ADSCs與HUVECs體外共培養(yǎng)促進(jìn)HUVECs增殖及成血管化作用

焦自釗，薛武軍，田曉輝，李　楊，鄭　瑾

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟病醫(yī)院腎移植科，陜西西安　710061)

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◇基礎(chǔ)研究◇

ADSCs與HUVECs體外共培養(yǎng)促進(jìn)HUVECs增殖及成血管化作用

焦自釗，薛武軍，田曉輝，李楊，鄭瑾

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟病醫(yī)院腎移植科，陜西西安710061)

摘要：目的為制備血管化胰島，分離、培養(yǎng)脂肪來源干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ADSCs)，觀察細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，ADSCs對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVECs)增殖及成血管化功能的促進(jìn)作用并探討其機(jī)制。方法采用膠原酶消化法分別原代培養(yǎng)獲得ADSCs與HUVECs，細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫熒光或多向誘導(dǎo)分化鑒定，建立HUVECs與ADSCs接觸式及間接共培養(yǎng)體系，設(shè)立HUVECs單獨(dú)培養(yǎng)為對照組，比較兩組成血管化功能、HUVECs增殖狀況及上清液血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor, b-FGF)濃度。結(jié)果通過原代培養(yǎng)成功獲得ADSCs與HUVECs；第3代ADSCs呈均一的長梭形纖維細(xì)胞樣形態(tài)，免疫熒光檢測見CD44/CD49d(+)、CD31/CD34(-)，并具有多向分化功能；第2代HUVECs免疫熒光檢測示vWF/CD31(+)。于Matrigel內(nèi)接觸式共培養(yǎng)4 h，ADSCs+HUVECs組血管密度高于HUVECs組；間接共培養(yǎng)時(shí)，HUVECs生長曲線于ADSCs+HUVECs組上移，在對數(shù)生長期的第3、4、5天，ADSCs+HUVECs組HUVECs計(jì)數(shù)為(4.52±0.31)×104、(7.18±0.45)×104、(8.23±0.36)×104，大于單獨(dú)HUVECs組的(2.71±0.25)×104、(4.87±0.26)×104、(6.86±0.33)×104(P<0.01)；ADSCs+HUVECs組HUVECs群體倍增時(shí)間為(1.36±0.23)d，短于單獨(dú)HUVECs組的(1.62±0.31)d。四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazol tetraztlium, MTT)法測定HUVECs的A值培養(yǎng)第1、3、5、7天的ADSCs+HUVECs組高于單獨(dú)HUVECs組(P<0.01)。培養(yǎng)第3、7、13天時(shí)ADSCs+HUVECs組上清液VEGF、b-FGF濃度均高于HUVECs組(P<0.01)。結(jié)論ADSCs與HUVECs共培養(yǎng)時(shí)，ADSCs可能通過分泌或增加HUVECs分泌VEGF、b-FGF等細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)HUVECs增殖及成血管化。

關(guān)鍵詞：共培養(yǎng)；脂肪來源干細(xì)胞；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖；成血管化

胰島移植是治療Ⅰ型糖尿病的有效手段，但在胰島分離純化過程中破壞了其內(nèi)部的微循環(huán)系統(tǒng)，以致移植后早期大量的移植胰島因缺血、缺氧而凋亡、死亡，胰島功能受損[1-2]。再建移植胰島的微循環(huán)已成為胰島移植迫切需要解決的問題之一。研究報(bào)道，骨髓等間充質(zhì)干細(xì)胞可通過旁分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、成纖維生長因子(fibroblast growth factor, FGF)、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子等促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管形成[3-6]。因此，我們將分離、培養(yǎng)的脂肪來源干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ADSCs)及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)，研究在體外共培養(yǎng)條件下，ADSCs對HUVECs增殖及成血管化功能的促進(jìn)作用并探討其機(jī)制，為以后制備血管化胰島鑒定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料脂肪組織來自因疤痕修復(fù)需行腹部取皮術(shù)患者的腹部皮下脂肪組織(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科提供)，無系統(tǒng)性感染、糖尿病及相關(guān)疾病，年齡18～42歲；臍帶組織來自健康孕婦足月妊娠經(jīng)剖腹產(chǎn)娩出的新生兒臍帶組織(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科提供)；取標(biāo)本前經(jīng)醫(yī)院倫理委員會及患者同意。

倒置式顯微鏡及VANOX型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；5100型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國NAPCC公司)；ELISA試劑盒(VEGF、b-FGF)及抗人CD31、CD34、CD49d、vWF抗體，F(xiàn)ITC或PE標(biāo)記的二抗(美國Sigma公司)；膠原酶Ⅰ、膠原酶Ⅱ、胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基 (美國Gibco公司產(chǎn))；Matrigel、錐蟲藍(lán)、MTT(上海偉進(jìn)生物科技有限公司)。

1.2ADSCs的分離、培養(yǎng)及多向誘導(dǎo)分化鑒定無菌條件下取脂肪組織10 g，超凈臺內(nèi)剪除筋膜和血管，PBS液沖洗除去血液和組織碎片；剪碎脂肪組織至大小約1 mm3，0.1 g/L的膠原酶Ⅰ溶液，于37 ℃水浴震蕩消化60 min；1 000 r/min離心5 min，棄去上層油脂、脂肪組織以及上清；DMEM-F12培養(yǎng)基重懸，75 μm不銹鋼篩網(wǎng)過濾，再次1 000 r/min離心5 min；棄去上清，DMEM-F12完全培養(yǎng)基(含100 mL/L胎牛血清，100 U/L青霉素，100 μg/L鏈霉素 )重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞種植密度，以5×104個(gè)有核細(xì)胞/cm2密度接種25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。37 ℃、飽和濕度、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，視細(xì)胞生長狀況每2～3 d換液1次。倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，2.5 g/L胰酶+0.2 g/L EDTA消化傳代。

ADSCs體外多向誘導(dǎo)分化鑒定：取P3代生長均一的ADSCs，分別向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化。

①ADSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化：取P3代生長均一的ADSCs以5×104/孔接種至6孔板，DMEM-F12完全培養(yǎng)基孵育至80%融合，換成成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(DMEM-F12培養(yǎng)基+100 mL/L胎牛血清+0.5 mmol/L IBMX+1 μmol/L地塞米松+10 μmol/L胰島素+200 μmol/L吲哚美辛+100 U/L青霉素+100 μg/L鏈霉素)誘導(dǎo)。DMEM-F12完全培養(yǎng)基為陰性對照。每3 d更換培養(yǎng)液1次，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并油紅O染色定性觀察體外誘導(dǎo)分化的結(jié)果。

油紅O染色定性：取5 g/L油紅O儲存液，按儲存液∶蒸餾水=3∶2的比例稀釋并過濾，制成油紅O染色劑。染色時(shí)，細(xì)胞棄去原培養(yǎng)液，PBS漂洗1遍，40 g/L多聚甲醛在4 ℃條件下固定1 h，700 mL/L異丙醇清洗1遍，加1.5 mL油紅O染色劑室溫下20 min，600 mL/L異丙醇洗去多余的染料，PBS漂洗，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成。

②ADSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化：取P3代生長均一的ADSCs以5×104/孔接種至6孔板，DMEM-F12完全培養(yǎng)基孵育至80%融合，換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(DMEM-F12培養(yǎng)基+100 mL/L胎牛血清+10 mmoL/L VitD3+37.5 mg/L VitC+2.16 g/L β2磷酸甘油+100 U/L青霉素+100 μg/L鏈霉素)誘導(dǎo)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并茜素紅染色鑒定。

茜素紅染色：成骨誘導(dǎo)14 d的，蒸餾水沖洗，750 mL/L乙醇固定20～30 min，蒸餾水沖洗后加入20 g/L茜素紅10～20 min，鏡下觀察。

1.3ADSCs表型的免疫熒光檢測酸化處理的普通蓋玻片消毒后放入24孔培養(yǎng)板，將P3代的ADSCs懸液接種于蓋玻片上，37 ℃、飽和濕度、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞均勻鋪滿孔底，吸出培養(yǎng)液，用PBS沖洗蓋玻片，根據(jù)ADSCs的表面抗原譜免疫熒光法檢測ADSCs的CD31、CD34、CD44、CD49d相關(guān)抗原。

取出玻片后置入濕盒中，PBS沖洗，3 min×2次；40 g/L多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗3 min×2次；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑10 min，PBS沖洗3 min×2次；10 g/L TritonX-100 2 min，PBS沖洗3 min×2次；分別加兔抗人CD31、CD34、CD44、CD49d IgG一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次；加Cyc3或FITC-羊抗兔IgG熒光二抗，室溫下避光2 h，PBS沖洗5 min×3次；甘油封片，指甲油封片周，即刻在熒光顯微鏡下觀察。

1.4HUVECs的分離、培養(yǎng)及鑒定超凈臺內(nèi)修齊兩斷面，找出臍靜脈，用PBS液將血跡完全沖洗干凈；從沖洗的針頭中注入1 g/L的膠原酶Ⅱ使其充盈后止血鉗鉗夾兩端，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育15 min，間斷輕輕按摩靜脈使其消化更充分；消化完畢后收集臍靜脈內(nèi)的消化液，然后注入含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基再次沖洗管腔；將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1 000 r/min，離心5 min，棄上清；調(diào)整細(xì)胞種植密度，以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種于預(yù)先用10 g/L明膠鋪被的25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含200 mL/L胎牛血清、20 ng/L hVECF121、L-谷氪酰胺2 mmol/L、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)，37 ℃、飽和濕度、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。視細(xì)胞生長狀況每2～3 d 換液1次，內(nèi)皮細(xì)胞達(dá)70%～80%匯合融合時(shí)用2.5 g/L胰酶+0.2 g/L EDTA消化傳代。

用兔抗人CD31、VWF IgG一抗及相應(yīng)二抗對HUVECs進(jìn)行免疫熒光鑒定，方法同ADSCs免疫熒光鑒定。

1.5ADSCs和HUVECs直接共培養(yǎng)取ADSCs與HUVECs，RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，于6孔板每孔內(nèi)各加入1 mL ADSCs與HUVECs細(xì)胞懸液，使ADSCs與HUVECs比例為1∶1，RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含200 mL/L胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d換液。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞共培養(yǎng)大體形態(tài)。

ADSCs和HUVECs在Matrigel中直接共培養(yǎng)：將Matrigel置于4 ℃過夜融解，每孔100 μL加入24孔板后37 ℃孵育1～2 h成膠；取ADSCs與HUVECs，分別消化，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL；設(shè)立ADSCs和HUVECs共培養(yǎng)組及HUVECs單獨(dú)培養(yǎng)組，共培養(yǎng)組每孔內(nèi)各加入1 mL ADSCs與HUVECs細(xì)胞懸液，使ADSCs與HUVECs比例為1∶1，單獨(dú)培養(yǎng)組各加入1 mL HUVECs，用培養(yǎng)基補(bǔ)至2 mL(實(shí)驗(yàn)過程冰上操作)；37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及各孔血管形成情況。

1.6ADSCs和HUVECs間接共培養(yǎng)取ADSCs按1×104/mL密度接種在Transwell 24孔雙層培養(yǎng)板的上層，將HUVECs接種于下層培養(yǎng)板中，接種密度1×104/mL，在雙層24孔板的每孔中加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基2 mL，上下各1 mL，每2 d換液1次，分別收集第3、7、13天上清液100 μL，按ELISA試劑盒說明檢測上清液VEGF、b-FGF等細(xì)胞因子濃度，設(shè)單獨(dú)HUVECs培養(yǎng)組對照組。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。每2 d取3孔2.5 g/L胰酶消化，錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)。共計(jì)數(shù)8 d。繪制各組HUVECs細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。

取ADSCs按1×104/mL密度接種于Transwell 96孔雙層培養(yǎng)板的上層，將HUVECs接種于下層培養(yǎng)板中，接種密度1×104/mL，RPMI-1640完全培養(yǎng)基200 μL，上下各100 μL，使ADSCs與HUVECs比例為1∶1，每2 d換液1次；HUVECs組只于下層培養(yǎng)板中加入100 μL HUVECs細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)基補(bǔ)至200 μL；培養(yǎng)1、3、5、7 d后，取出Transwell 96孔雙層培養(yǎng)板的上層，下層培養(yǎng)板中保留培養(yǎng)液100 μL，每孔分別加入5 g/L的MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后吸掉上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度(A值)。

2結(jié)果

2.1ADSCs的培養(yǎng)與鑒定倒置相差顯微鏡下ADSCs細(xì)胞呈貼壁生長，原代培養(yǎng)至14 d的細(xì)胞達(dá)約80%融合，細(xì)胞呈梭形、多角形、圓形等多種形態(tài)；傳至P3代時(shí)細(xì)胞生長良好，呈漩渦狀或輻射狀生長，均一的長梭形纖維細(xì)胞樣形態(tài)，與文獻(xiàn)報(bào)道的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)相符(圖1)。

ADSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后3 d，鏡下可見小部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量高折光性的細(xì)小脂滴，并逐漸聚集；分化誘導(dǎo)后6 d，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，從長梭形類成纖維細(xì)胞外觀逐漸變圓，并且開始出現(xiàn)充滿脂滴的細(xì)胞，油紅O染色陽性，未加成脂誘

導(dǎo)劑的陰性對照組則為梭形細(xì)胞形態(tài)(圖1)。向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化3～4 d，細(xì)胞形態(tài)開始改變，由長梭形變?yōu)楸鈭A形，細(xì)胞核變圓，細(xì)胞體積增大，長軸縮短，細(xì)胞外基質(zhì)有少量鈣鹽沉積，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，鈣鹽沉積增加；成骨誘導(dǎo)14 d，茜素紅染色提示細(xì)胞外基質(zhì)大量鈣鹽沉積，未加成骨誘導(dǎo)劑的陰性對照組則為梭形細(xì)胞形態(tài)(圖1)。經(jīng)CD31、CD34、CD44、CD49d表面抗原熒光染色后，鏡下可見CD31、CD34呈陰性反應(yīng)，CD44、CD49d呈陽性反應(yīng)，符合文獻(xiàn)報(bào)道的ADSCs表面抗原譜(圖2)。

圖1脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)及多向誘導(dǎo)分化

Fig.1 The culture and multi-directional differentiation of ADSCs (×100)

A：P3代細(xì)胞形態(tài)呈均一長梭形，呈旋渦狀生長；B：ADSCs成脂誘導(dǎo)6 d，油紅O染色陽性；C：ADSCs成骨誘導(dǎo)14 d，茜素紅染色陽性。

圖2ADSCs細(xì)胞的免疫熒光鑒定

Fig.2 Immunofluorescence test of surface antigens on ADSCs (×100)

A、B：ADSCs的CD31、CD34免疫熒光鑒定呈陰性反應(yīng)；C：CD44加FITC-羊抗兔IgG熒光二抗呈陽性反應(yīng)；D：CD49d加Cyc3-羊抗兔IgG熒光二抗呈陽性反應(yīng)。

2.2HUVECs的培養(yǎng)與鑒定相差倒置顯微鏡下觀察，HUVECs貼壁單層生長，呈短梭狀或鋪路石樣鑲嵌排列，細(xì)胞為扁平多角形，邊界清楚，胞質(zhì)豐富，胞核清晰可見，為圓形或橢圓形。原代培養(yǎng)細(xì)胞，于接種后2 h開始貼壁生長，傳代細(xì)胞約0.5 h后即開始貼壁生長；原代細(xì)胞5～7 d可達(dá)70%～80%匯合融合，傳代細(xì)胞生長旺盛，約3 d可長滿瓶底。HUVECs的CD31、vWF血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)抗原檢測呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞呈鋪路石樣鑲嵌排列，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖3)。

2.3ADSCs和HUVECs共培養(yǎng)倒置顯微鏡下可見，在直接接觸培養(yǎng)條件下，ADSCs和HUVECs呈相容性貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，相鄰細(xì)胞貼靠交織生長。HUVECs接種于Matrigel內(nèi)2 h后可見HUVECs毛刺狀突起，4 h后可見毛刺狀突起呈小官狀相互銜接，說明HUVECs在Matrigel內(nèi)有血管形成功能。ADSCs和HUVECs共培養(yǎng)組血管密度比單純HUVECs組密度更高(圖4)。

圖3HUVECs培養(yǎng)及免疫熒光鑒定

Fig.3 The culture and immunofluorescence test of HUVECs (×100)

A：HUVECs貼壁生長，扁平多角形，呈短梭狀或鋪路石樣鑲嵌排列；B：CD31加FITC-羊抗兔IgG熒光二抗呈陽性反應(yīng)；C：vWF加PE-羊抗兔IgG熒光二抗呈陽性反應(yīng)。

圖4ADSCs+HUVECs共培養(yǎng)

Fig.4 The co-culture of ADSCs and HUVECs (×200)A：ADSCs+HUVECs直接共培養(yǎng)；B：ADSCs+HUVECs組于Matrigel內(nèi)共培養(yǎng)4 h；C：HUVECs組于Matrigel內(nèi)培養(yǎng)4 h。

間接共培養(yǎng)時(shí)，ADSCs+HUVECs組、HUVECs組培養(yǎng)8 d繪制HUVECs細(xì)胞生長曲線可見，在ADSCs+HUVECs組曲線上移，2組均在第2天進(jìn)入對數(shù)生長期，持續(xù)時(shí)間持續(xù)均為3 d。在對數(shù)生長期第3、4、5天HUVECs細(xì)胞計(jì)數(shù)，ADSCs+HUVECs組分別為(4.52±0.31)×104、(7.18±0.45)×104、(8.23±0.36)×104，大于HUVECs組的(2.71±0.25)×104、(4.87±0.26)×104、(6.86±0.33)×104(P<0.01)；ADSCs+HUVECs組、HUVECs組，根據(jù)公式DT=T×Lg2/(LgNt-LgNo)計(jì)算HUVECs細(xì)胞群體倍增時(shí)間分別為(1.36±0.23)d、(1.62±0.31)d(DT：倍增時(shí)間；T：培養(yǎng)時(shí)間；Nt：對數(shù)生長期終點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)；No：首次細(xì)胞計(jì)數(shù))(圖5A)。

間接共培養(yǎng)第3、7、13天時(shí)，ADSCs+HUVECs組上清液VEGF、b-FGF質(zhì)量濃度分別為(33.45±6.78)pg/L、(38.75±5.67)pg/L、(35.42±6.34)pg/L，(19.78±3.27)pg/L、(21.34±4.13)pg/L、(17.26±2.89)pg/L；單獨(dú)HUVECs組上清液VEGF、b-FGF質(zhì)量濃度分別為(5.34±0.98)pg/L、(5.61±1.12)pg/L、(5.75±1.03)pg/L，(2.31±0.42)pg/L、(2.45±0.17)pg/L、(2.17±0.21)pg/L，ADSCs+HUVECs組均高于單獨(dú)HUVECs組(P<0.01，圖5B、5C)。

共培養(yǎng)后第1、3、5、7天，MTT法檢測HUVECs細(xì)胞增值能力，結(jié)果顯示，ADSCs+HUVECs組HUVECs的A值分別為0.16±0.04、0.32±0.05、0.51±0.08、0.29±0.03，顯著高于HUVECs組的0.11±0.03、0.28±0.07、0.24±0.05、0.14±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；ADSCs+HUVECs組的HUVECs的A值第5天達(dá)高峰后下降，HUVECs組的A值第3天達(dá)高峰后下降(圖5D)。

3討論

近年來，促進(jìn)冠心病、腦血栓形成等缺血性疾病的缺血器官血管再建問題已成為臨床醫(yī)學(xué)面臨的重大課題。同時(shí)，組織工程中的微循環(huán)再建問題亦受到人們的廣泛關(guān)注，如胰島移植中，普遍認(rèn)為移植胰島的存活很大程度上取決于其早期血管化的程度和速度。血管再生(angiogenesis)是指從已存在于血管網(wǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞分化而形成新的血管。血管生長過程受酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF and bFGF)、表皮生長因子、血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等多種生長因子的調(diào)節(jié)。其中VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的生長因子，具有顯著促進(jìn)新生血管形成的功能[7-8]。骨髓等間充質(zhì)干細(xì)胞可通過旁分泌產(chǎn)生VEGF、FGF、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子等多種促內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管再生的細(xì)胞因子，從而改善胰島血管再生的微環(huán)境[3-6]。

脂肪干細(xì)胞(ADSCs)是從脂肪組織中分離得到的一群多能間充質(zhì)干細(xì)胞，相對于骨髓干細(xì)胞(BMSCs)，具有取材方便、對供體損傷小、來源充足、擴(kuò)增迅速、可自體移植等優(yōu)點(diǎn)；而在細(xì)胞分泌、穩(wěn)定生長能力、分化能力方面二者無明顯差別，是胰島、骨組織工程中良好的種子細(xì)胞[9-14]。本實(shí)驗(yàn)中我們成功分離、培養(yǎng)了人脂肪干細(xì)胞(ADSCs)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫熒光及多向分化功能鑒定符合間充質(zhì)干細(xì)胞特性，和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)間接共培養(yǎng)時(shí)ELISA檢測見共培養(yǎng)組上清液VEGF、b-FGF濃度明顯高于HUVECs單獨(dú)培養(yǎng)組，從而證實(shí)ADSCs細(xì)胞和其他間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，亦存在VEGF、FGF等多種促血管再生細(xì)胞因子的分泌功能。

圖5HUVECs細(xì)胞生長曲線、上清液VEGF、b-FGF質(zhì)量濃度及HUVECs A值的比較

Fig.5 The growth curve of HUVECs, the concentration of VEGF and b-FGF in the supernatant, and A value of HUVECs

與HUVECs組比較，*P<0.01。

目前，組織工程促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管化的方法主要為添加VEGF等生長因子、轉(zhuǎn)染VEGF基因等，但由于存在VEGF等生長因子半衰期短、作用部位不確定及轉(zhuǎn)染病毒的安全性問題，限制了以上方法的應(yīng)用[15-16]。脂肪干細(xì)胞(ADSCs)等間充質(zhì)干細(xì)胞因除具有VEGF、FGF等多種促血管再生細(xì)胞因子的分泌功能外，還具有低免疫源性，可自體、異體移植及通過旁分泌作用局部等優(yōu)點(diǎn)，因此成為組織工程中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管化的良好方法之一[17-18]。BHANG等[19]研究ADSCs細(xì)胞體內(nèi)注射給下肢缺血大鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，ADSCs細(xì)胞具有向缺血區(qū)域歸巢的作用，能夠促使缺血下肢的血管密度增高，血流量增加，并證實(shí)這種促進(jìn)血管形成的功能是通過ADSCs細(xì)胞旁分泌VEGF、FGF等多種促進(jìn)血管再生的細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)的。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，體外直接接觸培養(yǎng)條件下，ADSCs和HUVECs呈相容性、相鄰細(xì)胞貼靠交織生長；于Matrigel內(nèi)接觸式共培養(yǎng)時(shí)見ADSCs+HUVECs組血管密度高于HUVECs組，證實(shí)了ADSCs具有促進(jìn)HUVECs成血管化的功能。細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞群體倍增時(shí)間及四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazol tetraztlium, MTT)法測定的A值均是細(xì)胞增殖行為的客觀指標(biāo)，細(xì)胞生長曲線可全面反映細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞群體倍增時(shí)間可反映細(xì)胞的分裂能力，但不能反映增殖細(xì)胞的活性，而MTT法測定的A值則對細(xì)胞活性的反映更準(zhǔn)確[20-21]。因此，綜合采用以上3種方法檢測細(xì)胞的增殖生長能力。在本實(shí)驗(yàn)中，間接共培養(yǎng)時(shí)的HUVECs生長曲線示ADSCs+HUVECs組曲線上移，HUVECs計(jì)數(shù)于ADSCs+HUVECs組大于單獨(dú)HUVECs組，HUVECs細(xì)胞群體倍增時(shí)間于ADSCs+HUVECs組短于單獨(dú)HUVECs組；MTT法測定顯示，ADSCs+HUVECs組HUVECs的A值高于HUVECs組。說明ADSCs具有促HUVECs的細(xì)胞增殖作用，并且共培養(yǎng)組上清液VEGF、b-FGF濃度明顯高于HUVECs單獨(dú)培養(yǎng)組，證明ADSCs的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用可能是通過其分泌的或其促進(jìn)HUVECs分泌的VEGF、b-FGF等生長因子實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實(shí)了ADSCs與HUVECs共培養(yǎng)時(shí)，ADSCs可通過分泌或促進(jìn)HUVECs分泌VEGF、b-FGF等細(xì)胞因子促進(jìn)HUVECs增殖及成血管化。本實(shí)驗(yàn)不僅為以后血管化胰島的制備鑒定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，而且亦為細(xì)胞治療的臨床轉(zhuǎn)化研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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(編輯卓選鵬)

收稿日期：2016-03-04修回日期：2016-04-07

基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(No.20110201110048)、國家自然科學(xué)基金(No.81400677)、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(No.08143014)

通訊作者：薛武軍. E-mail: xwujun@126.com.

中圖分類號：R318.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604006

ADSCs promotes the proliferation and vascularization of HUVECs when co-cultured in vitro

JIAO Zi-zhao, XUE Wu-jun, TIAN Xiao-hui, LI Yang, ZHENG Jin

(Department of Renal Transplantation, Hospital of Nephropathy,the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

ABSTRACT:ObjectiveFor preparation of vascularized islets, to isolate and culture human adipose derived stem cells, investigate the role of adipose derived stem cells (ADSCs) in promoting the proliferation and vascularization of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) co-cultured in vitro, and explore its mechanism. MethodsADSCs and HUVECs were isolated by collagenase digestion method, then cultured, and identified by morphology, immunofluorescence or multi-directional differentiation. The co-culture system of ADSCs and HUVECs was established, HUVECs cultured alone were set up for control group. The proliferation, vascularization and concentration of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (b-FGF)in the supernatant were compared between the two groups. ResultsThe third generational ADSCs had uniform long spindle fiberous morphology and multi-directional differentiational function. Immunofluorescence test of surface antigens on ADSCs revealed CD44/CD49d(+), CD31/CD34(-), on HUVECs CD31/vWF(+). High vascular density was found when co-cultured in Matrigel of ADSCs and HUVECs than alone of HUVECs. Growth curve shown at days 3, 4 and 5 of the logarithmic phase, HUVECs count in co-culture group of ADSCs and HUVECs was (4.52±0.31)×104, (7.18±0.45)×104, and (8.23±0.36)×104 under indirect co-culture condition, while that in individual HUVECs group was (2.71±0.25)×104, (4.87±0.26)×104, and (6.86±0.33)×104 (P<0.01). Population doubling time of HUVECs was shorter in co-culture group than in individual group. Also, the OD value of HUVECs was higher in co-culture group than in individual group when cultured at days 1, 3, 5 and 7 (P<0.01). When cultured at days 3, 7 and 13, the concentration of VEGF and b-FGF in the supernatant was higher in co-culture group than in individual group (P<0.01). ConclusionADSCs can promote the proliferation and vascularization of HUVECs in vitro co-culture conditions by secreting or increasing the HUVECs secretion of VEGF and b-FGF.

KEY WORDS:co-culture; adipose derived stem cell; human umbilical vein endothelial cell; cell proliferation; vascularization

Supported by the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education (No.20110201110048), the National Natural Science Foundation of China (No.81400677), and the Central University Special Funding for Basic Scientific Research Expenses (No.08143014)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160615.0857.008.html(2016-06-15)