12種microRNA在卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義

滕長財，鄭紅

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12種microRNA在卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義

滕長財，鄭紅

目的利用公共數(shù)據(jù)庫分析卵巢癌組織中12種microRNA（miR）的表達(dá)及其臨床意義。方法篩選在GSE14407數(shù)據(jù)集和TCGA數(shù)據(jù)庫中均具有表達(dá)信息的microRNA，得到miR-10B、miR-1244、miR-622、miR-21、miR-503、Let-7D、miR-155、miR-30C、miR-17、miR-101-1、miR-186以及miR-770共12種microRNA，在這12種microRNA中尋找在卵巢癌（卵巢癌組）和癌旁組織（癌旁組）中表達(dá)有差異的基因。利用在TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選得到的505例卵巢癌患者數(shù)據(jù)，年齡按照中位數(shù)分為高年齡（ 59歲）組和低年齡（＜59歲）組；臨床分期分為早期組（Ⅰ期+Ⅱ期）、晚期組（Ⅲ期+Ⅳ期）及未知；腫瘤分級分為低級別（G1+G2）組和高級別（G3+G4）組；病發(fā)位置分為單側(cè)組、雙側(cè)組；腫瘤殘余分為＜10 mm組、 10 mm組；microRNA按照表達(dá)量的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，進(jìn)行Kaplan-Meier單因素生存分析和多因素Cox回歸分析。結(jié)果癌旁組Let-7D和miR-101-1表達(dá)水平高于卵巢癌組，而miR-155和miR-770表達(dá)水平低于卵巢癌組（均P＜0.05）。生存分析顯示，年齡 59歲、臨床分期（Ⅲ+Ⅳ）期和Let-7D低表達(dá)的患者生存情況較差（P＜0.05）。Let-7D低表達(dá)是卵巢癌患者生存的獨立危險因素。結(jié)論Let-7D的表達(dá)與卵巢癌預(yù)后相關(guān)，可能是卵巢癌預(yù)后的獨立影響指標(biāo)。

卵巢腫瘤；因素分析，統(tǒng)計學(xué)；微RNAs；預(yù)后；GEO數(shù)據(jù)庫；TCGA數(shù)據(jù)庫；Let-7D

卵巢癌復(fù)發(fā)率高且5年生存率低，已經(jīng)成為致死率最高的婦科腫瘤［1］。據(jù)統(tǒng)計，2012年美國新增卵巢癌病例約有2萬例，并且每年有約1.5萬例患者死于卵巢癌［2］。卵巢癌發(fā)病隱匿，早期缺乏典型的臨床癥狀，再加上其特殊的生理位置導(dǎo)致診斷困難，因此，卵巢癌患者一旦發(fā)現(xiàn)大多處于中晚期。眾所周知，某些microRNA（miR）可以調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究顯示，血漿中的miR-205和Let-7f聯(lián)合診斷可以提高卵巢癌的診斷率，同時Let-7f高表達(dá)的患者預(yù)后較好［3］。另有大量研究顯示miR-217［4］、miR-125A/125B［5］、miR-613［6］及miR-181C［7］均能通過靶向不同的基因，對卵巢癌的進(jìn)展起到抑制作用；而另有研究顯示，miR-144可通過靶向Glut1基因來改變卵巢癌細(xì)胞的代謝方式，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長［8］。因此，為了得到更多與卵巢癌進(jìn)展相關(guān)的microRNA，以便為以后個體化治療提供生物學(xué)基礎(chǔ)，本研究利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）和癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）中的卵巢癌患者數(shù)據(jù)分析12種microRNA的表達(dá)與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料GEO數(shù)據(jù)庫屬于美國生物技術(shù)信息中心，是全球最大的生物數(shù)據(jù)庫之一。筆者從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選含有卵巢癌和癌旁組織基因表達(dá)信息的數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集

GSE14407［9］包含卵巢癌和癌旁組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，其中包含12例卵巢上皮細(xì)胞組織（癌旁組）和12例上皮源漿液性卵巢癌組織（卵巢癌組）數(shù)據(jù)。TCGA數(shù)據(jù)庫是目前最大的癌癥生物信息數(shù)據(jù)庫，包含了大量的生物醫(yī)學(xué)信息，筆者從中選取卵巢癌患者的microRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，并根據(jù)年齡、腫瘤分級、病發(fā)位置、臨床分期和腫瘤殘余等臨床信息的完整程度，在TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選得到505例卵巢癌患者資料用于分析研究。本文所下載數(shù)據(jù)截止時間均為2015年9月22日。

1.2方法首先，篩選在GSE14407數(shù)據(jù)集和TCGA數(shù)據(jù)庫中均具有表達(dá)信息的microRNA，得到miR-10B、miR-1244、miR-622、miR-21、miR-503、Let-7D、miR-155、miR-30C、miR-17、miR-101-1、miR-186及miR-770共12種microRNA。對GSE14407數(shù)據(jù)集中的表達(dá)值進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，取以10為底的log對數(shù)，進(jìn)而分析12種microRNA在卵巢癌組和癌旁組中的表達(dá)情況，找出具有表達(dá)差異microRNA。利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的505例卵巢癌患者的信息，對有表達(dá)差異的microRNA進(jìn)行單因素和多因素生存分析，找到具有臨床意義的microRNA。505例卵巢癌患者的生存期（OS）定義為從診斷到死亡的生存時間，隨訪時間0～183個月，中位數(shù)是30個月。將505例卵巢癌患者的臨床資料依年齡、美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）癌癥臨床分期、美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）腫瘤分級、腫瘤病發(fā)位置、術(shù)后腫瘤殘余等進(jìn)行分類納入生存分析。年齡按照中位數(shù)分為高年齡（59歲）組和低年齡（＜59歲）組；臨床分期分為早期組（Ⅰ期+Ⅱ期）、晚期組（Ⅲ期+Ⅳ期）及未知；腫瘤等級分為低級別組（G1+G2）、高級別組（G3+G4）；病發(fā)位置分為單側(cè)組、雙側(cè)組；腫瘤殘余分為＜10 mm組、 10 mm組；microRNA按照表達(dá)量的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用Graphpad 5.0軟件和SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x ±s表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，Log-Rank分析生存差異。運(yùn)用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析卵巢癌患者的生存影響因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 12種microRNA在卵巢癌和癌旁組織中的表達(dá)情況癌旁組Let-7D和miR-101-1表達(dá)水平高于卵巢癌組，而miR-155和miR-770低于卵巢癌組（均P＜0.05），見表1。

Tab. 1 The expression levels of 12 kinds of microRNAs in ovarian carcinoma and paracancerous tissue表1　12種microRNA在卵巢癌和癌旁組織的表達(dá)情況

2.2生存分析年齡 59歲、臨床分期晚［（Ⅲ+Ⅳ）］期和Let-7D低表達(dá)的患者生存較差（P＜0.05）；其他microRNA高、低表達(dá)者間生存差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖1。

2.3影響卵巢癌生存的因素以年齡（歲：＜59=0，59=1）、腫瘤分級（G1+G2=0，G3+G4=1）、病發(fā)位置（單側(cè)=0，雙側(cè)=1）、臨床分期（Ⅰ期+Ⅱ期=0，Ⅲ期+Ⅳ期=1，未知=3）、腫瘤殘余（＜10 mm=0， 10 mm= 1）、Let-7D（低表達(dá)=0，高表達(dá)=1）為自變量，以生存結(jié)局（生存=0，死亡=1）為因變量，Cox回歸分析顯示，Let-7D低表達(dá)是卵巢癌患者生存的獨立危險因素，見表3。

3　討論

microRNA是一種非編碼的核酸分子，可以與其靶基因的3′UTR結(jié)合，降解或者抑制mRNA的翻譯，進(jìn)而降低靶基因的表達(dá)［10］。研究顯示，miR-155在乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌中具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用，在三陰乳腺癌和肺癌中高表達(dá)miR-155可以抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞生長，證實了miR-155可作為癌基因參與到腫瘤的進(jìn)展過程中［11- 12］。本研究結(jié)果顯示，癌旁組miR-155表達(dá)水平低于卵巢癌組，提示miR-155可能具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，癌組織中細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于癌旁組織，與上述研究一致。另有研究認(rèn)為，miR-101-1可以作為癌癥患者預(yù)后的標(biāo)志物，但是在癌癥中的生物學(xué)功能尚不明確［13-14］。miR-770可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路下游分子F-box和WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含7（F-box and WD repeat domain containing 7，F(xiàn)BXW7）來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移［15］。眾所周知，Wnt/β-catenin信號通路是廣泛存在的一條信號通路，對多種癌癥的發(fā)生起重要作用。本研究結(jié)果顯示，癌旁組miR-101-1表達(dá)水平高于卵巢癌組，而miR-770低于卵巢癌組，提示miR-770可能是癌基因。然而，生存分析顯示，3個指標(biāo)的高、低表達(dá)者間生存差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮原因可能為miR-770和miR-101-1與卵巢癌細(xì)胞的遷移能力關(guān)系不大，更多的是對卵巢癌細(xì)胞的增殖能力有影響，從而導(dǎo)致對預(yù)后沒有明顯影響。

Tab. 2 Univariate analysis of overall survival data in 505 ovary cancer patients表2　505例卵巢癌患者生存分析

Fig. 1 Kaplan-Meier plots of overall survival curves between expressions of miR-770，miR-155，miR-101-1 and Let-7D and prognosis in 505patients with ovary cancer（Kaplan-Meier，method）圖1　505例卵巢癌患者miR-770、miR-155、miR-101-1及Let-7D的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的生存曲線（Kaplan-Meier方法）

Tab. 3 Cox proportional hazards analysis of survival influencing factors for patients with ovary cancer表3　卵巢癌患者的Cox生存影響因素結(jié)果

Let-7家族參與多種腫瘤的發(fā)生進(jìn)展，起到了腫瘤抑制基因的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者血漿中高表達(dá)Let-7家族的Let-7F-1往往預(yù)示預(yù)后較差［3］。研究顯示，在口腔癌細(xì)胞系中敲低Let-7D的表達(dá)可以提高Twist和Snail的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)口腔癌細(xì)胞系的侵襲遷移能力，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換［16］。另有研究證實，在卵巢癌細(xì)胞系中胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白1（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1）和三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合亞家族B1（ATP binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）的表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞系對化療藥物的抗性相關(guān)，Let-7D可以靶向作用于IGF2BP1，從而降低ABCB1的表達(dá)，提高細(xì)胞對化療藥物的敏感性［17］。本研究結(jié)果顯示，Let-7D在卵巢癌患者的癌旁組織中的表達(dá)明顯高于癌組織，且Let-7D高表達(dá)者預(yù)后較好，Let-7D低表達(dá)是卵巢癌患者生存的獨立危險因素，考慮原因可能是高表達(dá)Let-7D抑制了IGF2BP1的表達(dá)，進(jìn)而降低了ABCB1的表達(dá)，提高了腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，最終化療效果相對較好，進(jìn)而使卵巢癌患者的壽命得到延長。另有研究顯示，Let-7D的功能與免疫系統(tǒng)相關(guān)，高表達(dá)Let-7D可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抵御多種疾?。?8］。

綜上所述，miR-155、miR-770在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，可能具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖的功能；miR-101-1和Let-7D的表達(dá)水平癌旁高于癌組織，且Let-7D與預(yù)后相關(guān)，是卵巢癌患者預(yù)后的獨立影響因素，很有希望成為卵巢癌患者預(yù)后的臨床指標(biāo)。然而有研究顯示，miR-200a的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后有關(guān)，可能也是卵巢癌患者預(yù)后預(yù)測的獨立影響因素［19］。因此，多種microRNA有可能成為卵巢癌患者預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，而對相關(guān)microRNA進(jìn)行綜合分析可能更有助于提高卵巢癌診斷和預(yù)后評判的價值。

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（2015-11-25收稿2016-01-05修回）

（本文編輯陸榮展）

The expression and clinical significance of 12 kinds of microRNAs in ovary cancer

TENG Changcai，ZHENG Hong
Department of Epidemiology and Biostatistics，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center of Cancer，Tianjin 300060，China Corresponding Author E-mail：zhengh1964@163.com

Objective To analyse the expression and clinical significance of 12 kinds of microRNAs（miR）in patients with ovarian cancer using public gene expression databases. Methods The microRNA expression data were screened in dataset GSE14407 and TCGA database，then 12 kinds of microRNAs were obtained including miR-10B，miR-1244，miR-622，miR-21，miR-503，Let-7D，miR-155，miR-30C，miR-17，miR-101-1，miR-186 and miR-770. The expression data of these 12 kinds of microRNAs were compared and identified to find the differential ones between normal tissue and tumors. Data of 505 ovary cancer patients were divided into two groups by age，tumor grade，clinical stage，disease location，tumor residual and microRNA expression. Kaplan-Meier survival analysis and Cox multivariate analysis were used to compare the overall survival of ovary cancer patients between two groups. Results Compared with ovary cancer，the expression levels of Let-7D and miR-101-1 were higher，but the expression levels of miR-155 and miR-770 were decreased，in adjacent tissue of ovary tumor（P＜0.05）. The Kaplan-Meier survival analysis result showed that lower survival rates were found in patients with age 59 years，clinical stage（Ⅲ+Ⅳ）and lower Let-7D expression（P＜0.05）. The multivariate Cox regression analysis showed that the decreased expression level of Let-7D was the independent risk factor for the prognosis of ovarian cancer. Conclusion The expression of Let- 7D is correlated with the prognosis of ovarian cancer，which is the independent biomarker to predict prognosis of ovarian cancer.

ovarian neoplasms；factor analysis，statistical；microRNA；prognosis；GEO database；TCGA database；Let-7D

R737.31，R34-33

A

10.11958/20150352

國家自然科學(xué)基金資助項目（81470153）

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，腫瘤研究所腫瘤分子流行病與生物統(tǒng)計研究室，國家腫瘤臨床研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（郵編300060）

滕長財（1990），男，碩士在讀，主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究

E-mail：zhengh64@163.com