC3s為橫坐標(biāo)，GC12為縱坐標(biāo)（圖 2），相關(guān)性分析顯示 GC3s與GC12呈極顯著的正相關(guān)（R2=0.202，P＜0.01），表明芍藥花色調(diào)控基因密碼子的使用主要受到突變壓力的影響。

圖1　芍藥花色調(diào)控基因的GC含量分布Fig. 1 Distribution of the GC contents of regulating color genes in P. lactiflora

圖2　中性繪圖（GC12 vs. GC3）Fig. 2 Neutrality plots （GC12 vs. GC3）

2.2 ENC與GC3s的關(guān)聯(lián)分析

ENC-GC3s繪圖以各基因 ENC值為縱坐標(biāo)，以GC3s值為橫坐標(biāo)（圖3），基因ENC值分布在14—61，GC3s值分布在0.085—0.916。由圖3可知，大部分基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線周圍，也有一部分基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方較遠(yuǎn)的位置，由此表明芍藥花色調(diào)控基因的密碼子偏好性不僅受到突變壓力的影響，也一定程度上受到選擇作用的影響。為了準(zhǔn)確評(píng)估ENC觀察值（ENCobs）與預(yù)期值（ENCexp）的差異，本研究計(jì)算了（ENCexp-ENCobs）/ENCexp的比值，結(jié)果見圖4，（ENCexp-ENCobs）/ENCexp比值最高峰分布在 0.1—0.2，大部分基因其比值集中分布在 0.0—0.4，表明大部分基因的ENCexp與ENCobs值相差很小，芍藥花色調(diào)控基因密碼子偏好性差異與GC3s的差異有關(guān)，表明密碼子偏好性主要受突變壓力的影響。

2.3 PR2-plot分析

利用PR2-plot（Parity Rule 2-plot）的方法分析了各基因密碼子中4個(gè)氨基酸家族嘌呤（A和G）與嘧啶（T和C）之間的關(guān)系，由圖5表明，密碼子第3 位T的使用頻率高于A，C使用頻率高于G，4個(gè)堿基的不均衡使用表明芍藥花色調(diào)控基因密碼子偏好性的影響因素除突變壓力外，還受到其他方面的影響（如選擇作用）。

圖3　ENC-GC3s繪圖Fig. 3 ENC-GC3s plot

圖4　ENC比值頻率分布Fig. 4 Frequency distribution of effective number of codons （ENC） ratio

紅色圓圈表示每個(gè)點(diǎn)平均分布位置，值為：x=0.4983072±0.12896476，y=0.4224539±0.1327275Red open circle indicates the average position for each plot， calculated as follows： x=0.4983072±0.12896476， y=0.4224539±0.1327275圖5　PR2繪圖［（A3/（A3+T3） vs. G3/（G3+C3）］Fig. 5 PR2-bias plot ［A3/（A3+T3） against G3/（G3+C3）］

2.4 對(duì)應(yīng)性分析COA

基于RSCU值進(jìn)行了對(duì)應(yīng)性分析COA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第一軸顯示了 38.09％差異，其他 3個(gè)軸分別為18.42％、15.09％、14.59％。芍藥花色調(diào)控基因密碼子使用模式評(píng)價(jià)分析以第一軸（Axis 1）為主，本研究以各基因第一軸（Axis 1）與第二軸（Axis 2）進(jìn)行GC含量分布的對(duì)應(yīng)性分析（圖6），大部分基因集中在Axis 1（-0.5—1.5）和Axis 2（-0.5—1.0）范圍內(nèi)，GC含量小于45％的基因主要分布在軸左下方區(qū)域，GC含量位于 45％—60％的基因主要分布在軸中間區(qū)域。此外，還分析了兩軸中密碼子G/C和A/U結(jié)尾情況（圖 7），結(jié)果發(fā)現(xiàn)第一軸中各基因密碼子偏好性差異可能由于以G/C和A/U結(jié)尾的使用頻率不同導(dǎo)致。

表1　第一主軸與堿基組成的相關(guān)性分析Table 1 Summary of correlation between the first major principle axes and nucleotide composition

以第一軸和第二軸為主的基因分布；紅色、藍(lán)色和綠色圓點(diǎn)分別代表GC≥60％、45％≤GC＜60％、GC＜45％The distribution of genes is shown along the first and second axes. Red， blue and green dots indicate genes with G+C content ≥60％， ≥45％ but ＜60％， and ＜45％， respectively圖6　密碼子使用模式的對(duì)應(yīng)性分析Fig. 6 Correspondence analysis of codon usage patterns

2.5 突變壓力和選擇作用對(duì)芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式的影響

目前突變壓力和選擇作用是影響密碼子使用模式的主要因素［17］。為了評(píng)估突變壓力對(duì)芍藥花色調(diào)控基因密碼子使用模式的影響，本研究根據(jù)密碼子使用模式評(píng)價(jià)主要軸（Axis 1）為對(duì)象，探討堿基組成對(duì)其影響程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），第一軸Axis 1與GC3s呈極顯著的正相關(guān)（R2=0.736，P＜0.01），表明突變壓力中堿基組成（R2=0.736）是影響芍藥花色調(diào)控基因密碼子使用模式的主要因素。此外，為了探討選擇作用中基因表達(dá)水平、蛋白長(zhǎng)度等影響因素，同時(shí)目前CAI值是被用于評(píng)估基因表達(dá)水平的重要指標(biāo)［31-32］。因此，本研究首先分析了CAI值、蛋白長(zhǎng)度（Protein length）對(duì)密碼子偏好性（ENC值）的影響（圖8、圖9），發(fā)現(xiàn)CAI值與ENC值均表現(xiàn)為極顯著的負(fù)相關(guān)（R2=-0.278，P＜0.01），而蛋白長(zhǎng)度與ENC值呈負(fù)相關(guān)，但不顯著（R2=-0.005，P＞0.05），表明基因表達(dá)水平對(duì)密碼子偏好性具有顯著的影響。因此，本研究以基因表達(dá)水平作為選擇作用因素，進(jìn)一步分析CAI值對(duì)主要軸Axis 1的影響程度，發(fā)現(xiàn)Axis 1與CAI值表現(xiàn)為極顯著的正相關(guān)（R2=0.286，P＜0.01），表明選擇作用中基因表達(dá)水平（R2=0.286）對(duì)芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式具有一定的影響。

以第一軸和第二軸為主的密碼子分布；紅色圓點(diǎn)代表以A/U結(jié)尾的密碼子，藍(lán)色圓點(diǎn)代表C/G結(jié)尾的密碼子The distribution of codons is shown along the first and second axes. Note： codons ending with A and U are shown in red dots； codons ending with C and G are shown in green dots圖7　密碼子使用模式的對(duì)應(yīng)性分析Fig. 7 Correspondence analysis of codon usage patterns

圖8　ENC與蛋白長(zhǎng)度的關(guān)系繪圖Fig. 8 Plot of ENC versus encoded protein length

圖9　ENC與基因表達(dá)水平的關(guān)系繪圖Fig. 9 Plot of ENC versus gene expression level

2.6 最優(yōu)密碼子（Optimal codons）分析

本研究依據(jù)CAI值大小對(duì)芍藥花色調(diào)控基因進(jìn)行高、低表達(dá)樣本庫(kù)比較（表 2），結(jié)果表明，共發(fā)現(xiàn)21個(gè)密碼子在高、低表達(dá)樣本庫(kù)中具有極顯著的差異（P＜0.01），這些密碼子為最優(yōu)密碼子，其中19個(gè)最優(yōu)密碼子以G或C結(jié)尾，僅CGU和GGU 2個(gè)密碼子以U結(jié)尾。

表2　芍藥花色調(diào)控基因中高低表達(dá)水平的密碼子使用頻率比較Table 2 Comparison of codon usage frequencies between regulating color gene in P. lactiflora with high and low levels of expression

3 討論

每個(gè)生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中都會(huì)形成一種特定的密碼子使用模式，其中GC含量是生物基因組中堿基組成的一個(gè)重要指標(biāo)，在基因組的演變中具有重要意義。GC含量往往反映了方向性突變的強(qiáng)弱，尤其是同義密碼子的主要差別體現(xiàn)在第3位堿基上（GC3s），由于密碼子第3位上堿基受到的突變壓力較小，因此，GC3s通常被作為分析密碼子使用模式的一個(gè)重要參數(shù)［33］。本研究分析了2 234個(gè)芍藥花色調(diào)控基因的GC含量分布情況，發(fā)現(xiàn)平均GC含量和GC3s比較接近（均略小于 50％），表明所有花色調(diào)控基因中整體AU含量略高于GC，且密碼子稍微偏向以A/U結(jié)尾。目前研究發(fā)現(xiàn)，在小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）等植物基因組中均表現(xiàn)較高的GC含量和偏向以G/C結(jié)尾［34］，然而在真菌、一些單細(xì)胞微生物如鐮狀瘧原蟲（Plasmodium falciparum）和支原體（Mycoplasma capricolum）以及植物線粒體微生物基因組中AU含量明顯高于GC含量［35-37］。此外，密碼子使用模式在形成過程中往往受到很多因素的影響，其中主要包括突變和選擇［17］。在本研究中，中性繪圖顯示GC12與GC3s之間具有極顯著的正相關(guān)；ENC-plot分析發(fā)現(xiàn)大部分基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線周圍，也有一部分基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方較遠(yuǎn)的位置；PR2-plot分析發(fā)現(xiàn)A、C、T 和G 4個(gè)堿基使用不均衡，結(jié)合中性繪圖、ENC-plot 和PR2-plot綜合分析，表明芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式可能受到突變和選擇等多重因素的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)芍藥花色調(diào)控基因序列堿基相關(guān)的因素（A3s、U3s、C3s、G3s、GC、GC3s）與第一主軸（Axis 1）間的相關(guān)系數(shù)均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)（R2=-0.417，P＜0.01；R2=-0.246，P＜0.01；R2=0.549，P＜0.01；R2=-0.054，P＜0.01；R2=0.525，P＜0.01；R2=0.736，P＜0.01），表明密碼子使用特點(diǎn)受堿基組成差異影響較大。此外，在已分化的多細(xì)胞真核生物不同組織以及不同發(fā)育階段中，確定某個(gè)基因的表達(dá)水平是非常困難的。在未知的芍藥基因組中，很難通過EST序列來預(yù)測(cè)單個(gè)基因的表達(dá)水平，密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI一直被廣泛用于評(píng)估基因表達(dá)水平的重要指標(biāo)［31-32］?；虮磉_(dá)水平作為選擇作用的主要因素，本研究分析CAI值與第一向量主軸間的相關(guān)系數(shù)呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)（R2=0.286，P＜0.01），以上兩者分析得到芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式主要受到堿基差異（R2=0.736）和基因表達(dá)水平（R2=0.286）共同作用的影響，其中堿基差異占了主導(dǎo)因素。目前已完成全基因組測(cè)序的植物并不多，續(xù)晨等［38］分析葡萄基因組偏好性主要受到堿基差異（R2=0.925）和選擇作用（R2=0.193）共同作用的影響，突變壓力占了主導(dǎo)因素；劉慶坡等［39］在水稻基因組研究中，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平（R2=-0.608）的影響程度明顯大于堿基組成（R2=0.344）；續(xù)晨等［40］在蝴蝶蘭葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)，其密碼子偏好性受堿基差異（R2=0.614）和選擇作用（R2=0.508）共同影響，兩者影響程度相差不大。分析基因組密碼子使用模式及其影響因素是一個(gè)復(fù)雜的過程，相對(duì)基因組序列來說，由于本研究分析的芍藥花色調(diào)控基因數(shù)量較小，結(jié)果可能與芍藥基因組密碼子使用特點(diǎn)有所區(qū)別，并且目前芍藥基因組序列尚未公布，因此，本研究初步揭示了芍藥花色調(diào)控相關(guān)基因的密碼子使用特點(diǎn)，為今后進(jìn)一步在分子水平上研究毛茛科植物的系統(tǒng)進(jìn)化以及開展芍藥花色相關(guān)基因的功能研究具有指導(dǎo)意義。

關(guān)于最優(yōu)密碼子的確定方法，目前報(bào)道不完全一致，許多學(xué)者比較了高偏性與低偏性基因庫(kù)RSCU值，利用△RSCU大小等級(jí)劃分來確定最優(yōu)密碼子［39-42］。此外，YANG等［29］在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用卡方顯著性檢驗(yàn)來尋找高、低表達(dá)組具有極顯著差異的密碼子作為最優(yōu)密碼子，本研究參考這種方法，最終將CGC、GCC、UGC和GGU等21個(gè)密碼子確定為芍藥花色調(diào)控基因主要偏愛的密碼子。在最終確定的21個(gè)密碼子中除CGU和GGU外，其余密碼子均以G或C結(jié)尾，表明芍藥花色調(diào)控基因密碼子偏好性可能與第 3 位GC含量呈正相關(guān)。在對(duì)水稻［43］、小麥［44］、玉米［20］等高等植物基因組密碼子使用的研究中發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)密碼子較多的是以 C/G結(jié)尾，且通常表現(xiàn)出對(duì)嘧啶堿基C的偏好強(qiáng)于嘌呤堿基G［45］，這與本研究結(jié)果相一致。因此，本研究確定了芍藥花色調(diào)控基因的最優(yōu)密碼子，今后可以通過密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)對(duì)外源基因進(jìn)行密碼子改造，從而提高外源基因在芍藥中的表達(dá)水平，為今后從遺傳本質(zhì)上進(jìn)行芍藥花色育種改良提供理論參考。

4 結(jié)論

利用 Mobyle軟件并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法分析了芍藥花色調(diào)控基因的密碼子使用模式及其主要影響因素，發(fā)現(xiàn)GC3s與GC含量比較接近（約為46.3％）。中性繪圖、ENC-plot以及PR2-plot綜合分析表明芍藥花色相關(guān)基因密碼子使用模式主要受突變壓力和選擇作用的影響，進(jìn)一步通過對(duì)應(yīng)性和主軸相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，第一主軸與堿基突變指標(biāo)（GC3s）、基因表達(dá)水平指標(biāo)（CAI）的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著正相關(guān)（R2=0.736，P＜0.01；R2=0.286，P＜0.01），表明密碼子偏好性主要受到堿基差異（R2=0.736）和基因表達(dá)水平（R2=0.286）共同作用的影響，其中堿基差異占了主導(dǎo)因素。此外，確定了21個(gè)為芍藥花色調(diào)控相關(guān)基因的最優(yōu)密碼子，且大多數(shù)以G/C結(jié)尾，對(duì)基因工程中外源基因的密碼子改良及提高其表達(dá)水平研究提供了參考。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Analysis of Codon Usage Pattern of Paeonia lactiflora Genes Regulating Flower Color and Its Influence Factors

WU Yan-qing， ZHAO Da-qiu， TAO Jun
（Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/College of Horticulture and Plant Protection， Yangzhou University，Yangzhou 225009， Jiangsu）

Abstract：【Objective】 The quality of Paeonia lactiflora flower color affects its ornamental value and the commercial value of ornamental plants. This study aims to understand the codon usage pattern of genes regulating flower color and probe into the mainfactors affecting the formation of codon bias， which has important biological significance for mRNA translation， design of transgenes，the prediction of expression level and functions of new genes， and studies of molecular biology and evolution， etc. 【Method】In a previous study， 6，345 differential genes were screened out by transcriptome sequencing of a flower color chimaera cultivar “Jinhui” with a consistent genetic background red outer-petal and yellow inner-petal， followed by a further filtering analysis according to the principle of CDS sequence characteristics and greater than 300 bp. We finally obtained 2，234 genes as our research object. Mobyle software was used to calculate different parameters for the codon usage， such as GC content， average GC content of the first and second positions （GC12）， GC content of the third position （GC3s）， effective number of codon （ENC）， codon adaptation index （CAI）， and relative synonymous codon usage （RSCU）. Further analysis of a neutrality plot （GC12 vs. GC3）， an ENC-GC3s plot， and a Parity Rule 2 （PR2） plot were performed. Additionally， we probed into the influence of mutational pressure and translational selection by a multivariate statistical analysis. Finally， we took 5％ CAI value as high-expression and low-expression sample groups， then calculated the RSCU value， and analyzed the significant difference to determine the optimal codons by a chi-square test.【Result】The results showed that the GC content at the third position of codons was 46.37％. The GC content of most genes was mainly distributed between 30％ and 55％. Neutrality analysis showed that there was a significant positive correlation （R2=0.202， P＜0.01） between GC3s and GC12 value. The ENC-plot showed most of the genes on or close to the expected curve， but also some points with low-ENC values were below it. The （ENCexp-ENCobs）/ENCexp ratio of most genes ranged from -0.05 to 0.05. The Parity Rule 2-plot showed that the frequency of T nucleotide at the third position was higher than A， and C was higher than G，suggesting that the use frequencies of four nucleotide were not balanced. Correspondence analysis showed that the first axis showed a 38.09％ variation， while the other three axes showed 18.42％， 15.09％， and 14.59％， respectively， suggesting that the first axis was the main index evaluating the codon usage bias of Paeonia lactiflora genes regulating flower color. Mutation pressure and selection analysis showed there were significant negative correlations （R2=0.736， P＜0.01. R2=0.286， P＜0.01） between the first axis and GC3s， CAI value， respectively. Using the delta RSCU and significant chi-square test methods， we defined 21 codons as the major preference codons in the Paeonia lactiflora genes regulating flower color， of 18 codons ending with G or C， only CGU and GGU ending with U.【Conclusion】In conclusion， most of optimal codons ended with G or C. Meanwhile， the codon usage pattern of Paeonia lactiflora genes regulating flower color is formed under the effect of mutational pressure （R2=0.736） and translational selection （R2=0.286）， but a mutational bias was the major influence on codon usage. This study not only preliminarily reveals the codon usage pattern of Paeonia lactiflora genes， but also provides a certain theoretical basis for further carrying out genetic improvement of Paeonia lactiflora flower color by codon reconstruction and analyzing the molecular evolution.

Key words：Paeony； flower color controlling gene； codon usage pattern； influence factor

收稿日期：2015-12-31；接受日期：2016-03-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31372097，31400592）、江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（13KJA210005）