橡膠樹肌動(dòng)蛋白解聚因子的表達(dá)和功能鑒定

鄧治，劉向紅,2，李德軍*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737；2.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228)

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橡膠樹肌動(dòng)蛋白解聚因子的表達(dá)和功能鑒定

鄧治1，劉向紅1,2，李德軍1*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737；2.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 海口 570228)

摘 要：為探尋肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor, ADF)在調(diào)控肌動(dòng)蛋白解聚和聚合平衡過程中發(fā)揮的作用，從橡膠樹中獲得了HbADF基因組序列，經(jīng)測(cè)定，該序列長(zhǎng)2 258 bp，含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，在裂殖酵母中過表達(dá)HbADF，獲得相對(duì)分子質(zhì)量約38 000的融合蛋白。對(duì)裂殖酵母細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)HbADF的酵母細(xì)胞長(zhǎng)度顯著增加，雙核和多核比例達(dá)67%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，HbADF的表達(dá)受3% KI處理調(diào)控，在橡膠樹不同死皮階段和不同排膠時(shí)間段的表達(dá)存在變化，說明HbADF可能參與了橡膠樹排膠和死皮的過程。

關(guān) 鍵 詞：橡膠樹；肌動(dòng)蛋白解聚因子；表達(dá)分析；功能鑒定；排膠；細(xì)胞形態(tài)

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肌動(dòng)蛋白(actin)是真核生物細(xì)胞中普遍存在的一種高度保守的重要蛋白質(zhì)，它是細(xì)胞微絲骨架的主要組分。微絲骨架在真核生物中參與許多重要的生理活動(dòng)，如細(xì)胞形態(tài)控制、胞質(zhì)運(yùn)動(dòng)、防御反應(yīng)、胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和重力感應(yīng)等[1–7]。肌動(dòng)蛋白聚合與解聚的動(dòng)態(tài)變化是微絲骨架實(shí)現(xiàn)其功能的關(guān)鍵。該過程由大量的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白通過精密的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)。廣泛存在于真核生物中的肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor, ADF)作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的重要成員，在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合與解聚平衡過程中發(fā)揮重要作用。ADF基因在植物中參與多種生理過程，如細(xì)胞生長(zhǎng)和分化調(diào)控過程[8–9]、頂端生長(zhǎng)過程[10–12]、生根過程[13]、冷馴化過程[14]、植物抗病過程[15–18]等。

巴西橡膠樹 (Hevea brasiliensis)原產(chǎn)于亞馬遜河流域，是天然橡膠的唯一商業(yè)來源。排膠時(shí)間是限制天然橡膠產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。乳管傷口堵塞是決定排膠時(shí)間的主要因子[19]。割膠后，乳管傷口末端形成一個(gè)蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它在乳管堵塞過程中起重要作用[19–20]。高正權(quán)等[21]采用TRITC–Phalloidin對(duì)樹皮樣品的石蠟切片進(jìn)行染色，觀察到排膠過程中F–actin在乳管傷口末端逐漸聚集。采用免疫印跡法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)割膠后采集的膠乳中肌動(dòng)蛋白含量存在著規(guī)律性變化，最先收集的膠乳中肌動(dòng)蛋白含量高，隨后逐漸降低，停排前含量最低，復(fù)割時(shí)肌動(dòng)蛋白含量又恢復(fù)到較高水平。乳管傷口蛋白質(zhì)網(wǎng)的形成與肌動(dòng)蛋白絲的聚集同時(shí)發(fā)生。Hao等[20]在割膠后立即采集的樹皮樣品中未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)網(wǎng)，割膠后5 min在樹皮樣品中可觀察到稀疏的蛋白質(zhì)纖維，隨著排膠時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)網(wǎng)越來越明顯。以上研究結(jié)果表明，肌動(dòng)蛋白在橡膠樹排膠過程中逐漸被截留在乳管傷口末端，參與形成以微絲為骨架的蛋白質(zhì)網(wǎng)，使乳管傷口盡快堵塞和愈合，最后使橡膠樹停止排膠。橡膠樹ADF作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的重要成員，可能通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白解聚和聚合來控制肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)裝配過程，藉此在乳管的堵塞過程中發(fā)揮作用。本研究中克隆了HbADF基因組序列，對(duì)各處理?xiàng)l件下HbADF的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，觀察了過表達(dá)HbADF的裂殖酵母細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核，旨在為進(jìn)一步分析HbADF的調(diào)控機(jī)制和功能提供參考依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

橡膠樹樣品均采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。以1997年定植的橡膠樹品系PR107為試驗(yàn)樹，采集不同死皮等級(jí)橡膠樹膠乳樣品。選用2007年定植的未開割熱研7–33–97幼樹，用3% KI對(duì)割面上下2 cm進(jìn)行處理，處理0、6、24、48 h后采集膠乳，以不作任何處理的未開割幼樹為對(duì)照。以3年割齡的熱研7–33–97為材料，割膠后分3次采集膠乳 (于割膠后0～5、>5～35、>35 min采集，分別記為T1、T2、T3)，2 d后復(fù)割，復(fù)割后0～5 min 再次采集膠乳(記為T4)。

2×Taq PCR Master Mix聚合酶購(gòu)自北京天根公司，PyrobestTMDNA聚合酶、DNase I、克隆載體pMD18–T和DNA Markers等購(gòu)自大連寶生物公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司。小量酵母細(xì)胞完全轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。質(zhì)粒pESP–2、大腸桿菌DH5α和裂殖酵母SPQ–01為農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1橡膠樹DNA和RNA的提取

橡膠樹葉片基因組DNA提取參照文獻(xiàn)[22]中的方法進(jìn)行。橡膠樹膠乳RNA提取參照文獻(xiàn)[23]中的方法進(jìn)行。用DNase I去除RNA中殘留的DNA。cDNA第一鏈合成參照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行。

1.2.2巴西橡膠樹HbADF基因組序列的克隆與分析

根據(jù)已知HbADF全長(zhǎng)cDNA序列 (GenBank登錄號(hào)HM126477)設(shè)計(jì)基因組擴(kuò)增特異引物HbADFGF (5′–CTCTCTGCGGCTACTGTATC–3′)和HbADFGR (5′–TCCTGCTTCACCATCCCACA–3′)，以橡膠樹基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD18–T載體進(jìn)行連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定為陽性的克隆送公司測(cè)序。利用NCBI網(wǎng)站bl2seq在線工具對(duì)HbADF全長(zhǎng)cDNA和基因組序列進(jìn)行比對(duì)，確定HbADF內(nèi)含子和外顯子。

1.2.3 HbADF的表達(dá)分析

采用real-time PCR對(duì)HbADF的表達(dá)模式進(jìn)行分析。根據(jù)HbADF的cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物HbADF–qRTF(5′–GCCGTGCCAGCTGAATGTGA–3′)和HbADF–qRTR(5′–TCCTGCTTCACCATCCCA CA–3′)，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)以橡膠樹18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參，設(shè)計(jì)引物Hb18S–qRTF (5′–GCTCGAAGACGATCAGATACC–3′)和Hb18S–qRTR(5′–TTCAGCCTTGCGACCATAC–3′)對(duì)各處理模板進(jìn)行擴(kuò)增。相對(duì)表達(dá)量用2–ΔΔCt法計(jì)算。采用SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4HbADF真核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)HbADF的cDNA序列和真核表達(dá)載體pESP–2多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物HbADFOF (5′–GGATCCATGGCCAATGCTGCTTCTGG–3′，下劃線表示BamHI識(shí)別序列)和HbADFOR (5′–GCATGCTCAG CTGGCACGGCTTTTAAA–3′，下劃線表示Sph I識(shí)別序列)，以橡膠樹膠乳cDNA為模板擴(kuò)增HbADF開放閱讀框。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接至pMD18–T載體，挑取陽性克隆送公司測(cè)序。用BamH I和Sph I對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收目的條帶，通過T4DNA連接酶與經(jīng)同樣雙酶切回收的載體pESP–2進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用BamH I和Sph I進(jìn)行雙酶切及菌落PCR鑒定。

1.2.5HbADF在裂殖酵母中過表達(dá)的分析

參照試劑盒說明書，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化裂殖酵母SPQ–01感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有5 μmol/L硫胺素的EMM培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取酵母單克隆于含5 μmol/L硫胺素的EMM液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)2 d。按1∶100比例取菌液至新鮮的含5 μmol/L硫胺素的EMM液體培養(yǎng)基中，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 nm為0.2左右。將培養(yǎng)物均分為2份，離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體3次。將菌體分別接種于不含硫胺素和含5 μmol/L硫胺素的EMM液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖菌誘導(dǎo)20 h。提取誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行SDS–PAGE電泳，同時(shí)以pESP–2空載體轉(zhuǎn)化酵母為負(fù)對(duì)照，以細(xì)胞松弛素B處理裂殖酵母SPQ–01為正對(duì)照。

1.2.6過表達(dá)HbADF裂殖酵母形態(tài)和細(xì)胞核的觀察

取10 μL上述培養(yǎng)物置于載玻片上，蓋上蓋玻片，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。為觀察細(xì)胞核數(shù)目，取20 μL培養(yǎng)物，用50 mmol/L PBS (pH6.8)洗3次，加入終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的4',6–二脒基–2–苯基吲哚 (DAPI)，每個(gè)處理均隨機(jī)選擇50個(gè)酵母細(xì)胞，測(cè)量其長(zhǎng)度和寬度。每個(gè)處理隨機(jī)選擇100個(gè)DAPI染色的酵母細(xì)胞，觀察其雙核或多核比例。采用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1HbADF基因組序列及基因結(jié)構(gòu)

以橡膠樹品系熱研7–33–97基因組DNA為模板，通過PCR和測(cè)序技術(shù)，獲得2 258 bp的HbADF基因組序列。比對(duì)HbADF基因組序列和全長(zhǎng)cDNA序列，發(fā)現(xiàn)獲得的HbADF基因組序列包括完整的開放閱讀框和部分5′、3′–UTR序列 (圖1)。HbADF基因組序列含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子。2個(gè)內(nèi)含子的大小分別為1 604、94 bp，依次位于DNA序列 (以起始密碼子ATG中A為第1位)的4～1607位和1874～1967位，所有內(nèi)含子與外顯子剪接處均符合GT/AG模式。第1個(gè)內(nèi)含子插入在HbADF編碼氨基酸序列起始密碼子的第3個(gè)堿基與第2位Ala的第1個(gè)堿基之間，第2個(gè)內(nèi)含子插入在HbADF編碼氨基酸序列第80位Trp的第2個(gè)堿基與第3個(gè)堿基之間。

圖1　HbADF基因組序列Fig.1 Genomic sequence of HbADF

2.2HbADF的表達(dá)模式

以Hb18S rRNA為內(nèi)參，采用real-time PCR方法分析HbADF表達(dá)模式。與健康橡膠樹相比，死皮樹膠乳中HbADF的表達(dá)量下降，其中5級(jí)死皮樹膠乳中HbADF的表達(dá)量最低，約為健康樹膠乳中表達(dá)量的58%(圖2)。KI處理調(diào)控HbADF表達(dá)，處理后24 h的表達(dá)量達(dá)到最高，約為處理后0 h表達(dá)量的3.18倍，隨后降低 (圖3)。不同排膠時(shí)間下HbADF的表達(dá)結(jié)果顯示，隨著排膠時(shí)間的延長(zhǎng)，HbADF的表達(dá)量逐漸下降，割膠35 min后至停排時(shí)間段收集的膠乳中，HbADF的表達(dá)量?jī)H為割膠后0～5 min膠乳的72 %左右，復(fù)割后0～5 min膠乳中HbADF的表達(dá)量上升 (圖4)。

圖2　不同死皮等級(jí)橡膠樹膠乳中HbADF的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Expression patterns of HbADF in latex from different

圖3　不同KI處理時(shí)間HbADF的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Expression patterns of HbADF under KI treatment

圖4　不同排膠時(shí)間HbADF的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Expression patterns of HbADF under different time of latex flow

2.3pESP–2–HbADF真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其

在裂殖酵母中的過表達(dá)

以橡膠樹膠乳cDNA 為模板， 擴(kuò)增出1條約430 bp的條帶，回收目的條帶，與pMD18–T 載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。提取測(cè)序正確的陽性克隆質(zhì)粒，用BamH I 和Sph I進(jìn)行雙酶切，回收430 bp左右的目的條帶，進(jìn)一步與經(jīng)同樣雙酶切并回收的pESP–2載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行PCR鑒定。挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后產(chǎn)生約420 bp的目的條帶，表明HbADF 編碼區(qū)已插入真核表達(dá)載體pESP–2中。將重組質(zhì)粒命名為pESP–2– HbADF。

將重組質(zhì)粒pESP–2–HbADF轉(zhuǎn)入到裂殖酵母SPQ–01感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單克隆菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS–PAGE 電泳，結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)的pESP–2–HbADF產(chǎn)物中比對(duì)照多出了1條相對(duì)分子質(zhì)量約38 000的蛋白條帶，其大小與預(yù)期pESP–2–HbADF融合表達(dá)產(chǎn)物的基本一致。在誘導(dǎo)表達(dá)的pESP–2產(chǎn)物中和5 μmol/L硫胺素抑制表達(dá)的pESP–2、pESP–2–HbADF產(chǎn)物中均未見該蛋白條帶，說明pESP–2–HbADF已在裂殖酵母中成功表達(dá) (圖5)。

圖5　pESP–2–HbADF/SPQ–01真核表達(dá)產(chǎn)物的SDS–PAGE分析結(jié)果Fig.5 SDS–PAGE analysis of expression products from yeast SPQ–01 with pESP–2–HbADF

2.4過表達(dá)HbADF的裂殖酵母形態(tài)和細(xì)胞核觀察結(jié)果

誘導(dǎo)表達(dá)HbADF的酵母細(xì)胞比未誘導(dǎo)表達(dá)HbADF的酵母細(xì)胞長(zhǎng)，明顯比誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下轉(zhuǎn)化pESP–2空載體的酵母細(xì)胞大，與細(xì)胞松弛素B處理的正對(duì)照細(xì)胞長(zhǎng)度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，過表達(dá)HbADF的酵母細(xì)胞寬度與未誘導(dǎo)表達(dá)HbADF的酵母、正對(duì)照和負(fù)對(duì)照的酵母無明顯差異。DAPI染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)HbADF過表達(dá)的酵母中雙核及多核比例為67%，明顯比未誘導(dǎo)表達(dá)HbADF的酵母，以及誘導(dǎo)或非誘導(dǎo)條件下轉(zhuǎn)化pESP–2空載體負(fù)對(duì)照酵母中的高，但低于細(xì)胞松弛素B處理的正對(duì)照細(xì)胞(表1)。

表1　各處理酵母細(xì)胞的形態(tài)指標(biāo)Table　1 Changes of yeast cell morphology from various treatments

3　結(jié)論與討論

對(duì)ADF家族而言，不同物種ADF在內(nèi)含子數(shù)量和位置上相對(duì)保守。12個(gè)擬南芥ADF家族成員中有10個(gè)ADF具有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，5 個(gè)ADF起始密碼子后緊接著第1內(nèi)含子[24]。據(jù)研究，矮牽牛PhADF1第1個(gè)內(nèi)含子在擬南芥中可以增強(qiáng)GUS基因表達(dá)[25]，該內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)反應(yīng)在進(jìn)化過程中相對(duì)保守[26]。本研究結(jié)果表明，HbADF的結(jié)構(gòu)與大多數(shù)擬南芥ADF的結(jié)構(gòu)類似，具有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，起始密碼子后緊接著第1內(nèi)含子?；贏DF第1內(nèi)含子的保守功能，克隆HbADF基因組序列有助于后續(xù)的基因表達(dá)調(diào)控研究。

割膠后乳管傷口末端形成的蛋白質(zhì)網(wǎng)在乳管堵塞過程中起著關(guān)鍵作用，該蛋白質(zhì)網(wǎng)的形成與肌動(dòng)蛋白絲的聚集同時(shí)發(fā)生[21]。鄧順楠[27]推測(cè)“蛋白質(zhì)網(wǎng)”通過與肌動(dòng)蛋白互作，把堵塞物固定在乳管傷口末端。作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白重要成員的ADF，通過解聚與聚合肌動(dòng)蛋白來調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)裝配過程，藉以完成多種細(xì)胞功能。死皮樹割線乳管局部或完全堵塞，排膠量明顯下降，甚至停止排膠。不同死皮階段橡膠樹膠乳中HbADF的表達(dá)量都低于健康樹，5級(jí)死皮樹膠乳中的HbADF表達(dá)量?jī)H為健康樹的58%。死皮樹中HbADF下調(diào)可能引起F–actin解聚減少，膠乳中F/G–actin比例增大，易于形成蛋白質(zhì)網(wǎng)堵塞乳管。KI作為微絲解聚劑能使F–actin解聚，高濃度KI引起橡膠樹死皮[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)KI調(diào)控HbADF表達(dá)，可推測(cè)HbADF可能參與了KI 解聚F–actin的過程，但還需進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)加以證明。在排膠過程中，乳管排出的膠乳中肌動(dòng)蛋白含量逐漸減少，這與肌動(dòng)蛋白微絲在乳管傷口的聚集現(xiàn)象一致，表明膠乳中的肌動(dòng)蛋白可能在排膠過程中被截留在乳管傷口[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著排膠時(shí)間的延長(zhǎng)，HbADF的表達(dá)量逐漸下降，這可能引起乳管中F/G–actin比例增大，蛋白質(zhì)網(wǎng)逐漸形成，乳管排出的膠乳中肌動(dòng)蛋白含量逐漸減少，而未排出乳管的肌動(dòng)蛋白直接被截留在乳管傷口末端的蛋白質(zhì)網(wǎng)上。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[21]的研究結(jié)果一致。結(jié)合本項(xiàng)目組的前期研究結(jié)果 (HbADF受乙烯和茉莉酸調(diào)控[28]，乙烯在橡膠樹死皮和排膠過程扮演重要角色。)進(jìn)行分析，可推測(cè)HbADF可能參與了橡膠樹死皮和排膠的過程。

在裂殖酵母中過表達(dá)植物ADF能引起肌動(dòng)蛋白彌散和雙核現(xiàn)象[29]。在酵母中過表達(dá)棉花GhADF7[11]和煙草TaADF7[18]均引起酵母細(xì)胞變長(zhǎng)。在裂殖酵母中過表達(dá)HbADF，酵母細(xì)胞明顯變長(zhǎng)，其寬度沒有明顯變化，雙核和多核比例增大。裂殖酵母細(xì)胞于細(xì)胞分裂中期在赤道板形成收縮環(huán)，在細(xì)胞分裂后期，肌動(dòng)蛋白環(huán)啟動(dòng)細(xì)胞收縮，將細(xì)胞一分為二。裂殖酵母細(xì)胞中異源過表達(dá)HbADF可能影響肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成，抑制中央細(xì)胞壁內(nèi)陷，影響正常細(xì)胞分裂，導(dǎo)致多核細(xì)胞形成。HbADF過表達(dá)可能影響肌動(dòng)蛋白解聚和聚合平衡，改變肌動(dòng)蛋白循環(huán)速率，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。

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責(zé)任編輯：王賽群英文編輯：王 庫(kù)

Expression analysis and functional characterization of an actin depolymerizing factor in Hevea brasiliensis

Deng Zhi1, Liu Xianghong1,2, Li Dejun1*
(1.Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China; 2.College of Agriculture, Hainan University, Haikou, 570228, China)

Abstract:Actin depolymerizing factor (ADF) plays an important role in regulating actin assembly and disassembly for cells. In this study, the genomic sequence of HbADF, a 2 258 bp-length with two introns and three exons, was obtained from Hevea brasiliensis with PCR and sequencing methods. The recombinant protein with relative molecular mass about 38 000 was successfully induced by overexpressing HbADF in fission yeast. The cell morphology and the proportion of binucleate or coenocytic cells were further analyzed in the yeast overexpressing HbADF. The results showed that the length of yeast cells from overexpressing HbADF was markedly increased. In addition, it was observed that about 67% of the cells overexpressing HbADF were binucleate or coenocytic after induction. Real-time PCR analysis indicated that HbADF was regulated by 3% KI treatment and its expression varied with tapping panel dryness (TPD) stages and latex flow times. These results suggested that HbADF might play important roles in regulating TPD occurrence and latex flow in Hevea brasiliensis.

Keywords:Hevea brasiliensis; actin depolymerizing factor; expression analysis; function characterization; latex flow; cell morphology

中圖分類號(hào)：S794.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007?1032(2016)02?0129?07

收稿日期：2015–08–14 修回日期：2016–03–04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270651；31200514)

作者簡(jiǎn)介：鄧治(1977—)，女，云南昭通人，碩士，副研究員，主要從事橡膠樹分子生物學(xué)研究，zizip@163.com；*通信作者，李德軍，博士，研究員，主要從事植物分子生物學(xué)研究，djli.rricatas@gmail.com