金水寶膠囊聯(lián)合西藥對老年COPD穩(wěn)定期患者外周血Treg表達(dá)的影響

黃　芪　黃　鴻　劉先玲

重慶三峽中心醫(yī)院老年科(萬州404000)

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金水寶膠囊聯(lián)合西藥對老年COPD穩(wěn)定期患者外周血Treg表達(dá)的影響

黃芪黃鴻劉先玲

重慶三峽中心醫(yī)院老年科(萬州404000)

摘要目的：探討老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)穩(wěn)定期患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的比例及中成藥金水寶膠囊干預(yù)后的影響。方法：選擇在我院老年科住院部及門診的COPD穩(wěn)定期患者76例，隨機(jī)分為治療組41例和對照組35例，兩組在對癥治療的基礎(chǔ)上，治療組加用金水寶膠囊、鹽酸氨溴索片口服，1個療程為4周，對照組僅加用鹽酸氨溴索片口服，用流式細(xì)胞儀檢測兩組在治療前后外周血中Treg表達(dá)比例的變化，并且選擇同期30例體檢正常的老年人作為健康組。結(jié)果：病例組的外周血Treg比例在治療前均高于健康組(P<0.05)，治療組的外周血Treg比例在治療后低于對照組(P<0.05)。結(jié)論：Treg細(xì)胞在老年COPD發(fā)病過程中有重要作用，中藥干預(yù)能改善穩(wěn)定期COPD老年患者體內(nèi)存在免疫功能紊亂或異常。

主題詞肺疾病，慢性阻塞性/中西醫(yī)結(jié)合療法金水寶膠囊老年人

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的發(fā)病機(jī)制與遺傳易感性、氧化/抗氧化、氣道炎癥等有關(guān)，但至今任未真正闡明。T細(xì)胞中可以抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)的細(xì)胞群包括CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)[1-2]，向下調(diào)節(jié)CD4+、CD25+T細(xì)胞活化與增殖能力，從而免疫負(fù)調(diào)節(jié)功能。在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的作用，維持、過激免疫應(yīng)答及改善自身免疫等。本研究通過檢測中藥治療前后外周血中Treg的水平表達(dá)變化，從而探討中藥改善老年患者體內(nèi)存在免疫功能紊亂或異常狀態(tài)的重要性。

臨床資料選擇2014年3月至2015年8月間在我院老年科收治住院和門診隨訪的老年COPD穩(wěn)定期患者共76例作為病例組，隨機(jī)分為治療組41例，其中男23例，女18例，年齡62～86歲平均70.7±6.8歲；對照組35例，其中男19例，女16例，年齡60～82歲平均68.6±7.1歲。選擇同期在我院體檢中心體檢正常的老年人30例為健康組，其中男17例，女13例，年齡63～80歲，平均66.7±5.7歲。臨床納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2007年修訂版)中關(guān)于穩(wěn)定期的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。中醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南-中醫(yī)病證部分》“肺脹病”進(jìn)行，穩(wěn)定期分為：肺脾氣虛證、肺腎氣虛證、肺腎氣陰兩虛證，穩(wěn)定期以喘息、氣短，乏力或自汗，動則加重為主要表現(xiàn)，臨床辨證大多數(shù)符合肺腎氣虛證的特點[4]。

治療方法兩組在一般的對癥處理、護(hù)理、氧療等方面相同。針對慢性咳嗽咳痰等癥狀祛痰鎮(zhèn)咳等常規(guī)治療；針對氣短呼吸困難等癥狀支氣管擴(kuò)張劑，必要時加用糖皮質(zhì)激素。兩組在院期間均長期低流量吸氧以改善氧飽和度。治療組加用金水寶膠囊(成分：發(fā)酵蟲草菌粉(Cs-4)，國藥準(zhǔn)字：Z108900。0.33g/顆，3顆/次，3次/d)、鹽酸氨溴索片(30mg/次，3次/d)口服，1個療程為4周，對照組僅加用鹽酸氨溴索片口服。

觀察指標(biāo)Treg的測定：Foxp3及淋巴細(xì)胞亞群的測定采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國，BD)進(jìn)行檢測。各組受試者均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下使用抗凝負(fù)壓真空采血管收集外周靜脈血3mL，使用淋巴細(xì)胞分離液分離的靜脈血外周單個核細(xì)胞(PMBC)，且標(biāo)本1h內(nèi)進(jìn)行。所使用之單克隆抗體(抗CD4-PerCP、CD25-FITC和各陰性對照IgG)均使用美國BD公司產(chǎn)品，所使用之Foxp3-PE染色緩沖液均美國eBioscience公司產(chǎn)品。取兩支潔凈試管，加入分離后標(biāo)本液100uL，其次，加入抗人CD4-PerCP/CD25-FITC抗體及各自陰性同型對照IgG各10uL，混勻，避光放置30min(室溫)；加入紅細(xì)胞裂解液，避光孵育，用PBS清洗，離心棄上清；然后加入1mL固定/破膜應(yīng)用液，搖勻避光孵育15min；加入1mL破膜緩沖液，室溫靜置20min，離心棄上清；最后，各試管中均加入5uL的抗Foxp3-PE單抗及各自陰性同型對照IgG，搖勻，4℃避光靜置30min，用2mL破膜緩沖液清洗3遍，分別離心，棄掉上清，加入500uL PBS(4℃預(yù)冷)后搖勻上機(jī)，以FAC Sort流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞、在所得到的FSC-SSC點圖上選擇理想淋巴細(xì)胞群，以Cell Quest軟件分析所得數(shù)據(jù)，記錄熒光抗體染色陽性細(xì)胞的百分比結(jié)果。

治療結(jié)果確定各組的基本資料包括各組的性別、年齡、淋巴細(xì)胞以及CD4+CD25+細(xì)胞的比例間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但病例組在治療前的CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例與健康組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　各組治療前外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例分布

注：與健康組比較，△P<0.05

治療后病例組間調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的比較兩組受檢者外周血中淋巴細(xì)胞、CD4+/CD25+細(xì)胞比例，治療組與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例，治療組與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2　病例組治療后血清中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例分布

注：與對照組比較，△P<0.05

討論中醫(yī)認(rèn)為COPD的發(fā)病機(jī)理以正氣虧虛和呼吸道防御能力下降，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell， Treg)是一類有負(fù)性調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，但目前對其發(fā)生、成長及遷移等機(jī)制尚未真正闡明，其具有免疫功能和免疫抑制的特性。Treg在人和小鼠的外周血及淋巴組織中大約占到CD4+T細(xì)胞的5%～10%左右(胸腺內(nèi)自然發(fā)育成熟的天然Treg(nTreg)和誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞(iTreg))。nTreg大多數(shù)為CD4+/CD25+Treg，主要在預(yù)防病理性自身免疫反應(yīng)方面發(fā)揮功能。除了CD4、CD25之外，CD4+/CD25+Treg表面還表達(dá)有叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)，F(xiàn)oxp3持續(xù)作用于Treg，在效應(yīng)T細(xì)胞上低表達(dá)，作為特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，是CD4+/CD25+Treg生長、活化、發(fā)揮作用的關(guān)鍵，常常作為鑒定或篩選的標(biāo)志[5]。機(jī)體免疫異常則容易受到邪氣侵犯而發(fā)病，出現(xiàn)咳喘，積液成痰，隨著病情的發(fā)展，又常累及其他臟器，如肺病及脾，肺虛及腎，三臟相互虛損，痰濁、水飲、淤血交替為患最終發(fā)展成“肺脹”[6-7]。

本文中老年COPD穩(wěn)定期的患者，與健康組相比，其外周血中CD4+/CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例均明顯升高，這表明Treg參與老年COPD的發(fā)病，另外老年人免疫系統(tǒng)功能異?；蛭蓙y也導(dǎo)致其較普通人易得慢性感染性疾病，細(xì)胞免疫特別是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在COPD的產(chǎn)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[8]。而給予中藥干預(yù)治療后，治療組的外周血Treg比例明顯低于對照組，說明COPD肺腎氣虛證者補(bǔ)腎益肺，納氣定喘冬蟲夏草麥角菌科《本草從新》，具精氣，補(bǔ)虛，實腠理，止咳祛痰，研究表明它含有核苷類、多糖類、氨基酸、微量元素、維生素等活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗菌、抗病毒、保肝護(hù)腎等藥理作用。COPD是可防可控的疾病，只是目前尚無治愈的辦法，積極預(yù)防和提高療效、延緩病情的進(jìn)展成為COPD防治的關(guān)鍵所在，正與中醫(yī)“未病防病、既病防變、瘥后防復(fù)”的理念不謀而合。通過盡早使用中醫(yī)藥進(jìn)行干預(yù)，在COPD穩(wěn)定期調(diào)整體質(zhì)狀態(tài)，做到“正氣存內(nèi)、邪不可干”，利于減少COPD急性發(fā)作。

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(收稿2016-01-23；修回2016-02-21)

【中圖分類號】R563.9

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.036