腦外傷后T型鈣通道對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用

張　熙，婁　淼，周　樂，尉春艷

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安　710004；2. 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安　710004；3. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安　710004)

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◇基礎(chǔ)研究◇

腦外傷后T型鈣通道對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用

張熙1，婁淼2，周樂1，尉春艷3

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安710004；2. 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安710004；3. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710004)

摘要：目的探討腦外傷后T型鈣通道對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法構(gòu)建成年大鼠腦損傷模型，分為手術(shù)組和手術(shù)+米貝地爾組(米貝地爾組)，并另設(shè)正常對(duì)照組、假手術(shù)組。分離側(cè)腦室壁的腦室下層(subventricular zone, SVZ)細(xì)胞，用神經(jīng)干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)并鑒定其干細(xì)胞性質(zhì)；在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同劑量的米貝地爾，通過計(jì)數(shù)神經(jīng)干細(xì)胞球、噻唑藍(lán)(MTT)法分析米貝地爾對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖抑制作用，計(jì)算米貝地爾對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)，Western blot法檢測(cè)腦組織中Cav3.2以及神經(jīng)干細(xì)胞中Cav3.2、Cyclin A和caspase-3的蛋白表達(dá)。結(jié)果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，手術(shù)組中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力顯著高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組，應(yīng)用米貝地爾腹腔注射抑制腦組織中T型鈣通道后，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖明顯降低。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，米貝地爾能夠明顯抑制神經(jīng)干細(xì)胞球的形成，MTT法顯示米貝地爾濃度大于5 μmol/L時(shí)，可顯著抑制細(xì)胞增殖，5、10、20 μmol/L組的吸光度(A值)與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IC50值為8.93 μmol/L。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，米貝地爾組的Cav3.2蛋白和Cyclin A蛋白的表達(dá)顯著降低，caspase-3蛋白的表達(dá)顯著升高。結(jié)論腦外傷后可激活腦組織中T型鈣通道，上調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力。

關(guān)鍵詞：腦外傷；神經(jīng)干細(xì)胞；T型鈣通道；米貝地爾；細(xì)胞周期；Cav3.2；Cyclin A；caspase-3

KYT WORDS: brain injury; neural stem cell; T type calcium channel; mebefradil; cell cycle; Cav3.2; Cyclin A; caspase-3

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是最常見的神經(jīng)外科疾病，往往導(dǎo)致長期昏迷、癱瘓、認(rèn)知力下降等后遺癥，給家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)。神經(jīng)干細(xì)胞能夠在不同微環(huán)境下向不同的神經(jīng)細(xì)胞分化，在損傷導(dǎo)致的腦功能障礙的修復(fù)中可發(fā)揮作用。但是，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞來源稀少，自我修復(fù)的能力有限，外源性神經(jīng)干細(xì)胞又面臨著成瘤性、定向誘導(dǎo)分化等困難。T型鈣離子通道是低電壓激活的鈣離子通道，廣泛表達(dá)于腦組織中，調(diào)控腦功能[1]。其與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。抑制T型鈣通道表達(dá)可抑制Cyclin A、Cyclin D等細(xì)胞周期蛋白，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。有研究表明，脊髓損傷后能夠誘導(dǎo)T型鈣離子通道的表達(dá)上調(diào)，但在腦組織中尚無相關(guān)研究[2]。米貝地爾是特異性的T型鈣通道阻滯劑。本研究主要探討腦損傷對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用以及T型鈣離子通道在該過程中的作用。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑成年8周齡SD大鼠24只，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量200～250 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)購自GIBCO公司，Nestin抗體、GFAP抗體、NSE抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，米貝地爾和caspase-3抗體購自Sigma公司，Cav3.2抗體購自Santa Cruz公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的建立隨機(jī)分為正常對(duì)照組(6只)、假手術(shù)組(6只)、手術(shù)組(6只)和手術(shù)+米貝地爾組(即米貝地爾組，6只)。按文獻(xiàn)[3]的方法，用液壓損傷法建立可靠的動(dòng)物模型，即0.12 mol/L的苯巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉(30 mg/kg)，無菌條件下，沿頭顱矢狀縫做長約1 cm正中切口，暴露顱骨外板，在頭顱立體定位儀引導(dǎo)下，在冠狀縫后2.3 mm，矢狀縫旁開1.5 mm的右側(cè)頂葉選取坐標(biāo)點(diǎn)，用顱骨鉆打開顱板，顯示硬腦膜，將打擊管埋置于硬腦膜外，并用牙托水泥固定。24 h后以0.2 MPa的壓力沖擊右側(cè)頂葉皮質(zhì)，造成中度側(cè)位液壓沖擊腦損傷。假手術(shù)組不用液壓沖擊，正常對(duì)照組不進(jìn)行手術(shù)。米貝地爾組每日腹腔注射米貝地爾(15 mg/kg，2次/d)，溶于含有0.5 g/L二甲基亞砜的100 μL的生理鹽水中，其余各組腹腔注射100 μL含0.5 g/L二甲基亞砜的生理鹽水。

1.3神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定術(shù)后7 d，0.12 mol/L苯巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉各組動(dòng)物，以室下區(qū)為中心，迅速切取長約1.0～1.5 cm腦組織并置入冰冷的D-hanks液中，沿側(cè)腦室面切取室下區(qū)，修去損傷區(qū)附近的腦組織后，部分備做Western blot檢測(cè)，其余部分盡量剪成小于1 mm3的組織碎屑，用含1 g/L胰蛋白酶、0.67 mg/mL透明質(zhì)酸酶和0.1 mg/mL DNA酶的混合酶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱消化30 min，移入預(yù)先已加有等體積的1.25 g/L大豆胰酶抑制劑的離心管內(nèi)，反復(fù)吹打，銅網(wǎng)過濾并將濾液收集入離心管內(nèi)，800 r/min離心5 min，棄去上清液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，800 r/min離心5 min。重復(fù)5～6次后，用神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，經(jīng)錐蟲蘭(臺(tái)盼藍(lán))鑒定細(xì)胞活力后，調(diào)整細(xì)胞密度約為50 000～100 000個(gè)/mL，種入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)懸浮培養(yǎng)。接種24 h后更換培養(yǎng)液，以后每隔7 d半量換液。以上過程均在無菌間內(nèi)完成。

單細(xì)胞懸液行抗Nestin免疫染色檢測(cè)，鑒定是否為神經(jīng)干細(xì)胞。將培養(yǎng)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞用含有100 mL/L胎牛血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)束后，檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記物NSE和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP的表達(dá)，鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的多向分化潛能。

1.4MTT檢測(cè)米貝地爾對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球用機(jī)械法傳代，取第2代細(xì)胞，獲取單細(xì)胞懸液，以1 000～10 000個(gè)/孔接種于96孔板，每孔200 μL，37 ℃孵箱(950 mL/L O2和50 mL/L CO2)培養(yǎng)24 h。按米貝地爾濃度以0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L分6組，于96孔板內(nèi)，37 ℃、950 mL/L O2、50 mL/L CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h。另設(shè)空白對(duì)照組。每組6孔。48 h后，每孔加5 mg/mL MTT液20 μL，作用4 h后，將96孔板置離心機(jī)內(nèi)1 000～2 000 r/min離心5 min，使細(xì)胞球貼壁；吸棄培養(yǎng)基，加入DMSO 100 μL/孔，室溫下?lián)u床震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔570 nm波長下吸光度(A值)。并根據(jù)A值計(jì)算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)和增殖抑制率。增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)。

1.5Western blot檢測(cè)Cyclin A、Cav3.2和caspase-3蛋白的表達(dá)將留取的室下區(qū)組織碎屑提取總蛋白，經(jīng)100 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。封閉2 h后與兔抗鼠Cav3.2蛋白(1∶500)孵育過夜，二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯色，以β-actin為內(nèi)參校正。

另提取獲得的神經(jīng)干細(xì)胞的總蛋白，根據(jù)IC50值在實(shí)驗(yàn)組中加入米貝地爾，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，48 h后同上進(jìn)行檢測(cè)Cyclin A、Cav3.2和caspase-3蛋白(1∶500)的表達(dá)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定細(xì)胞接種3 d后，培養(yǎng)瓶中可見干細(xì)胞球形成，顯微鏡下干細(xì)胞球由數(shù)十個(gè)細(xì)胞聚集而成，較緊密，大小不均等，細(xì)胞邊緣光滑、中心膨隆，形態(tài)上與簡(jiǎn)單的細(xì)胞聚集有明顯差別；培養(yǎng)5～7 d后，這些干細(xì)胞球由數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成，中心折光度差，色發(fā)暗(圖1)。細(xì)胞傳代后培養(yǎng)瓶中仍然可以長出類似的細(xì)胞球，且數(shù)目明顯增多，細(xì)胞碎屑明顯減少(圖2)。

圖1原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Neural stem cell morphology in primary culture (×40)

A：原代培養(yǎng)第3天；B：原代培養(yǎng)第6天。

圖2第1次傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Neuralstem cell morphology after the first passage (×40)

A：第1次傳代第3天；B：第1次傳代第6天。

免疫熒光檢測(cè)提示干細(xì)胞球中Nestin蛋白表達(dá)陽性。按照1.3方法進(jìn)行誘導(dǎo)分化2 d后，可見大量細(xì)胞從干細(xì)胞球內(nèi)遷移，并開始形成短小的突起，1周后鏡下可見細(xì)胞形態(tài)成熟(圖3)。

圖3神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的形態(tài)

Fig.3 Neuralstem cell morphology after induction and differentiation (×40)

A：誘導(dǎo)分化第1天；B：誘導(dǎo)分化第7天。

進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光染色，可見一部分細(xì)胞表達(dá)GFAP蛋白，一部分細(xì)胞表達(dá)NSE蛋白，提示大部分為膠質(zhì)細(xì)胞，尤以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主，神經(jīng)元較少，散在分布，細(xì)胞突起相互間交織成網(wǎng)狀(圖4)。由此可見，所分離的細(xì)胞能夠表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin蛋白，能夠形成干細(xì)胞球，還能夠誘導(dǎo)分化為膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，具備多分化潛能。因此，我們分離得到的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。

圖4神經(jīng)干細(xì)胞免疫熒光染色的結(jié)果

Fig.4 Immunofluorescence staining of neural stem cells (×40)

A：干細(xì)胞球的Nestin染色；B：誘導(dǎo)分化后GFAP染色；C：誘導(dǎo)分化后NSE染色。

正常對(duì)照組、假手術(shù)組和米貝地爾組獲得的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)5～7 d后，培養(yǎng)瓶中干細(xì)胞克隆球數(shù)目明顯少于手術(shù)組，且克隆球直徑小，外觀不規(guī)則(圖5)。

圖5原代培養(yǎng)第6天各組中神經(jīng)干細(xì)胞球數(shù)量及形態(tài)

Fig.5 The number and morphology of neural stem cell spheres in different groups in primary culture at day 6 (×40)

A：正常對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：手術(shù)組；D：米貝地爾組。

2.2米貝地爾對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞球增殖的抑制作用按照1.4方法干預(yù)后第4天觀察各組神經(jīng)干細(xì)胞球的形成情況?？瞻讓?duì)照組未加米貝地爾，細(xì)胞增殖快，鏡下見大量細(xì)胞球，細(xì)胞球形態(tài)規(guī)則，邊緣光滑，中心膨隆有立體感，未見皺縮細(xì)胞及細(xì)胞碎片。隨著藥物濃度增大，鏡下細(xì)胞球數(shù)量逐漸減少，直徑也隨之減小，形態(tài)尚規(guī)則，并可見越來越多的皺縮細(xì)胞。至10 μmol/L組，鏡下僅見數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成的小細(xì)胞球，且細(xì)胞球數(shù)目極少，周圍有大量細(xì)胞碎片。20 μmol/L組，鏡下未見正常形態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)球，視野中全部為死亡細(xì)胞皺縮形成的細(xì)胞碎片(圖6)。

2.3MTT檢測(cè)結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)表明，1.25 μmol/L組及2.5 μmol/L組A值較對(duì)照組稍降低，但細(xì)胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5、10、20 μmol/L組與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著濃度增加(≥5 μmol/L)，米貝地爾對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖抑制作用越明顯(圖7)。計(jì)算得IC50出現(xiàn)在8.93 μmol/L。

圖6加入米貝地爾后各組神經(jīng)干細(xì)胞球數(shù)量及形態(tài)

Fig.6 The number and morphology of neural stem cell spheres in each group after adding different concentrations of mibefradil (×40)

A：對(duì)照組；B：米貝地爾1.25 μmol/L組；C：米貝地爾2.5 μmol/L組；D：米貝地爾5 μmol/L組；E：米貝地爾10 μmol/L組；F：米貝地爾20 μmol/L組。

2.4Cav3.2蛋白的表達(dá)手術(shù)組中室下區(qū)組織中Cav3.2蛋白的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組；米貝地爾腹腔注射后，室下區(qū)組織中Cav3.2蛋白較手術(shù)組明顯降低(圖8)。

2.5Cyclin A、Cav3.2和caspase-3蛋白的表達(dá)綜合考慮IC50值、實(shí)驗(yàn)可操作性等因素后，并根據(jù)MTT檢測(cè)中加入的米貝地爾濃度，將加入神經(jīng)干細(xì)胞中的米貝地爾濃度定為距離IC50值最接近的整數(shù)值，即10 μmol/L。加入米貝地爾48 h后，Cav3.2蛋白和Cyclin A蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，caspase-3蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(圖9)。

3討論

顱腦外傷是常見的神經(jīng)外科疾病，發(fā)病突然，病情重，常常造成長期昏迷、癱瘓、認(rèn)知障礙、語言功能障礙等后遺癥，給家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)。神經(jīng)干細(xì)胞能在不同微環(huán)境中分化為不同的神經(jīng)細(xì)胞，可修復(fù)不同的神經(jīng)功能障礙，在顱腦外傷的治療中有光明前景[4]。目前分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的技術(shù)日趨成熟，但是，外源性神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用也存在著缺陷：定向誘導(dǎo)分化機(jī)制尚沒有完全明確，微環(huán)境的調(diào)控技術(shù)復(fù)雜，無法完全達(dá)到按人的意志進(jìn)行分化；神經(jīng)干細(xì)胞存在成瘤性[5]。因此，應(yīng)用內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，利用腦組織中天然的微環(huán)境調(diào)控其分化具備一定的優(yōu)勢(shì)。但是，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量稀少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足損傷修復(fù)的需要[6]。本課題組的前期研究證明，顱腦損傷后可誘導(dǎo)室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞形成，其增殖能力明顯增加[7]，但是機(jī)制尚不清楚。

圖7加入米貝地爾后各組細(xì)胞增殖抑制率(MTT法)

Fig.7 Proliferation inhibition rate in each group after adding different concentrations of mibefradil (MTT method)

與對(duì)照組比較，1.25 μmol/L組P=0.06，2.5 μmol/L組P=0.07，5 μmol/L組P=0.001，10 μmol/L組P=0.000，20 μmol/L組P=0.000。

圖8各組室下區(qū)組織Cav3.2蛋白的表達(dá)(Western blot)

Fig.8 The expression of Cav 3.2 protein in subventricular zone in each group (Western blot)

A：正常對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：手術(shù)組；D：米貝地爾組。

圖9Cav3.2、Cyclin A和caspase-3蛋白的表達(dá)(Western blot)

Fig.9 Expressions of Cav3.2, Cyclin A and caspase-3 protein (Western blot)

T型鈣離子通道又名低電壓激活鈣通道，與高電壓激活鈣通道相比，具有易激活、失活緩慢、需要的電壓閾值較低等特點(diǎn)[8]。T型鈣通道家族包括3種T型鈣通道亞型：Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3廣泛表達(dá)于腦組織中，主要位于下橄欖核、丘腦、海馬、下丘腦、室旁核、腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、小腦深部核團(tuán)、蒼白球以及丘腦底核等[9]。研究表明，Cav3.1蛋白主要位于神經(jīng)元胞體和樹突近端，Cav3.2蛋白主要位于神經(jīng)元胞體和樹突近端至中間部分，Cav3.3蛋白主要表達(dá)于特定類型細(xì)胞的胞體及樹突[10]。T型鈣離子通道主要存在于細(xì)胞的G1～S期，對(duì)細(xì)胞增殖有十分重要的作用[11-12]。外傷能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)T型鈣離子通道的表達(dá)[2]。有學(xué)者認(rèn)為，T型鈣離子通道蛋白也表達(dá)于胚胎干細(xì)胞中，維持干細(xì)胞的多分化潛能[13]。本研究表明，顱腦外傷后，腦組織中T型鈣離子通道的表達(dá)明顯上調(diào)，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力明顯上調(diào)。米貝地爾是選擇性T型鈣離子通道阻滯劑，能夠抑制Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3蛋白表達(dá)[14-15]。應(yīng)用米貝地爾腹腔注射可抑制腦內(nèi)T型鈣離子通道的表達(dá)，腦組織內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力明顯降低。體外實(shí)驗(yàn)也表明米貝地爾可抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。因此，顱腦外傷激活T型鈣離子通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞有重要的誘導(dǎo)作用。Cyclin A的合成發(fā)生于G1期向S期的轉(zhuǎn)變過程中，在中期時(shí)消失，屬S期周期蛋白[16]。米貝地爾能夠明顯抑制Cyclin A蛋白的表達(dá)，上調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)，說明其可通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，尤其抑制是G0/G1期向S期進(jìn)展，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，但是具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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(編輯國榮)

收稿日期：2015-09-19修回日期：2015-11-29

基金項(xiàng)目：陜西省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目資助(No.2014K11-01-01-12)

通訊作者：尉春艷. E-mail: weichy1023@163.com.

中圖分類號(hào)：R651

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604004

T type calciumchannel activated by brain injury induces neural stem cell proliferation

ZHANG Xi1, LOU Miao2, ZHOU Le1, WEI Chun-yan3

(1. Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710004; 2. Department of Neurosurgery, Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University, Xi’an 710004; 3. Department of Obstetrics and Gynecology,the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the mechanism and induction of T type calcium channel on neural stem cells after brain injury. MethodsAdult mice brain injury model was established and divided into control, sham operation, surgery, and surgery+mebefradil groups. Neural stem cells were separated from the subventricular zone (SVZ) and identified. Moreover, we analyzed the results using MTT and neural stem cell sphere counting after adding different doses of mibefradil in culture medium, respectively. Then we calculated the half maximal inhibitory concentration (IC50) of mibefradil on neural stem cells. Finally, we analyzed the expression of Cav3.2 in SVZ and the protein expressions of Cav3.2, Cyclin A and caspase-3 in neural stem cells by Western blot. ResultsIn vivo, neural stem cell proliferation was increased in surgery group compared with that in control and sham-operation groups. The proliferation of neural stem cells in surgery+mibefradil groups was significantly decreased compared with that in surgery group after mibefradil-induced inhibition of T type calcium channel protein. In vitro, the formation of neural stem cell sphere was significantly inhibited after adding mibefradil. The cell growth ratio was significantly decreased when the concentration of mibefradil was above 5 μmol/L. A values in 5 μmol/L, 10 μmol/L and 20 μmol/L groups were significantly lower than those in control group (P<0.05). IC50 was 8.93 μmol/L. The protein expressions of Cyclin A and Cav3.2 were inhibited while that of caspase-3 was increased after mibefradil treatment. ConclusionNeural stem cell proliferation was enhanced by activating T type calcium channel after brain injury.

Supported by Shaanxi Social Development Project (No.2014K11-01-01-12)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.0917.008.html(2016-06-08)