南京地區(qū)1株豬偽狂犬病毒的分離與鑒定

常 晨,張道華,唐 波,劉國(guó)陽(yáng),華 濤,侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國(guó)家獸醫(yī)生物制品工程技術(shù)中心,江蘇 南京 210000)

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南京地區(qū)1株豬偽狂犬病毒的分離與鑒定

常 晨,張道華*,唐 波,劉國(guó)陽(yáng),華 濤,侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國(guó)家獸醫(yī)生物制品工程技術(shù)中心,江蘇 南京 210000)

摘要：于2013年從南京某豬場(chǎng)送檢發(fā)病仔豬臟器中分離獲得1株病毒。病樣組織液上清經(jīng)BHK細(xì)胞分離培養(yǎng)后,利用PCR和間接免疫熒光反應(yīng)進(jìn)行鑒定,PCR可以擴(kuò)增出PRVgE基因的全長(zhǎng)片段,且在間接免疫熒光檢測(cè)中呈現(xiàn)陽(yáng)性熒光反應(yīng)。將命名為NJ株的分離病毒接種家兔，被接種的家兔很快出現(xiàn)瘙癢、死亡等偽狂犬病癥狀。與以往發(fā)表的偽狂犬病毒gE基因序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示,分離株屬于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支。由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供的偽狂犬病陽(yáng)性血清對(duì)分離株有一定的中和能力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè),南京某豬場(chǎng)流行的偽狂犬病毒存在一定的抗原變異。

關(guān)鍵詞：豬；偽狂犬病病毒;分離;鑒定;gE基因

偽狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)屬于皰疹病毒科、甲型皰疹病毒亞科。由偽狂犬病毒引起的以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的疾病稱為偽狂犬病(Pseudorabies, PR)[1]。豬是PRV的主要貯存宿主及疫源動(dòng)物[1-2]。豬偽狂犬病常引起妊娠母豬繁殖功能障礙和初生仔豬的神經(jīng)癥狀,仔豬感染率和死亡率極高[3]。早年歐洲一些國(guó)家采用大規(guī)模接種gE缺失疫苗的DIVA國(guó)家根除計(jì)劃戰(zhàn)略,使PRV在一些地區(qū)的豬場(chǎng)消失[4]。在這些缺失疫苗株中應(yīng)用最廣泛的是匈牙利的Bartha株,我國(guó)大多規(guī)模化豬場(chǎng)也采用該弱毒疫苗株。但近年來(lái),許多使用弱毒疫苗免疫的規(guī)模化豬場(chǎng)出現(xiàn)了疑似偽狂犬病毒感染的癥狀,主要表現(xiàn)為豬群gE抗體陽(yáng)性率顯著升高,母豬產(chǎn)死胎[5]。尤其是2011年底,大規(guī)模的偽狂犬疫情在許多使用弱毒疫苗免疫的豬場(chǎng)暴發(fā)[6-9],現(xiàn)有疫苗不能完全防控偽狂犬病的流行,偽狂犬病防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。目前,已有科研人員從發(fā)病豬體內(nèi)分離出抗原變異的偽狂犬毒株[6,9]。本研究對(duì)南京地區(qū)1個(gè)疑似發(fā)生豬偽狂犬病的豬場(chǎng)病料進(jìn)行了偽狂犬病毒的分離、鑒定,旨在為該病毒的進(jìn)一步研究提供材料,也為我國(guó)豬偽狂犬病的診斷和防治提供參考。

1材料與方法

1.1病料與病毒株

病料來(lái)源于南京某發(fā)病豬場(chǎng),該豬場(chǎng)接種PRV基因缺失弱毒疫苗,出現(xiàn)疑似偽狂犬病癥狀。對(duì)送檢的病死新生仔豬,取其脾、腎、腦等組織進(jìn)行研磨及凍融,離心后將上清液分裝，于-20 ℃下保存。PRV毒株ZC株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

LA TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、2×GC Buffer I、pMD18-T Vector、DL 2000 DNA Marker購(gòu)于TAKARA寶生物工程(大連)有限公司。FITC標(biāo)記的羊抗豚鼠抗體、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和DMEM培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品。用于病毒分離的BHK 21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存,以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)。偽狂犬病陽(yáng)性血清參考品由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。偽狂犬豚鼠陽(yáng)性血清為本實(shí)驗(yàn)室保存。其他各種試劑均為分析純?cè)噭?只健康家兔購(gòu)自南京江寧青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)。

1.3引物

參照GenBank中PRV Becker株的全基因組序列(GenBank: JF797219),設(shè)計(jì)了針對(duì)gE基因的1對(duì)引物: gE-F/gE-R,用于擴(kuò)增gE全長(zhǎng)基因序列。引物均由上海英駿生物工程有限公司合成,引物序列如表1。

表1　用于PRV病毒鑒定和gE基因擴(kuò)增的引物

1.4病毒核酸的提取及PCR

分別取研磨后的病料和反復(fù)凍融的實(shí)驗(yàn)室對(duì)照毒株P(guān)RV ZC株，按常規(guī)方法提取DNA。PCR反應(yīng)體系: DNA模板5 μL、dNTP(各2.5 mmol/L)8 μL、上下游引物各1 μL、2×GC Buffer I 25 μL、LA Taq酶0.5 U,加去離子水補(bǔ)充至總體積50 μL。PCR程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,63 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈光下觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.5PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后,克隆至pMD18-T載體上,將經(jīng)過(guò)鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海英駿生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用NCBI BLAST對(duì)PRVgE核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。從GenBank中提取所提交的大部分gE基因全序列作為參考序列,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6病毒分離與增殖

將PCR鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的病料組織研磨液以12000 r/min離心15 min,上清經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾后,取500 μL接種至長(zhǎng)勢(shì)良好的單層BHK 21細(xì)胞,在37 ℃孵育1 h后換成含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔12 h觀察1次細(xì)胞病變情況。

1.7提取DNA與PCR鑒定

待70%左右的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)收獲病毒液,取上清,繼續(xù)接種單層BHK 21細(xì)胞。傳代2次之后,取細(xì)胞上清液提取DNA,用PCR方法再次鑒定。

1.8病毒含量測(cè)定

待96孔細(xì)胞板上的BHK 21細(xì)胞長(zhǎng)成單層,取病毒液進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為10～108倍,每個(gè)稀釋度接種6孔,每孔0.1 mL,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變情況,共觀察3～5 d,計(jì)算TCID50,參照Reed-Muench法計(jì)算分離毒的TCID50。

1.9間接免疫熒光檢測(cè)(Indirect fluorescence assay, IFA)

用分離的病毒接種96孔板中的BHK 21細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照及接種PRV ZC株的陽(yáng)性對(duì)照。在接種約24 h后棄培養(yǎng)液,用PBS洗滌2遍后待其干燥,用預(yù)冷的無(wú)水乙醇在4 ℃下固定1 h,棄乙醇,用PBS洗滌。將實(shí)驗(yàn)室保存的偽狂犬豚鼠陽(yáng)性血清100倍稀釋液加入96孔板中,每孔加入50 μL,在37 ℃下孵育1 h,棄血清,用PBS洗滌;每孔加入50 μL經(jīng)2000倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗豚鼠抗體,在37 ℃下孵育1 h,棄二抗,用PBS洗滌；最后置熒光顯微鏡下觀察。

1.10易感動(dòng)物接種試驗(yàn)

取2只健康成年家兔,在頸背部肌肉處注射病毒細(xì)胞培養(yǎng)液(107.5TCID50/mL)2 mL/只；同時(shí)取1只健康成年家兔，注射正常細(xì)胞培養(yǎng)物，作為對(duì)照。觀察、記錄家兔的發(fā)病情況；在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖試驗(yàn)組的家兔,采集臟器并分離病毒,提取核酸并進(jìn)行PCR。對(duì)所有接觸物品及動(dòng)物尸體進(jìn)行無(wú)害化處理。

1.11血清中和指數(shù)的測(cè)定

采用固定血清稀釋病毒法測(cè)定正常豚鼠血清和偽狂犬病陽(yáng)性血清參考品對(duì)病毒Bathar k61、ZC株和NJ株的中和抗體效價(jià),操作參照陽(yáng)性血清參考品使用說(shuō)明書。將抗血清在56 ℃下滅活30 min后進(jìn)行30倍稀釋。對(duì)病毒按10倍進(jìn)行系列稀釋,取10～106倍共6種稀釋液,分別與事先滅活并作30倍稀釋的血清等體積混合，再置于37 ℃下作用1 h；然后每個(gè)稀釋度分別接種已長(zhǎng)滿單層BHK 21的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4孔,每孔200 μL，在37 ℃下培養(yǎng)3～6 d,每日觀察細(xì)胞病變情況,計(jì)算毒株的中和指數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1PCR鑒定與序列分析結(jié)果

對(duì)研磨后的病料和病毒對(duì)照PRV ZC株分別提取總DNA,用gE的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果如圖1所示。病料與PRV ZC株都擴(kuò)增出gE的特異性片段,長(zhǎng)度為1731 bp,與預(yù)期的目的片段相同。這表明仔豬存在PRV感染,由于該豬場(chǎng)使用的疫苗株缺失gE基因,gE基因陽(yáng)性表明感染的PRV為野毒株。分離株與ZC株的gE全長(zhǎng)基因重組質(zhì)粒經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切后均釋放出大小約為1700 bp的片段，證明目的片段與pMD18-T Vector正確重組,結(jié)果如圖2所示。利用NCBI BLAST對(duì)PRVgE核苷酸序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示分離的病毒株與PRV經(jīng)典株Becker株的相似性為94%。為了分析PRV-NJ株gE基因的遺傳演化,將其與GenBank中的參考毒株HB-HS(KC415028.1)、HB-BD(KC415026.1)、HB-LF(KC415029.1)、HB-HD(KC415027.1)、LXB88(GQ926933.1)、LXB6(GQ926932.1)、GDSH(EF552427.1)、Ea(AF171937.1)、Min-A(AY170318.1)、HNJZ(EU561349.1)、LA(AY173124.1)、Guizhou-DY(JX417716.1)、P-PrV(FJ176390.1)、gp63(M14336.1)、Becker(JF797219.1)、NiA3(EU502923.1)、Nia-1(FJ605136.1)、CL-15(JF460026.1)、Kaplan(JF797218.1)、75V19(FJ605133.1)、NS374(FJ605135.1)、00V72(FJ605132.1)、89V87(FJ605134.1)及GZ-Z1(HQ832846.1)的gE基因的部分核苷酸序列進(jìn)行同源性比較,并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),這包括中國(guó)分離株和國(guó)外分離株。利用ClustalW方法對(duì)PRVgE核苷酸序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以發(fā)現(xiàn)：NJ株位于gE基因的進(jìn)化樹(shù)上一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支中,而與以前的分離株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

1: PRV ZC株;2:陽(yáng)性病料; M: DL 5000。

1:陽(yáng)性病料重組質(zhì)粒酶切鑒定;

圖3　PRV-NJ株gE基因的進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

2.2病毒分離與細(xì)胞病變的觀察結(jié)果

將研磨后的病料上清過(guò)濾除菌后接種BHK 21細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)聚集、變圓、脫落,有的形成合胞體；而正常的對(duì)照細(xì)胞無(wú)病變(圖4)。

A:對(duì)照BHK 21細(xì)胞; B:病料上清感染的BHK 21細(xì)胞。

2.3病毒含量的測(cè)定結(jié)果

分別取10～108倍的病毒稀釋液接種96孔板中的BHK 21細(xì)胞,觀察每日細(xì)胞病變情況,計(jì)算出分離株在BHK 21細(xì)胞上的TCID50值為107.5/mL。

2.4間接免疫熒光檢測(cè)鑒定結(jié)果

分離病毒株與PRV ZC株(陽(yáng)性對(duì)照)感染BHK 21細(xì)胞后,用偽狂犬豚鼠陽(yáng)性血清的100倍稀釋液作IFA檢測(cè),結(jié)果如圖5。由圖5可見(jiàn),病毒感染細(xì)胞能與PRV陽(yáng)性血清作用,產(chǎn)生熒光,同時(shí)病毒陽(yáng)性對(duì)照成立,正常細(xì)胞對(duì)照無(wú)熒光。這證實(shí)分離的病毒確為PRV。

A:偽狂犬分離株; B: PRV ZC株; C:細(xì)胞對(duì)照。

2.5兔體接種試驗(yàn)結(jié)果

注射病毒細(xì)胞培養(yǎng)物后24 h,試驗(yàn)組家兔開(kāi)始興奮不安,食欲下降；40 h左右出現(xiàn)呼吸急促、不斷用嘴啃或用爪抓接種部位的現(xiàn)象,接種部位被毛脫落、皮膚潮紅、出血,暴露出紅色肌肉;至48 h試驗(yàn)組家兔四肢麻痹倒地,角弓反張,抽搐而死,而對(duì)照組家兔表現(xiàn)正常(見(jiàn)圖6)。解剖試驗(yàn)組的家兔,采集臟器并分離病毒,提取核酸并進(jìn)行PCR，結(jié)果證實(shí)分離的病毒為偽狂犬病毒。

圖6　試驗(yàn)組的家兔

2.6血清中和指數(shù)測(cè)定結(jié)果

將Bathar k61、NJ株及ZC株做10～106倍梯度稀釋,分別與等量正常豚鼠血清(30倍稀釋)及偽狂犬病陽(yáng)性血清參考品(30倍稀釋)混合作用,接種BHK 21細(xì)胞。中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)表明， PRV陽(yáng)性血清對(duì)分離株病毒有一定的中和能力。

表2　偽狂犬陽(yáng)性血清參考品中和

3討論

我國(guó)目前對(duì)偽狂犬病的防治主要依靠接種基因缺失疫苗。PRV Bartha-k61株疫苗是常用的基因缺失疫苗,應(yīng)用該疫苗很好地控制了PR[10-11]。但近年來(lái)不斷有規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)生偽狂犬病流行,浙江地區(qū)6個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)査結(jié)果顯示:豬群gE抗體陽(yáng)性率偏高,豬場(chǎng)存在因PRV野毒感染所致的仔豬發(fā)病,而使用的疫苗不能提供完全的保護(hù)[12]?；蚪M分析結(jié)果顯示,偽狂犬新分離野毒株的一些病毒蛋白與經(jīng)典毒株有所不同。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明, Bartha-k61不能提供對(duì)新分離野毒株的完全保護(hù)[6]。

本實(shí)驗(yàn)室從南京某豬場(chǎng)送檢的仔豬組織中檢測(cè)出PRV野毒,該豬場(chǎng)接種PRV Bartha k61疫苗。通過(guò)對(duì)分離株gE基因進(jìn)行測(cè)序并與GenBank中登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)分離的PRV-NJ株在一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支中。與以前的分離株相比,當(dāng)前的流行株有一定程度的變異,這些變異株可能是導(dǎo)致疫苗免疫失敗的原因。但新分離的毒株是否形成一個(gè)新的流行毒株還有待更多的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證。本文血清中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,偽狂犬陽(yáng)性血清對(duì)NJ分離株有一定的中和能力,但不及其對(duì)Bartha-k61的中和能力。新分離的病毒株與之前的毒株之間在抗原性方面存在一定的差異,現(xiàn)有疫苗株對(duì)NJ分離株的免疫保護(hù)效果還有待通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Separation and Identification of A Strain of Porcine Pseudorabies Virus in Nanjing Area

CHANG Chen, ZHANG Dao-hua*, TANG Bo, LIU Guo-yang, HUA Tao, HOU Ji-bo

(National Veterinary Biological Product Engineering and Technology Research Center,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210000, China)

Abstract：A virus was isolated from affected piglet of Nanjing city in 2013. The tissue supernatant was inoculated to BHK 21 cells, a pair of primers specific for PRVgEwas designed and used to amplify the corresponding DNA segments by PCR, the infected cells showed positive reaction with PRV antibodies in IFA. The rabbit infected with this isolate appeared the symptoms of pseudorabies. Sequence alignments ofgEindicated thatgEgene belonged to a relatively independent sub-branch in phylogenetic analysis. The positive serum of pseudorabies provided by Chinese Veterinary Drug Supervisory Institute had a certain ability to neutralize the separated strain. In conclusion, the prevalence of PRV might has antigenic variation.

Key words：Pig; Porcine pseudorabies virus; Separation; Identification;gEgene

收稿日期：2015-11-19

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX(11)2047]；江蘇省農(nóng)業(yè)支撐計(jì)劃(BE2012370)。

作者簡(jiǎn)介：常晨(1987─)，女，江蘇南京人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事動(dòng)物疫苗產(chǎn)品研究工作。*通訊作者：張道華。

中圖分類號(hào)：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-8581(2016)06-0082-05