不同品種觀賞貝母花粉活力與萌發(fā)率比較

郝麗紅，陳　燕，楊柳慧，于曉南,3

(1.北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京　100083；2.北京市植物園，北京　100093；3. 城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京　100083)

不同品種觀賞貝母花粉活力與萌發(fā)率比較

郝麗紅1，陳燕2，楊柳慧1，于曉南1,3

(1.北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京100083；2.北京市植物園，北京100093；3. 城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京100083)

貝母是一種極具觀賞價值與發(fā)展?jié)摿Φ那蚋ɑ?。采用氯化三苯基四氮?TTC)、碘-碘化鉀(I2-KI)染色法對10個品種(種)觀賞貝母的新鮮花粉的生活力進行測定，同時采用離體培養(yǎng)法對各品種花粉的萌發(fā)率進行測定。綜合2種測定方法發(fā)現(xiàn)，伊貝母的花粉活力最高，托里貝母、花格貝母和大白花貝母花粉活力相對較高；在離體培養(yǎng)時，培養(yǎng)基為1 g/L硼酸+150 g/L蔗糖時，花粉萌發(fā)率最高；-20 ℃干燥環(huán)境有利于花粉的貯藏。

觀賞貝母；花粉生活力；花粉萌發(fā)率

貝母是百合科貝母屬(FritillariaL.)一類球根花卉，具有較高的觀賞價值和藥用價值[1]。近年來，歐美國家以觀賞為目的，將貝母用于庭院種植、布置環(huán)境，也有的被制作盆景或作切花[2]。貝母屬植物不僅種類繁多、姿態(tài)各異、生活型多樣，而且分布廣泛，是重要的園林花卉應(yīng)用材料[3]。目前，國際上流行的幾個貝母品種不僅花大、色艷，而且球莖較大，莖稈較高、粗壯。而國內(nèi)的貝母種類雖多，但多莖稈較細，種球較小。想要培育出具有以上二者優(yōu)點、性狀良好的貝母品種，可借助雜交手段進行培育。但了解各貝母種的花粉活力與萌發(fā)情況是首先必須解決的問題。

花粉萌發(fā)是植物有性生殖的重要環(huán)節(jié)之一，在雜交育種與多倍體繁育中，花粉的質(zhì)量是親本選擇的重要指標之一，而花粉生活力的測定是保證花粉質(zhì)量最為有效的途徑之一[4]。柱頭萌發(fā)檢測法能夠準確檢測出花粉的活性，但需在品種數(shù)量較多的情況下測定。因此，使用比較多的測定方法主要有花粉離體萌發(fā)測定和染色法。目前對其他植物花粉活力檢測的研究[5-7]較為多見，而關(guān)于貝母花粉活力的測定研究較少。本試驗對北京地區(qū)引種栽培的10個國內(nèi)外貝母品種(種)的花粉活力與萌發(fā)率進行測定，以期篩選出生活力較高的種類，為雜交時的人工授粉、雜交組合方案的制定及種質(zhì)資源的保存提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1花粉采集與處理

試驗所用的10個品種(種)觀賞貝母花粉分別采自北京植物園和小湯山國家花卉工程中心苗圃。于晴天9:00―11:00時用鑷子摘下盛花期微開花朵的花藥，用硫酸紙包好，放入冰盒內(nèi)帶回實驗室，置于室內(nèi)24 h陰干，使其散出花粉，晾干后收集花粉備用。

1.2測定指標與方法

1.2.1花粉生活力測定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法[8]及碘-碘化鉀(I2-KI)染色法[9]測定花粉生活力。分別用膠頭滴管吸取質(zhì)量濃度為5 g/L的TTC和I2-KI溶液，分別將其滴于粘有花粉粒的載玻片上，蓋上蓋玻片，于室溫下(約25 ℃)放置15 min后在顯微鏡下觀察花粉粒的著色情況。當用TTC染色法時，有活力的花粉被染成紅色(活力較強)或淡紅色(活力較弱)，當用I2-KI染色法時，凡被染成藍色的為含有淀粉的活力較強的花粉粒，黃褐色的為發(fā)育不良的花粉。每個處理均設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)取3～5個視野，不少于50個花粉粒，總計觀察花粉數(shù)大于150粒，統(tǒng)計花粉?？倲?shù)和有活力的花粉粒數(shù)。按下列公式計算花粉生活力。

花粉生活力=變紅色(變藍色)的花粉粒數(shù)目/花粉?？倲?shù)×100%

1.2.2花粉萌發(fā)率測定以質(zhì)量濃度為1 g/L的硼酸溶液為基本液體培養(yǎng)基，采用單因素(蔗糖)試驗，蔗糖質(zhì)量濃度梯度分別為50、100、150 g/L。采用分別在4 ℃和-20 ℃下干燥貯藏7 d的花粉進行試驗。

將培養(yǎng)液滴于凹形載玻片內(nèi)，用解剖針蘸取適量花粉均勻散于培養(yǎng)液中，然后將其放于帶有濕濾紙的培養(yǎng)皿中并加蓋，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用顯微鏡觀察花粉的萌發(fā)情況。每個處理均設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)觀察統(tǒng)計3～5個視野，不少于50個花粉粒，總計觀察花粉數(shù)大于150粒，以花粉管長度大于等于花粉粒直徑作為萌發(fā)依據(jù)。

貯藏試驗采用以上試驗篩選出的最優(yōu)培養(yǎng)基進行萌發(fā)試驗。均按下列公式計算花粉萌發(fā)率。

1.3數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2007和SPSS 17.0對各試驗結(jié)果進行處理，并進行相關(guān)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同測定方法對貝母花粉活力的影響

對10個觀賞貝母品種用TTC染色法和I2-KI染色法進行生活力的測定，經(jīng)觀察、統(tǒng)計并計算，得到的結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，不同貝母品種的花粉生活力不同，并且2種方法所得的結(jié)果不同，在某些種類上數(shù)據(jù)相差懸殊。用TTC染色法時各品種的花粉活力為7.04%～71.11%，最低為皇冠貝母‘極點露波拉’，最高為伊貝母。而用I2-KI染色法時，各品種花粉活力為27.03%～81.58%，最低為波斯貝母‘阿德亞曼’，最高為皖貝母。對于單一的貝母品種(種)，2種方法結(jié)果相差較大的是皇冠貝母‘極點魯特’，較為接近的為波斯貝母‘阿德亞曼’和伊貝母。方差分析表明，不同貝母品種(種)之間花粉生活力存在顯著差異，如TTC染色法中，除托里貝母、花格貝母和皖貝母之間無顯著差異外，其他貝母品種(種)間均存在顯著差異。I2-KI 染色法中，不存在顯著差異的貝母品種(種)相對較多，如伊貝母與托里貝母、花格貝母和大白花貝母。綜合2種染色測定方法，認為TTC染色法效果不明顯，著色困難(圖1-A)，而I2-KI染色法結(jié)果較為理想(圖1-B)。

2.2不同質(zhì)量濃度蔗糖對貝母花粉萌發(fā)率的影響

對10個不同觀賞貝母品種(種)的花粉在不同質(zhì)量濃度蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后的萌發(fā)率進行測定，經(jīng)觀察、統(tǒng)計、計算后，進行方差分析，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，在質(zhì)量濃度50 g/L的蔗糖下，花粉活力最高的是伊貝母(60.71%)，最低的是黃花貝母(25.00%)，除波斯貝母‘阿德亞曼’、波斯貝母‘象牙鐘’和托里貝母之間無顯著差異外，其他各品種(種)之間差異顯著。當蔗糖質(zhì)量濃度為100 g/L時，花粉活力最高的是波斯貝母‘象牙鐘’(95.40%)，最低的是波斯貝母‘阿德亞曼’(39.13%)，多數(shù)貝母品種(種)間差異顯著。當蔗糖質(zhì)量濃度為150 g/L時，測得的花粉活力最高的是托里貝母(94.74%)，最低的是皇冠貝母‘極點魯特’。由此可見，不同品種的花粉在同一培養(yǎng)基上的萌發(fā)率也存在一定差異。但當硼酸質(zhì)量濃度不變時，同一品種的花粉在不同質(zhì)量濃度蔗糖的培養(yǎng)基上花粉的萌發(fā)率存在顯著差異，并且多數(shù)品種(種)的萌發(fā)率隨著蔗糖質(zhì)量濃度的升高而升高。當蔗糖質(zhì)量濃度為150 g/L時，除皇冠貝母‘極點魯特’和波斯貝母‘象牙鐘’的萌發(fā)率較低外，其余各品種(種)的萌發(fā)率均達75%以上。因此認為，在1 g/L硼酸溶液的培養(yǎng)基上，比較適合貝母花粉萌發(fā)的蔗糖質(zhì)量濃度為150 g/L，在此條件下多數(shù)貝母花粉的萌發(fā)率均較高(圖1-C)。

A.TTC染色照片　TTC dyeing；B.I2-KI染色照片　I2-KI staining；C.花粉萌發(fā)照片　Pollen germination

表1　不同方法測定的貝母花粉生活力±s)

注：同列中不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。

Note:Different lowercase letters in the same column indicated significant difference at 0.05 level, the same as below.

表2　不同質(zhì)量濃度蔗糖處理下貝母花粉的萌發(fā)率±s)

2.3不同貯藏溫度對貝母花粉萌發(fā)率的影響

由以上試驗結(jié)果可知，較為理想的培養(yǎng)基為1 g/L硼酸+150 g/L蔗糖，因此，進行貯藏試驗時選擇該培養(yǎng)基進行萌發(fā)率的測定試驗，培養(yǎng)時間為12 h，結(jié)果如表3所示。發(fā)現(xiàn)不同貯藏條件下花粉的萌發(fā)率存在顯著差異。在4 ℃條件下貯藏7 d后，花粉的萌發(fā)率最高的是花格貝母，但也只達到17.34%，最低的是波斯貝母‘阿德亞曼’，只有3.24%。而在-20 ℃條件下貯藏7 d后，發(fā)現(xiàn)花粉萌發(fā)率最高的是托里貝母，達到89.76%，最低的是皇冠貝母‘極點露波拉’，為32.93%。可見，在4 ℃下貯藏，各貝母品種(種)的花粉萌發(fā)率有明顯的下降，而在-20 ℃條件下貯藏7 d后，花粉的活力整體雖有所下降，但下降幅度較小，只有皇冠貝母‘極點露波拉’和波斯貝母‘阿德亞曼’2個品種的萌發(fā)率降到55%以下，其余各品種還能保持70%以上的萌發(fā)率，說明在―20 ℃的干燥環(huán)境下貯藏有利于花粉活力的保持。

表3　不同貯藏條件下貝母花粉的萌發(fā)率±s)

3結(jié)論與討論

通過對觀賞貝母的10個品種(種)新鮮花粉的生活力測定和貯藏性初步研究，認為TTC染色法和I2-KI染色法對所測的貝母花粉活力結(jié)果不太準確，若要作粗略測定，建議采用I2-KI染色法，或者篩選較為合適的TTC質(zhì)量濃度，而離體培養(yǎng)法能反映花粉實際的萌發(fā)情況，結(jié)果較為準確。綜合染色法和培養(yǎng)法這2種方法的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)伊貝母的花粉活力最高，其次為托里貝母、花格貝母和大白花貝母；較為有利的培養(yǎng)基為1 g/L硼酸+150 g/L蔗糖；較為有利的貯藏條件為-20 ℃的干燥環(huán)境。

多數(shù)植物正?；ǚ鄢室?guī)則形狀，而發(fā)育不良的花粉常呈畸形。TTC花粉活力檢測法是利用花粉的呼吸作用，因為有活力的花粉在呼吸過程中可以產(chǎn)生二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽(NADPH2)或者二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH2)，將TTC還原為紅色的三苯基甲酯(TTF)從而使花粉粒著色[10]。但在本試驗中，發(fā)現(xiàn)多數(shù)花粉粒用TTC染色時著色量較少，測得的活力值較小，分析原因可能是因為花粉粒的結(jié)構(gòu)較為特殊，使染色液不易浸入，或者因為染色液的質(zhì)量濃度較小，導(dǎo)致結(jié)果偏低，但導(dǎo)致其染色率低的真正原因還需進一步研究。

花粉離體萌發(fā)測定法是在花粉離體條件下創(chuàng)造適宜花粉萌發(fā)的外界環(huán)境條件，促進花粉萌發(fā)及花粉管的伸長。該方法測定的是花粉的真正萌發(fā)情況，能夠較為真實地反映花粉的活力情況。由本試驗可得皇冠貝母‘極點魯特’和波斯貝母‘象牙鐘’這2個品種的萌發(fā)適宜培養(yǎng)基為1 g/L硼酸+100 g/L蔗糖，其余品種(種)適宜的培養(yǎng)基為1 g/L硼酸+150 g/L蔗糖，其萌發(fā)率均在75%以上。因此認為，蔗糖的質(zhì)量濃度對花粉萌發(fā)起促進作用，在做雜交時可考慮在柱頭上涂抹一定質(zhì)量濃度的蔗糖溶液，以提高其萌發(fā)率。由于本試驗未對硼酸的質(zhì)量濃度進行梯度試驗，并且也未考慮其他因素，所以最為合適的硼酸質(zhì)量濃度和最為合適的培養(yǎng)基組合還不甚清楚。

通過貯藏性試驗發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時間的加長，花粉的萌發(fā)率逐漸降低，4 ℃干燥貯藏條件下花粉的萌發(fā)率下降較快，而-20 ℃的干燥條件對花粉活力的保持較為有利，這和婁曉鳴等[2]研究認為較低的溫度對貯藏是有利的結(jié)論一致。以后可以考慮應(yīng)用-20 ℃低溫和超低溫的方法對花粉進行貯藏，并建立花粉庫，以使花粉更好的在實際中應(yīng)用[11]，也可使種質(zhì)資源以花粉的形式長期安全保存。

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Pollen Vitality and Germination Rate of Different Varieties of OrnamentalFritillaries

HAO Lihong1, CHEN Yan2, YANG Liuhui1and YU Xiaonan1,3

(1.College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing100083, China;2.Beijing Botanical Garden, Beijing100093, China; 3.Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment, Beijing100083, China)

The genusFritillariais a kind of bulb flower with high ornamental value and developmental potential. The staining method of TTC and I2-KI were used to test pollen vitality of 10Fritillariaspecies or cultivars in this article, at the same time, the germination of pollen were tested in vitro culture. The result showed that the highest pollen vitality wasF.pallidiflora, followed byF.tortifolia,F.meleagrisandF.verticillatavar.albiflora. Pollen had the highest germination rate in the optimal combination of culture medium, 1 g/L boronic acid+ 150 g/L sucrose.In addition, the vitality of pollen was kept under dry conditions at -20 ℃.

OrnamentalFritillary; Pollen vitality; Germination rate of pollen

2015-06-07

2015-07-09

Co-building Program of Beijing Municipal Commission of Education (No.BLCXY201527).

HAO Lihong, female,master student.Research area:garden flower culture. E-mail: haolihong1986@163.com

YU Xiaonan, female,Ph.D,professor,doctoral supervisor.Research area:garden plant cultivation and breeding. E-mail: yuxiaonan626@126.com

(責任編輯：史亞歌Responsible editor:SHI Yage)

2015-06-07修回日期：2015-07-09

北京市教育委員會科學(xué)研究與研究生培養(yǎng)共建項目(BLCXY201527)。

郝麗紅，女，碩士研究生，研究方向為園林花卉栽培。E-mail:haolihong1986@163.com

于曉南，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為園林植物栽培育種。E-mail:yuxiaonan626@126.com

S682.2

A

1004-1389(2016)07-1062-05

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1634.032.html