高壓氧治療對急性腦外傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)及CREB表達(dá)的影響*

修光輝李秀玲朱義超劉萍凌斌孫潔

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高壓氧治療對急性腦外傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)及CREB表達(dá)的影響*

修光輝①李秀玲②朱義超①劉萍①凌斌①孫潔①

【摘要】目的：探討高壓氧治療對急性腦外傷大鼠神經(jīng)功能修復(fù)及cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（cAMP response element blinding protein，CREB）信號分子表達(dá)的影響。方法：選取成年SD大鼠24只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，即假手術(shù)組、腦外傷組及高壓氧治療組，每組8只。假手術(shù)組行開顱手術(shù)不致腦外傷，腦外傷組采用自由落體打擊法制作中度腦外傷模型（以50 g重的鐵質(zhì)圓柱體自30 cm高處沿鐵桿自由落體撞擊暴露的大腦右側(cè)運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)），高壓氧治療組在腦外傷模型上行高壓氧治療（1次/d，連續(xù)治療10 d）。各組傷后第10天對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損（Neurological Severity Scores，NSS）評分，然后處死大鼠，獲取大腦右側(cè)運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法測定CREB mRNA的表達(dá)。結(jié)果：大鼠中度腦外傷后出現(xiàn)不同程度的抽搐，癱瘓和平衡功能缺失。NSS評分結(jié)果顯示：腦外傷組NSS評分（4.50±0.40）分，與假手術(shù)組的（0.30±0.10）分比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），高壓氧治療組NSS評分（3.10±0.35）分與腦外傷組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，RT-PCR結(jié)果顯示：腦外傷組CREB mRNA表達(dá)為（0.81±0.02），與假手術(shù)組的（0.62±0.01）比較明顯升高，而高壓氧治療組（0.72±0.02）較腦外傷組CREB mRNA明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：高壓氧治療能明顯改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)，其作用機(jī)制可能與抑制CREB信號分子的表達(dá)有關(guān)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

【關(guān)鍵詞】高壓氧治療； 腦外傷； cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）； NSS評分； 大鼠

①昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 云南 昆明 650021

②云南省第一人民醫(yī)院

First-author’s address：The No.4 Hospital Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650021，China

顱腦外傷（traumatic brain injury，TBI）是指暴力直接或間接作用于頭部造成的顱腦外傷或顱內(nèi)血腫，臨床上死亡率及致殘率高，預(yù)防和減少繼發(fā)性腦損傷是促進(jìn)患者存活，改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。腦外傷臨床治療手段有限，高壓氧治療（hyperbaric oxygen treatment，HBOT）是臨床上一種有效的能促進(jìn)TBI修復(fù)的非創(chuàng)傷性康復(fù)療法。本研究探討了HBOT對急性顱腦外傷大鼠神經(jīng)功能修復(fù)的影響及其對信號分子cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（cAMP response element blinding protein，CREB）基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，為HBO治療顱腦外傷的臨床應(yīng)用提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 清潔級雄性SD大鼠24只，體重（220±20）g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、腦外傷組及高壓氧治療組，每組8只。假手術(shù)組，只切開頭皮和鑿開顱骨；腦外傷組，切開頭皮和鑿開顱骨后，用重物自由落體沖擊腦組織造成中度腦挫傷；高壓氧治療組，腦中度撞擊傷并給予高壓氧治療一療程。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 參照Feeney等［1］文獻(xiàn)介紹的方法制備大鼠中度顱腦損傷模型：用1%水合氯醛（1 mL/100 g）行腹腔注射麻醉，俯臥位固定大鼠。常規(guī)消毒鋪巾，在頭部距前囟5 mm處冠狀切開皮膚成“U”型切口，將頭皮向尾側(cè)翻開。分離骨膜，暴露右側(cè)頂骨，于矢狀縫旁2.5 mm，冠狀縫后1.5 mm鉆一骨孔，咬除顱骨至骨窗直徑為5.0 mm×5.0 mm，顯露硬腦膜，以50 g重的鐵質(zhì)圓柱體自30 cm高處沿鐵桿自由落體撞擊墊片，造成右側(cè)大腦運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)挫裂傷。然后縫合皮膚，常規(guī)喂養(yǎng)，并給予抗生素治療。

1.2.2 高壓氧治療 高壓氧治療組在腦外傷后1 h即行高壓氧治療，治療10 d，1次/d。加壓艙為上海七〇五所生產(chǎn)的SHC900Ⅱ型單人透明氧氣加壓艙。大鼠進(jìn)艙后直接加壓供氧。先升壓15～20 min，然后穩(wěn)壓25～30 min，最后減壓20 min。吸氧濃度91%～99%，治療期間壓力維持在0.18 MPa。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損（neurological severity scores，NSS）評分 于高壓氧治療一療程后（即傷后第10天）采用雙盲法，參照Chen等［2］報(bào)道的NSS評分表，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。得分越高，則大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.2.4 樣本獲取 高壓氧治療一療程后，完成NSS評分，將大鼠處死，獲取右側(cè)大腦運(yùn)動皮質(zhì)，進(jìn)行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測。

1.2.5 逆 轉(zhuǎn) 錄 聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RTPCR） 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因CREB和內(nèi)參β-actin的引物序列，并送生物公司（Invitrogen，USA）合成。以下為目的基因的引物序列、退火溫度、產(chǎn)物長度。CREB，上游引物5’-CAGATTGCCACATTAGCCC-3’，下游引物5’-TTCCCTGTTCTTCATTAGACG-3’， 退 火溫度49.5 ℃，產(chǎn)物長度792 bp；β-actin，上游引物5’-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下游引物5’-GTGAGCACTGAAGCGAAAGC-3’，退火溫度52.5 ℃，產(chǎn)物長度227 bp。使用Trizol試劑盒（Invitrogen，USA）提取三組樣品的總RNA，用分光光度計(jì)測量樣本純度和濃度；逆轉(zhuǎn)錄cDNA的制備，按照PCR Master Mix Kit（Thermo，USA）說明書操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，各因子退火溫度退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，分別計(jì)算CREB的PCR產(chǎn)物與β-actin的PCR產(chǎn)物間光密度比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠NSS評分結(jié)果比較 大鼠急性腦外傷后，大部分動物損傷當(dāng)天即發(fā)生抽搐，隨后出現(xiàn)癱瘓不能正常行走，四肢與軀干失去平衡功能，容易在平衡木上跌落。術(shù)后第10天NSS評分結(jié)果顯示：與假手術(shù)組得分（0.30±0.10）分比較，腦外傷組NSS評分（4.50±0.40）分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而高壓氧治療組NSS評分（3.10±0.35）分，較腦外傷組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。NSS評分結(jié)果說明腦外傷后大鼠神經(jīng)功能明顯受損，而高壓氧治療促進(jìn)了腦神經(jīng)功能修復(fù)，提高了大鼠神經(jīng)行為學(xué)功能。

圖1 各組大鼠NSS評分結(jié)果比較

2.2 各組大鼠CREB mRNA的表達(dá)變化 RT-PCR結(jié)果顯示：三組大鼠大腦皮層樣本中均能檢測到信號分子CREB mRNA的表達(dá)。結(jié)合β-actin內(nèi)參，對三組CREB mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行光密度值檢測，結(jié)果顯示：腦外傷組CREB mRNA為（0.81±0.02），與假手術(shù)組的（0.62±0.01）比較，表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；高壓氧治療組CREB mRNA為（0.72±0.02），與腦外傷組比較，表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。RT-PCR結(jié)果表明急性腦外傷后，損傷的運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)CREB mRNA的表達(dá)明顯升高，而高壓氧治療抑制了皮質(zhì)區(qū)CREB基因的表達(dá)，說明高壓氧治療改善大鼠神經(jīng)功能可能與抑制損傷皮質(zhì)區(qū)CREB信號分子的表達(dá)有關(guān)。具體見圖2。

圖2 各組大鼠的CREB mRNA表達(dá)變化比較

3 討論

顱腦外傷（TBI）是臨床上常見的神經(jīng)外科急危重癥，其致死率及致殘率高，臨床治療方法少，療效差。TBI一旦發(fā)生，常常導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死，神經(jīng)突起斷裂，細(xì)胞凋亡等原發(fā)及繼發(fā)性損傷，最終致殘，影響生活質(zhì)量。高壓氧治療能通過減輕顱腦外傷缺氧后宿主腦水腫，減少內(nèi)源性神經(jīng)元變性、凋亡與壞死，提高生長因子的生物活性等來發(fā)揮治療作用［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠急性腦外傷后，大部分動物損傷當(dāng)天即發(fā)生抽搐，隨后出現(xiàn)癱瘓不能正常行走，四肢與軀干失去平衡功能，容易在平衡木上跌落，NSS評分表現(xiàn)是TBI組較假手術(shù)組明顯升高，而高壓氧治療10 d后NSS評分明顯降低，說明高壓氧治療能明顯改善腦外傷大鼠神經(jīng)功能，提高大鼠神經(jīng)行為學(xué)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了高壓氧對TBI的具有明顯治療效果［4］。關(guān)于其作用機(jī)制可能為：（1）改善腦血流及腦細(xì)胞供氧。腦損傷后，神經(jīng)組織缺血缺氧，腦細(xì)胞功能得不到足夠的能量保障，腦細(xì)胞將發(fā)生一系列繼發(fā)性損傷。高壓氧治療通過改善腦血流及增加血液中物理溶解的氧，改善氧供、促進(jìn)組織氧代謝，減少氧自由基的產(chǎn)生，從而促進(jìn)腦細(xì)胞的修復(fù)［5-6］。（2）降低顱內(nèi)壓，減輕腦水腫。腦水腫在腦外傷病理生理改變中具有普遍性。腦水腫的發(fā)生是由于血腦屏障的破壞，腦微循環(huán)障礙，腦細(xì)胞代謝障礙及自由基損傷。顱腦損傷亦可因腦出血形成顱內(nèi)血腫，組織滲出明顯，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高。高壓氧治療可以通過提高血氧分壓，收縮血管，減少腦血流量，從而減輕腦水腫，使顱內(nèi)壓下降，促進(jìn)腦細(xì)胞修復(fù)［7］。（3）通過軸索發(fā)生新的側(cè)枝，建立新的突觸聯(lián)系，使神經(jīng)功能得到恢復(fù)；（4）神經(jīng)保護(hù)作用。高壓氧治療可以通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗炎因子（如IL-10等）、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活及促炎因子的產(chǎn)生（如TNF-ɑ等）等方式，阻礙炎癥瀑布的發(fā)生及細(xì)胞凋亡等，促進(jìn)受損的神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［3，8-10］。

高壓氧在腦外傷治療中的研究和應(yīng)用取得了很大的成績，但高壓氧治療顱腦外傷的分子信號機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)調(diào)查了高壓氧治療腦外傷大鼠損傷運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）信號分子的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦外傷后損傷運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)CREB mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，而高壓氧治療下調(diào)了運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)CREB的表達(dá)。CREB是轉(zhuǎn)錄因子bZIP蛋白家族中CREB/ATF亞家族的一員，能夠選擇特異性結(jié)合cAMP反應(yīng)元件（CRE），發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。CREB由341個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為43 KD，其分子結(jié)構(gòu)分兩個(gè)區(qū)域，N-端區(qū)域和C-端區(qū)域，N-端區(qū)域主要與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能有關(guān)，C-端區(qū)域主要是與啟動子結(jié)合的部位。CREB分子是多種蛋白激酶作用的底物，其轉(zhuǎn)錄活性受多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，主要是cAMP通道、鈣離子通道的調(diào)節(jié)、蛋白激酶A、Ras/MAPK以及RSKp90等［11］。研究表明：在腦外傷中，活化（磷酸化）的CREB可直接或間接激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而表達(dá)某些蛋白分子（如c-Fos、Jun-B、bcl-2等）和神經(jīng)營養(yǎng)因子來發(fā)揮作用［12］。最新研究發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中，缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是由于CREB信號的激活所致［13］。此外也有文獻(xiàn)報(bào)道，持續(xù)的CREB的激活在腦外傷中介導(dǎo)了神經(jīng)元的凋亡，抑制了神經(jīng)組織的修復(fù)［14］。大量研究認(rèn)為，CREB信號是神經(jīng)炎癥反應(yīng)中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活的重要通路，可誘發(fā)炎癥因子的大量釋放引起的炎癥瀑布式反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡［15］，而研究表明高壓氧治療可以抑制腦外傷后的神經(jīng)炎癥風(fēng)暴及小膠質(zhì)細(xì)胞激活所致的受損細(xì)胞的凋亡［9-10］。因此，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TBI術(shù)后CREB表達(dá)明顯上調(diào)，可能由于損傷缺氧導(dǎo)致CREB的激活促進(jìn)損傷皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的凋亡，而高壓氧治療明顯下調(diào)了CREB信號分子的表達(dá)，并且在神經(jīng)行為學(xué)上得到明顯的改善，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，高壓氧治療可能是通過抑制CREB信號的激活，減少了膠質(zhì)細(xì)胞及炎癥因子的產(chǎn)生，阻礙了炎癥瀑布式反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，最終減少細(xì)胞凋亡，改善了神經(jīng)功能，提高了TBI術(shù)后大鼠的神經(jīng)行為學(xué)。

本研究為高壓氧治療腦外傷提供了重要的行為學(xué)和分子學(xué)證據(jù)。結(jié)果提示高壓氧不僅是腦外傷治療的有效方法，而且提示CREB的過表達(dá)可能是促進(jìn)腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。高壓氧治療改善腦外傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)可能與抑制CREB信號的表達(dá)有關(guān)。研究結(jié)果為臨床應(yīng)用高壓氧治療腦外傷提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Hyperbaric Oxygen Treatment on Improving Neural Behavior and Regulating the CREB Expression in Acute Traumatic Brain Injury Rats

XIU Guang-hui，LI Xiu-ling，ZHU Yi-chao，et al.// Medical Innovation of China，2016，13（12）：005-009

【Abstract】Objective：To investigate the effects of hyperbaric oxygen treatment（HBOT） on neural behavior improvement in acute traumatic brain injury（TBI） rats associated to the expression of cAMP response element blinding protein （CREB） signaling molecule.Method：Twenty-four adult Sprague-Dawley rats were divided into three groups according to the random number table：sham-operated group，TBI group and HBOT group，eight rats in each group.The sham-operated group was subjected to skull open only but not brain injury；TBI rats were subjected to TBI procedure according to the weight-dropping method（the 50 g weight-drop device was employed and falled from 30 cm height to hit the exposed motor cortex on the right side of the brain）；the HBOT group was performed for HBO treatment for 10 days （one time per day）after TBI.The Neurological severity score （NSS） records were evaluated to determine the improvement of neural behavior among all groups after 10 days post injury.Then all rats were sacrificed and the motor cortex were obtained for the following reverse transcriptionpolymerase chain reaction（RT-PCR） to determine the expression of CREB.Result： TBI procedure resulted in a several neurological functional deficit symptoms in TBI rats.The NSS records in the TBI group was （4.50±0.40），which was significantly increased at the tenth day comparing to （0.30±0.10） of the sham-operated group，while （3.10±0.35） of the HBOT group showed a significant decrease comparing to the TBI group（P＜0.01），the differences were statistically significant （P＜0.05）.Corresponding to these changes was the expression of CREBmRNA，（0.81±0.02） of the TBI group showed significantly up-regulated compared with （0.62±0.01） of the sham-operated rats，while （0.72±0.02） of the HBOT group was significantly down-regulated compared with TBI rats，the differences were statistically significant（P＜0.01）.Conclusion：The HBO treatment may ameliorate the neurological behavior of rats after experimental traumatic brain injury by inhibiting the expression of CREB signaling molecule，which results in the apoptosis of nerve cells.

【Key words】Hyperbaric oxygen treatment； Traumatic brain injury； cAMP response element blinding protein（CREB）； NSS records； Rats

*基金項(xiàng)目：云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金（2015FB079）；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金（2013FB185）

通信作者：孫潔

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.12.002

收稿日期：（2015-12-15） （本文編輯：劉蕾）