T2DM小型豬模型骨骼肌、肝臟及胰腺組織蛋白激酶B表達(dá)及磷酸化的變化

于健，鄒迪莎，葉瑤，周素嫻，鄭天鵬，楊帆

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T2DM小型豬模型骨骼肌、肝臟及胰腺組織蛋白激酶B表達(dá)及磷酸化的變化

于健1，鄒迪莎2，葉瑤2，周素嫻1，鄭天鵬1，楊帆1

目的研究高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）構(gòu)建巴馬小型豬2型糖尿?。═2DM）模型的可行性，并觀察小型豬模型骨骼肌、肝臟及胰腺組織蛋白激酶B（PKB）表達(dá)及磷酸化變化。方法將健康雄性巴馬小型豬10只隨機(jī)分為2組：對(duì)照組5只，喂養(yǎng)普通飼料；糖尿病模型組5只，高脂高糖飲食聯(lián)合STZ構(gòu)建巴馬小型豬T2DM模型。檢測(cè)2組小型豬空腹血糖、空腹胰島素水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。采用Western blot法檢測(cè)骨骼肌、肝臟及胰腺組織中PKB蛋白表達(dá)及磷酸化水平。結(jié)果（1）高脂高糖飼料喂養(yǎng)10個(gè)月后，與對(duì)照組比較，模型組體質(zhì)量、空腹血糖、空腹胰島素水平及HOMA-IR明顯升高（P＜0.01）。（2）與對(duì)照組相比，模型組STZ給藥后空腹血糖水平進(jìn)一步升高，空腹胰島素水平明顯下降（P＜0.01）。（3）與對(duì)照組比較，模型組骨骼肌、肝臟及胰腺組織中PKB蛋白表達(dá)及磷酸化水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論高脂高糖飲食聯(lián)合STZ多次腹腔注射可以成功構(gòu)建T2DM小型豬模型，模型組小型豬骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB蛋白表達(dá)及磷酸化水平明顯降低。

糖尿病，2型；蛋白激酶類；豬，雛型；肌，骨骼；肝；胰腺；巴馬小型豬

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人們膳食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，糖尿病（diabetes，DM）發(fā)病率明顯上升，糖尿病已成為全球范圍內(nèi)致死、致殘和醫(yī)療費(fèi)用增加的重要因素。目前2型糖尿?。═2DM）的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，其中胰島素抵抗（insulin resistance，IR）在T2DM的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）能夠選擇性地破壞某些種屬動(dòng)物胰島的β細(xì)胞，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。在考慮膳食在糖尿病發(fā)病進(jìn)程的因素中，膳食誘導(dǎo)聯(lián)合小劑量STZ的糖尿病造模技術(shù)已被廣泛應(yīng)用［1］，但這種方法主要應(yīng)用于嚙齒類動(dòng)物模型的復(fù)制，而大型動(dòng)物模型如豬動(dòng)物模型復(fù)制的報(bào)道較少。小型豬不僅許多器官系統(tǒng)與人類相似，而且價(jià)格也相對(duì)適中，是誘發(fā)糖尿病模型的理想動(dòng)物［2］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）是胰島素作用主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一——磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）途徑下游重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，PKB能通過影響胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取、糖原合成、糖酵解等胰島素代謝反應(yīng)。因此，本研究應(yīng)用高脂高糖飲食聯(lián)合STZ構(gòu)建巴馬小型豬T2DM模型，探討該模型特征及骨骼肌、肝臟、胰腺組織PKB和磷酸化（P）-PKB蛋白的表達(dá)情況，以期為糖尿病研究提供穩(wěn)定的動(dòng)物模型。

1材料與方法

1.1主要試劑PKB及P-PKB一抗（CST公司），胰島素放射免疫分析試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所），STZ（美國Sigma公司）。

1.2 T2DM小型豬模型的構(gòu)建參照筆者以往的T2DM小型豬模型造模方法［3］：選擇巴馬小型豬10頭（均為雄性），體質(zhì)量10～20 kg，2～3月齡，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將小型豬按簡單隨機(jī)化方法分為2組（每組5頭），模型組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)（高脂高糖飼料配方為蔗糖37%、豬油10%、膽固醇2%、普通飼料51%）；對(duì)照組喂養(yǎng)普通飼料。2組動(dòng)物喂養(yǎng)10個(gè)月，11個(gè)月初禁食空腹給予模型組動(dòng)物腹腔注射STZ 100 mg/kg，1周后，重復(fù)上述劑量1次。對(duì)照組動(dòng)物腹腔注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。各組繼續(xù)維持原有飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)周期共12個(gè)月。成模標(biāo)準(zhǔn)：參照1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

Fig.1 Comparisons of PKB and P-PKB protein expression in skeletal muscle，liver and pancreatic tissues between two groups圖1　2組骨骼肌、肝臟及胰腺PKB及P-PKB蛋白表達(dá)比較

1.3空腹血糖、胰島素水平檢測(cè)小型豬禁食采血檢測(cè)空腹血糖及空腹胰島素水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。

1.4骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB及P-PKB蛋白表達(dá)檢測(cè)小型豬禁食麻醉，股動(dòng)脈放血處死，取胰腺、肝臟和骨骼肌組織，置于-70℃冰箱保存，參照文獻(xiàn)［4］采用Western blot檢測(cè)骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB蛋白表達(dá)及磷酸化水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 2組動(dòng)物一般情況模型組均成模，成模小型豬毛發(fā)粗糙、無光澤，精神萎靡，并出現(xiàn)多尿、多飲、多食及體質(zhì)量下降等糖尿病癥狀。高脂高糖飼料喂養(yǎng)10個(gè)月后，模型組的體質(zhì)量（86.32±5.86）kg較對(duì)照組（41.54±4.54）kg明顯升高（t=15.672，P＜0.01）。對(duì)照組小型豬精神狀況良好，毛發(fā)光澤，生長良好。

2.2高脂高糖喂養(yǎng)10個(gè)月后2組空腹血糖、空腹胰島素及HOMA-IR比較模型組空腹血糖（6.46± 0.31）mmol/L、空腹胰島素（15.67±1.46）mIU/L及HOMA-IR 4.51±0.53較對(duì)照組（4.66±0.45）mmol/L、（8.12±0.32）mIU/L及1.69±0.22均明顯升高（t分別為7.461、11.328和10.928，均P＜0.01）。

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)2組空腹血糖、空腹胰島素水平比較模型組動(dòng)物空腹血糖水平（11.46±1.64）mmol/L較對(duì)照組（4.64±0.47）mmol/L明顯升高（t=8.938，P＜0.01），模型組動(dòng)物空腹胰島素水平（6.57±0.33）mIU/L較對(duì)照組（8.11±0.28）mIU/L明顯降低（t=8.142，P＜0.01）。

2.4 2組骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB蛋白表達(dá)及磷酸化水平比較與對(duì)照組比較，模型組骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB蛋白表達(dá)及磷酸化水平明顯降低（P＜0.05），見圖1。

3　討論

豬在解剖結(jié)構(gòu)、血生化指標(biāo)、肥胖傾向性等方面與人類高度相似，其中小型豬動(dòng)物模型已廣泛運(yùn)用于糖尿病、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及外科等領(lǐng)域的研究［5-7］。適于醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的有巴馬小型豬、西雙版納小型豬、五指山微型豬等。巴馬小型豬源產(chǎn)于廣西巴馬瑤族自治縣，是具有悠久的飼養(yǎng)歷史和穩(wěn)定的遺傳基因的地方小型豬品種。小型豬除了血生化指標(biāo)與人類高度相似外，其糖脂質(zhì)代謝也近似于人類；此外小型豬容易飼養(yǎng)、抗病能力強(qiáng)、易于實(shí)驗(yàn)操作等。因此，小型豬在糖尿病研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

IR是T2DM的主要發(fā)病機(jī)制，IR是指胰島素執(zhí)行其正常生物作用的效應(yīng)不足，表現(xiàn)為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對(duì)葡萄糖的利用障礙。胰島素通過與其受體結(jié)合可在不同組織細(xì)胞內(nèi)激活不同的信號(hào)途徑而產(chǎn)生不同的作用，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在胰島素生理作用的發(fā)揮中起著至關(guān)重要的作用，因而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常均可導(dǎo)致IR。胰島素受體信號(hào)主要包括PI3K/PKB/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和有絲分裂原信號(hào)（MAPK）兩條途徑。其中PKB在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，PKB表達(dá)水平和活性的改變與IR及糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在IR狀態(tài)下，胰島素刺激的肝細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的PKB絲氨酸磷酸化及PKB活性受到抑制，進(jìn)一步削弱了胰島素的作用。另外，PKB的磷酸化還可以減少胰島β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)β細(xì)胞修復(fù)，改善β細(xì)胞分泌功能［8］。

本研究先采用高脂高糖飲食喂養(yǎng)巴馬小型豬，模型組動(dòng)物出現(xiàn)明顯肥胖、高胰島素血癥及IR，并采用多次小劑量注射STZ部分破壞胰島β細(xì)胞，接近人類T2DM發(fā)病特點(diǎn)，而且大大降低了STZ的不良反應(yīng)，與文獻(xiàn)報(bào)道相似［9］。另外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)T2DM模型組骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB蛋白表達(dá)及磷酸化水平明顯低于對(duì)照組，提示模型組出現(xiàn)IR的傾向，與其他研究相一致［4］。

本研究顯示采用高脂高糖飲食聯(lián)合STZ多次腹腔注射的方法構(gòu)建T2DM小型豬模型，操作簡便、易于掌握，且具有較好的安全性，為糖尿病研究提供了良好的研究工具。

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（2015-10-12收稿2015-12-30修回）

（本文編輯魏杰）

Changes of protein kinase B and phosphorylation expression in the skeletal muscle，liver and pancreas of miniature pig model with type 2 diabetes mellitus model

YU Jian1，ZOU Disha2，YE Yao2，ZHOU Suxian1，ZHENG Tianpeng1，YANG Fan1
1 Department of Endocrinology，the Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guangxi 541001，China；2 Graduate School of Guilin Medical College

Objective To study the feasibility of Bama miniature pig model establishment of type 2 diabetes mellitus （T2DM）by high-fat and high-sugar diet combined with streptozotocin（STZ），and observe the changes in protein kinase B （PKB）and phosphorylation expressions in skeletal muscle，liver，and pancreatic tissues of the miniature pig model. Methods A total of 10 healthy male Bama miniature pigs were randomly divided into two groups：control group（n=5，fed normal diet）and diabetic model group（n=5，fed high-fat and high-sugar diet combined with STZ to establish T2DM Bama miniature pig model）. The fasting plasma glucose（FPG）and fasting insulin（FINS）levels were measured，and insulin resistance（HOMA-IR）was calculated in two groups. The PKB and phosphorylation expressions in skeletal muscle，liver and pancreatic tissues were measured using Western blot assay. Results（1）After 10 months of high-fat and high-sugar diet，the body weight，F(xiàn)PG，F(xiàn)INS and HOMA-IR were significantly higher in model group than those of control group（P＜0.01）. （2）After STZtreatment，compared with control group，there was afurther increased level of FPG and asignificantly decreased level of FINS in model group（P＜0.01）.（3）Compared with control group，the PKB and phosphorylation expression levels in skeletal muscle，liver and pancreas were significantly lower in model group（P＜0.05）. Conclusion The high-fat and highsugar diet combined with STZ can successfully establish the T2DM miniature pig model. The PKB and phosphorylation expression levels in skeletal muscle，liver，and pancreatic tissues are decreased in model pigs.

diabetes mellitus，type 2；protein kinases；swine，miniature；muscle，skeletal；liver；pancreas；Bama miniature pig

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目課題（桂科攻1347003-5）；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目課題（20150126-1-1）；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科研課題（Z2014301）

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（郵編541001）；2桂林醫(yī)學(xué)院研究生院

于?。?965），女，教授，碩士，主要從事糖尿病慢性并發(fā)癥基礎(chǔ)與臨床研究

R587.1

A

10.11958/20150202