柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷中PARP-1表達(dá)的影響*

董利平　崔玉環(huán)　趙寶民　連晶晶　魏玉磊　顏　娟　鄭茂東　劉占礦

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院(張家口 075000)

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柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷中PARP-1表達(dá)的影響*

董利平崔玉環(huán)趙寶民連晶晶魏玉磊顏娟鄭茂東劉占礦△

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院(張家口 075000)

摘要目的：探討柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對(duì)二磷酸腺苷核糖多聚酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)表達(dá)的影響。方法：將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、PARP-1抑制劑PJ34組、柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組，按再灌注時(shí)間點(diǎn)不同分為6h、12h、24h、48h、72h五個(gè)亞組；應(yīng)用修飾酶循環(huán)法檢測(cè)NAD+濃度，定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PARP-1 mRNA表達(dá)。結(jié)果：模型組NAD+濃度較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)，PARP mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)，于再灌注24 h達(dá)高峰；藥物干預(yù)組NAD+濃度較模型組顯著增加(P<0.01)，PARP mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，并于24h表達(dá)最低(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最為顯著(P<0.01)。結(jié)論：我們推測(cè)柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷可能是通過(guò)抑制MCAO大鼠PARP-1表達(dá)，降低NAD+消耗，實(shí)現(xiàn)其對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

主題詞腦缺血/中醫(yī)藥療法動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)大鼠

腦缺血/再灌注損傷中PARP-1過(guò)度激活可導(dǎo)致NAD+大量耗竭、ATP減少，最終細(xì)胞能量耗竭，細(xì)胞死亡[1]。文獻(xiàn)報(bào)道早期給予PARP-1抑制劑可阻斷PARP-1酶活性，減輕缺血/再灌注中神經(jīng)元的損傷[2]。因此本研究選取柴胡皂苷d和黃芩苷，通過(guò)建立大鼠腦缺血/再灌注損傷模型，檢測(cè)藥物對(duì)腦缺血/再灌注病灶中PARP-1及NAD+的表達(dá)情況，探討其在腦缺血/再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SD(Sprague-Dawley)大鼠420只，健康雄性，體質(zhì)量(240±5)g，購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，隨機(jī)將大鼠分成正常組、假手術(shù)組、模型組、PARP-1抑制劑PJ34組、柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組7組，每組60只，按再灌注時(shí)間點(diǎn)不同分為6h、12h、24h、48h、72h五個(gè)亞組。

1.2藥物與試劑PARP-1抑制劑PJ34(美國(guó)Santa Cruz公司)；柴胡皂苷d(Sigma-Aldrich公司)；黃芩苷(Sigma-Aldrich公司)；栓線(北京沙東生物技術(shù)有限公司)，試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；NAD+濃度檢測(cè)酶循環(huán)法檢測(cè)試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；Trizol裂解液(Invitrogen 公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試(Fermentas公司)；PARP-1聚合體蛋白一抗(北京博奧森公司)。

1.3制備腦缺血/再灌注損傷大鼠模型大鼠稱重，腹腔注射麻醉7%水合氯醛(5mL·kg-1)，采用改進(jìn)Longa線栓法，右側(cè)頸外動(dòng)脈暴露并剪開，推栓線至大腦中動(dòng)脈開口處，阻斷其血流，導(dǎo)致腦缺血，固定栓線，2h后拉出栓線，恢復(fù)血液供應(yīng)，完成腦缺血再灌注損傷模型；假手術(shù)組不實(shí)施缺血再灌注只進(jìn)行手術(shù)。

1.4用藥方法腦缺血/再灌注手術(shù)后2h 腹腔注射藥物：PJ34組(25mg·kg-1)、柴胡皂苷d組(70mg·kg-1)、黃芩苷組(30mg·kg-1)、柴胡皂苷d(70mg·kg-1)+黃芩苷(30mg·kg-1)組；正常對(duì)照組、假手術(shù)組及模型組腹腔注射等量生理鹽水；各組均每天早晨給藥1次。

1.5神經(jīng)功能損傷評(píng)分Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)于動(dòng)物清醒后進(jìn)行評(píng)分：0分：行為正常；1分：對(duì)側(cè)前爪伸展不充分，輕微不對(duì)稱；2分：行走時(shí)向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向?qū)?cè)傾斜，顫抖不穩(wěn)、跌倒；4分：不能行走，意識(shí)喪失；符合1-3分者大鼠納入實(shí)驗(yàn)，其余剔除。

1.6修飾酶循環(huán)法檢測(cè)病灶中NAD+濃度將腦缺血/再灌注病灶組織分別置HEPES-NaOH液中研磨，將勻漿4℃15000r·rain-1離心20min，上清液即為組織總蛋白溶解液。組織總蛋白溶解液中NAD+濃度檢測(cè)按酶循環(huán)法檢測(cè)試劑盒內(nèi)附說(shuō)明書操作。

1.7定量RT-PCR方法檢測(cè)病灶中PARP-1 mRNA表達(dá)嚴(yán)格按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取各組腦組織總RNA，測(cè)定總RNA量以及其純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，放置于-20℃?zhèn)錅y(cè)。PARP-1的上游引物5′-CCCAGGGTCTTCGGATAG-3′，下游引物5′-AGCGTGCTTCAGTTCATACA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為185bp；β-actin的上游引物5′-TCCGTGGAGAAGAGCTACGA-3′，下游引物5′-GTACTTGCGCTCAGAAGGAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為309bp，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。25μL反應(yīng)體系為：SYBR Green Mix 12.5μL，上下游引物各1.0μL(5μmol/L)，ROX 0.5 μL，cDNA 1.0μL及9.0μL ddH2O；反應(yīng)條件：95℃變性10min，然后按95℃×30s，55℃×1min，72℃×42s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析釆用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分與模型組相比，藥物干預(yù)組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最為顯著(P<0.01)。見表1。

2.2腦組織NAD+濃度水平與正常組及假手術(shù)組相比，模型組NAD+濃度下降(P<0.01)；與模型組相比，藥物干預(yù)組則濃度增加(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最為顯著(P<0.01)。見表2。

表1　腦缺血/再灌注后不同時(shí)間神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分(n=6)

注：▲P< 0. 01，與假手術(shù)組和正常對(duì)照組比較；△P< 0. 01，◇P< 0. 05，與模型組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較；◆P<0. 01，與PJ34組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較

表2　腦缺血/再灌注后不同時(shí)間腦組織的NAD+濃度(mg·g-1wet tissue，n=6)

注：▲P< 0. 01，與假手術(shù)組和正常對(duì)照組比較；△P< 0. 01，◇P< 0. 05，與模型組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較；◆P<0. 01，與PJ34組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較

2.3PARP-1 mRNA的表達(dá)情況與正常組及假手術(shù)組相比，模型組PARP mRNA表達(dá)增加(P<0.01)；并隨缺血/再灌注時(shí)間延長(zhǎng)呈動(dòng)態(tài)變化，于24h時(shí)達(dá)最高峰，給予藥物干預(yù)后PARP mRNA表達(dá)降低，并于24h表達(dá)最低(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最為顯著(P<0.01)；而正常對(duì)照組和假手術(shù)組均無(wú)明顯變化。見表3。

表3　腦缺血/再灌注后不同時(shí)間腦組織的PARP-1 mRNA表達(dá)(%，n=6)

注：▲P< 0. 01，與假手術(shù)組和正常對(duì)照組比較；△P< 0. 01，◇P< 0. 05，與模型組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較；◆P<0. 01，□P<0. 05，與PJ34組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較

3討論

PARP-1作為結(jié)合蛋白酶，其生物學(xué)效應(yīng)包括識(shí)別及結(jié)合DNA缺口，修復(fù)損傷DNA，保證基因組完整性，進(jìn)而催化多聚ADP核糖化，轉(zhuǎn)送NAD+核糖至受體蛋白，形成核糖鏈，通過(guò)改變受體蛋白結(jié)構(gòu)，而影響受體蛋白生物學(xué)活性。目前有大量證據(jù)表明 PARP-1在腦缺血/再灌注損傷發(fā)展過(guò)程中起重要作用。Kauppinen等人[3]在大鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎再灌注治療中發(fā)現(xiàn)，PARP-1抑制劑PJ34可抑制腫瘤壞死因子表達(dá)及小膠質(zhì)細(xì)胞激活和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，證實(shí)其可通過(guò)減少炎癥，增強(qiáng)缺血后神經(jīng)元的存活和再生長(zhǎng)期；短暫性大腦中動(dòng)脈梗塞的動(dòng)物模型(MCAO)中，PARP-1小鼠較野生型基因小鼠的梗塞面積明顯減小，將野生型PARP-1小鼠基因再轉(zhuǎn)移至PARP-1小鼠后其保護(hù)缺血/再灌注的作用消失[4]，證實(shí)梗塞面積的減小是因PARP-1基因缺陷所致，給予PARP-1抑制劑后梗塞面積亦減小，PARP-1缺陷在腦缺血/再灌注中的保護(hù)作用被多種酶抑制劑所重復(fù)，包括苯酰胺類、異喹啉酮化合物、phenanthridinones及多種經(jīng)典PARP-1抑制劑[5]，充分證實(shí)PARP途徑在腦梗塞損傷中的病生理過(guò)程中的重要性，及PARP-1抑制劑的神經(jīng)保護(hù)作用。

柴胡皂苷d是柴胡主要有效成分，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤，調(diào)解免疫及內(nèi)分泌系統(tǒng)，抑制NF-κB、NF-AT激活的T淋巴細(xì)胞和AP-1信號(hào)對(duì)抗增殖作用[6]。黃芩的主要活性成分黃芩苷，具有抗凋亡、抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用[7]。

本研究結(jié)果表明大鼠短暫局灶性腦缺血/再灌注后缺血腦組織中PARP-1 mRNA表達(dá)明顯增加，NAD+過(guò)度消耗，而給予PARP-1抑制劑PJ34及柴胡皂苷d+黃芩苷干預(yù)后，PARP-1 mRNA表達(dá)明顯減少，二者統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異，證實(shí)柴胡皂苷d及黃芩苷同時(shí)給藥可減輕腦梗塞的缺血/再灌注損傷，其機(jī)制可能與其抑制PARP-1表達(dá)、NAD+消耗減少有關(guān)。為拓寬柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷在腦缺血/再灌注中的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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(收稿2016-01-08；修回2016-02-21)

通訊作者△

【中圖分類號(hào)】R743.31

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.082

*河北省衛(wèi)計(jì)委科研基金項(xiàng)目(ZL20140035)