缺氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲遷移的影響

吳麗麗，孫慧誌，孫冉，趙楠，3，王勇，古強(qiáng)，3，董學(xué)易，3，劉芳，3，孫保存，3，4

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缺氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲遷移的影響

吳麗麗1，孫慧誌1，孫冉2，趙楠1，3，王勇1，古強(qiáng)1，3，董學(xué)易1，3，劉芳1，3，孫保存1，3，4

目的探討缺氧是否能促進(jìn)不同分化程度結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），并分析缺氧對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響。方法分別選取HCT116（低度分化）和HT-29（高度分化）結(jié)直腸腺癌細(xì)胞。觀察0、10、25、50、100及150 mg/L氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)2種細(xì)胞48 h后的形態(tài)變化。分析0、10、25、50及100 mg/L CoCl2處理48 h后缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α蛋白表達(dá)變化，篩選出CoCl2誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧的最適合濃度。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72及96 h）CoCl2誘導(dǎo)2種結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖情況，篩選出CoCl2誘導(dǎo)缺氧的最佳時(shí)間。最佳濃度和時(shí)間條件下，對(duì)HCT116和HT-29細(xì)胞分別進(jìn)行缺氧（缺氧組）和常氧（常氧組）處理，Transwell侵襲和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2組2種細(xì)胞的侵襲、遷移情況；Western blot實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2組HIF-1α、E-cadherin及Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá)水平。結(jié)果50 mg/L CoCl2作用48 h時(shí)2種細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變。2組HCT116、HT-29細(xì)胞的HIF-1α蛋白表達(dá)水平隨CoCl2濃度增加均呈先增后減趨勢(shì)，50 mg/L為最適宜濃度（P＜0.05）。0～96 h時(shí)2種細(xì)胞不論有無(wú)缺氧，細(xì)胞增殖能力均呈先增后減趨勢(shì)（P＜0.05），48 h為最佳作用時(shí)間。HCT116和HT-29細(xì)胞系中缺氧組穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率均明顯高于常氧組（P＜0.05）。HCT116、HT-29細(xì)胞系中缺氧組HIF-1α、Vimentin的蛋白和mRNA表達(dá)水平均高于常氧組，而E-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)水平低于常氧組（均P＜0.05）。結(jié)論缺氧能誘導(dǎo)不同分化程度結(jié)直腸癌細(xì)胞均發(fā)生EMT，并能增強(qiáng)2種結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。

缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基；結(jié)直腸腫瘤；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；細(xì)胞增殖；腫瘤侵潤(rùn)；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

微環(huán)境缺氧是實(shí)體瘤普遍存在的現(xiàn)象，腫瘤為適應(yīng)缺氧可發(fā)生一系列生物學(xué)改變，這一過(guò)程主要由缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α介導(dǎo)［1］。HIF-1α可通過(guò)參與RNA轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，并促進(jìn)腫瘤血管的生成［2］。在腫瘤侵襲、遷移過(guò)程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）可表現(xiàn)為上皮源性標(biāo)志物減少或缺失，間葉源性標(biāo)志物增加［3-5］。HIF-1α介導(dǎo)的缺氧信號(hào)傳導(dǎo)是調(diào)節(jié)EMT的重要機(jī)制。目前，關(guān)于缺氧微環(huán)境在不同分化程度的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中是否均產(chǎn)生了影響尚無(wú)定論。本研究選擇2種不同分化程度的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，通過(guò)構(gòu)建體外缺氧模型，探討缺氧是否均能促進(jìn)不同分化程度結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，并分析缺氧對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料HT-29和HCT116分別為高、低度分化的結(jié)直腸腺癌細(xì)胞，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。DMEM/F12（Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12）和IMDM（ISCOVE’s modified DMEM）培養(yǎng)基均購(gòu)自南京凱基生物公司，胎牛血清購(gòu)自Thermo公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)FALCON公司，化學(xué)發(fā)光液A（Western Bright ECL）和B（Western Bright peroxide）購(gòu)自Advansta公司。鼠抗人單克隆抗體HIF-1α、E-cadherin及Vimentin均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。兔抗人多克隆抗體β-actin、山羊抗兔IgG抗體及山羊抗鼠IgG抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞系培養(yǎng)HT-29加入DMEM/F12培養(yǎng)基+5%胎牛血清，HCT116加入IMDM培養(yǎng)基+10%胎牛血清，加入100 U/mL的青霉素和100 mg/L的鏈霉素，于37℃5%CO2恒溫孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2不同濃度氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)2種結(jié)直腸癌細(xì)胞的形態(tài)變化HT-29、HCT116細(xì)胞分別培養(yǎng)至80%融合時(shí)，撤血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加梯度濃度的CoCl2（0、10、25、50、100 及150 mg/L）于完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于倒置顯微鏡（×100）下分別觀察HT-29、HCT116細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度CoCl2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29、HCT116細(xì)胞，撤血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰酶消化離心重懸，參照文獻(xiàn)［6］調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，分別接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加不同濃度CoCl2（0、10、25、50及100 mg/L）于完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，提取總蛋白，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉非特異性抗原后，加一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日室溫恢復(fù)后，用TBST洗10 min×3次，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后，加入200 μL A發(fā)光液和200 μL B發(fā)光液混勻后顯影；掃描電泳條帶，以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)目的條帶與內(nèi)參條帶比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。篩選出CoCl2誘導(dǎo)缺氧的最適合濃度。按照最適合濃度進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。缺氧組：HT-29和HCT116細(xì)胞分別進(jìn)行缺氧處理（HT-29-H組、HCT116-H組）；常氧組：HT-29和HCT116細(xì)胞均進(jìn)行常氧處理（HT-29-N組、HCT116-N組）。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CoCl2誘導(dǎo)2種結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29、HCT116細(xì)胞常規(guī)消化離心重懸后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL后分別接種到5 個(gè)96孔板。待細(xì)胞貼壁后，缺氧組加入50 mg/L的CoCl2，常氧組加入等量的去離子水，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，按不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72及96 h）分別取出一個(gè)96孔板，加入50 μL 1×MTT溶液，在37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（A）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。結(jié)合1.2.2細(xì)胞形態(tài)變化篩選出CoCl2誘導(dǎo)缺氧的最佳時(shí)間。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)缺氧組和常氧組細(xì)胞侵襲情況Transwell小室包被Matirgel膠置于24孔板內(nèi)并于培養(yǎng)箱中過(guò)夜，缺氧組和常氧組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h后，胰酶消化離心重懸后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，小室內(nèi)加入200 μL（無(wú)血清或含5%血清）的細(xì)胞懸液，小室外加入含20%血清的完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)，取出小室并放入加有500 μL冷甲醇的新孔內(nèi)固定20 min，用棉簽擦去小室內(nèi)的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗小室內(nèi)部1～2遍，0.4%結(jié)晶紫加入到（新孔）小室外200 μL、小室內(nèi)50 μL，待染色40 min，用PBS沖洗小室內(nèi)部1～2遍后于倒置顯微鏡（×200）下隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)［7］，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)缺氧組和常氧組細(xì)胞遷移情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29、HCT116細(xì)胞分別接種于12孔板，待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，缺氧組給予50 mg/L CoCl2處理，常氧組加入等量去離子水分別作用48 h后，用中槍頭垂直于細(xì)胞表面進(jìn)行劃痕，用無(wú)菌PBS洗去刮掉的細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基。此時(shí)記為劃痕0 h，分別在0 h和24 h于倒置顯微鏡（×40）下拍照測(cè)量細(xì)胞劃痕距離，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)缺氧組和常氧組細(xì)胞中HIF-1α、E-cadherin及Vimentin的蛋白表達(dá)情況方法同1.2.3。1.2.8反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)缺氧組和常氧組細(xì)胞中HIF-1α、E-cadherin及Vimentin的mRNA表達(dá)水平用TRizol法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，用2×Taq PCR MasterMix產(chǎn)品，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，退火（HIF-1α，55.8℃；E-cadherin，56℃；Vimentin，58.7℃；GAPDH，57.5℃）30 s，72℃延伸1 min；72℃延伸5 min，4℃冷卻10 min。HIF-1α基因?yàn)?7個(gè)循環(huán)，其他基因?yàn)?0個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠100 V，25 min電泳，電泳結(jié)果用凝膠成像分析儀拍照，電泳條帶用Quantity one軟件分析，待測(cè)基因條帶與內(nèi)參條帶比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。各基因引物序列見(jiàn)表1。

Tab. 1 Primer sequences of HIF-1α，E-cadherin，Vimentin and GAPDH表1　HIF-1α、E-cadherin、Vimentin及GAPDH引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1缺氧微環(huán)境下2種結(jié)直腸癌細(xì)胞的形態(tài)變化CoCl2誘導(dǎo)缺氧48 h時(shí)，0、10 mg/L細(xì)胞形態(tài)基本無(wú)變化；25 mg/L CoCl2細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變化；50 mg/L CoCl2細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞間連接變得疏松，細(xì)胞偽足增多，呈間質(zhì)細(xì)胞樣改變；100、150 mg/L CoCl2細(xì)胞開(kāi)始變圓，有部分細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫落，細(xì)胞出現(xiàn)裂解、死亡，見(jiàn)圖1。

B：不同濃度的CoCl2作用于HT-29細(xì)胞Fig. 1 Morphological changes of HCT116 and HT-29 cells after treatment with different concentrations of CoCl2（×100）圖1　HCT116和HT-29細(xì)胞在不同濃度CoCl2作用下的形態(tài)學(xué)改變（×100）

2.2不同濃度CoCl2作用下2種細(xì)胞系中HIF-1α蛋白表達(dá)情況HCT116細(xì)胞和HT-29細(xì)胞的HIF-1α蛋白表達(dá)水平均呈先增后減趨勢(shì)，50 mg/L 時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)水平均最高（F分別為2620.77、1 320.95，n=3，P＜0.05），結(jié)合形態(tài)學(xué)變化，以50 mg/L 為CoCl2作用的最適宜濃度，見(jiàn)圖2。

＊50 mg/L時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)水平與0、10、25及100 mg/L比較，均P＜0.05；1～5分別為0、10、25、50及100 mg/L CoCl2作用Fig. 2 Effects of different concentrations of CoCl2on the expression of HIF-1α protein in colorectal cancer cells圖2　不同濃度CoCl2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

2.3缺氧微環(huán)境下2種結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的變化0～96 h時(shí)HCT116與HT-29細(xì)胞不論有無(wú)缺氧，細(xì)胞增殖能力均呈先增后減趨勢(shì)。其中，HCT116-H組72 h時(shí)最高，但48 h時(shí)A值增長(zhǎng)幅度較72 h更大，HT-29-H組48 h時(shí)最高，因此，取48 h為最佳作用時(shí)間，見(jiàn)表2。

2.4缺氧微環(huán)境下2種結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化HCT116和HT-29細(xì)胞系中缺氧組穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率均明顯高于常氧組（P＜0.05），見(jiàn)圖3、4，表3。

Fig.3 Effects of hypoxiaon cell invasion（Crystal violet，×200）圖3　缺氧對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig. 4 Effects of hypoxiaon cell migration（×40）圖4　缺氧對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響（×40）

2.5缺氧微環(huán)境下結(jié)直腸癌細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin及Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)水平的比較HCT116- H組HIF- 1α及Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)水平均高于HCT116-N組，而E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)水平低于HCT116-N組（均P＜0.05）；HT-29細(xì)胞中HIF-1α、E-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)與HCT116細(xì)胞類似，見(jiàn)圖5、6和表4、5。

3　討論

在乳腺癌、肝癌研究中顯示，腫瘤細(xì)胞缺氧微環(huán)境可導(dǎo)致腫瘤更具有侵襲性，更易于轉(zhuǎn)移［8-9］。HIF-1α受氧分壓的調(diào)控，能在缺氧條件下保持穩(wěn)定，并且是組織缺氧的內(nèi)在標(biāo)志物。CoCl2是HIF-1α的特異性誘導(dǎo)劑，常用于體外模擬缺氧微環(huán)境［10］。

本研究形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，25 mg/L CoCl2作用時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)多角偽足，轉(zhuǎn)變成纖維母細(xì)胞樣，細(xì)胞間連接疏松，彼此間黏附性降低，易于細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)；50 mg/L CoCl2作用時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變化最顯著，當(dāng)CoCl2濃度升高（100、150 mg/L）時(shí)，細(xì)胞偽足逐漸消失，開(kāi)始變圓，部分細(xì)胞裂解死亡，表明CoCl2濃度對(duì)細(xì)胞形態(tài)改變具有雙向影響。Western blot結(jié)果顯示，HCT116和HT-29細(xì)胞的HIF-1α蛋白表達(dá)水平均呈先增后減趨勢(shì)，50 mg/L 時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)水平均最高，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)變化與HIF-1α表達(dá)量的改變，因此，以50 mg/L CoCl2作為誘導(dǎo)缺氧的最適宜濃度。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖能力呈先增后減趨勢(shì)；缺氧達(dá)48 h、72 h時(shí)，缺氧組與常氧組相比，細(xì)胞增殖能力均顯著增強(qiáng)，且缺氧組48 h細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)幅度大于72 h，提示48 h是誘導(dǎo)缺氧的節(jié)點(diǎn)；而HT-29細(xì)胞缺氧96 h時(shí)常氧組增殖率反而較缺氧組高，推測(cè)可能是由于隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，CoCl2累積的毒性效應(yīng)或是CoCl2刺激細(xì)胞反應(yīng)性增生加重了缺氧程度，導(dǎo)致缺氧組細(xì)胞增殖能力下降。

Tab. 2 Comparison of the proliferation between hypoxia and normoxic groups of HCT116 and HT-29 cells表2　缺氧組和常氧組HCT116、HT-29細(xì)胞增殖能力的變化?。╪=15，A值，x ±s）

Tab. 3 Comparison of transmembrane numbers and migration rate between hypoxia and normoxia groups in two kinds of cells表3　2種細(xì)胞中缺氧組與常氧組穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率的比較?。╪=3，x ±s）

Fig. 5 The expression levels of HIF-1α，E-cadherin and Vimentin protein after treatment with hypoxiain HCT116 and HT-29 cells圖5　缺氧對(duì)HCT116、HT-29細(xì)胞中HIF-1α、E-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)的影響

Fig. 6 The expression levels of HIF-1α，E-cadherin and Vimentin mRNA induced by hypoxiain HCT116 and HT-29 cells圖6　缺氧對(duì)HCT116、HT-29細(xì)胞中HIF-1α、E-cadherin及Vimentin mRNA表達(dá)的影響

Tab. 4 Comparison of expression levels of HIF-1α，E-cadherin and Vimentin protein表4　各組細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)量比較?。╪=3，x ±s）

Tab. 5 Comparison of expression levels of HIF-1α，E-cadherin and Vimentin mRNA表5　各組細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin及Vimentin mRNA表達(dá)量比較　（n=3，x ±s）

侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCT116和HT-29細(xì)胞系中缺氧組穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率均明顯高于常氧組，表明缺氧誘導(dǎo)不同分化程度細(xì)胞的侵襲、遷移能力均顯著增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，HCT116-H組HIF-1α及Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)水平均高于HCT116-N組，而E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)水平低于HCT116-N組，HT-29細(xì)胞類似，表明在HCT116、HT-29細(xì)胞中，缺氧誘導(dǎo)可使HIF-1α、Vimentin蛋白及mRNA水平表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)抑制E-cadherin蛋白及mRNA的表達(dá)。王永興等［11］研究顯示，缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白表達(dá)增加，而mRNA水平不變，與本研究不同，推測(cè)可能由于其使用缺氧培養(yǎng)箱誘導(dǎo)6 h與本實(shí)驗(yàn)的CoCl2誘導(dǎo)48 h不同，引起HIF-1α在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其mRNA水平的改變不同所致。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，缺氧誘導(dǎo)的不同分化程度結(jié)直腸癌細(xì)胞均有EMT發(fā)生并促進(jìn)了細(xì)胞侵襲、遷移能力。這與Cannito等［12］研究一致，推測(cè)機(jī)制可能是由于缺氧誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)增加，導(dǎo)致其調(diào)控EMT過(guò)程中的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生了變化，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT標(biāo)志物表達(dá)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)及功能發(fā)生變化。

HIF-1α是Snail、ZEB、Twist等轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)控因子［13］；而這些因子能夠識(shí)別E-cadherin啟動(dòng)子序列，吸引各種輔助因子，從而抑制E-cadherin的表達(dá)［14-15］；E-cadherin表達(dá)下調(diào)是EMT發(fā)生的關(guān)鍵［16］。但缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)不同分化細(xì)胞EMT發(fā)生的分子機(jī)制是否相同尚無(wú)定論。HIF-1α可能成為逆轉(zhuǎn)EMT發(fā)生的靶點(diǎn)，但HIF-1α在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

（圖1、3、4見(jiàn)插頁(yè)）

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（2015-12-09收稿2016-01-18修回）

（本文編輯陸榮展）

Effects of HIF-1α on epithelial-mesenchymal transition，invasion and migration in colorectal cancer cells

WU Lili1，SUN Huizhi1，SUN Ran2，ZHAO Nan1，3，WANG Yong1，GU Qiang1，3，DONG Xueyi1，3，LIU Fang1，3，SUN Baocun1，3，4
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Tianjin Nan Kai Hospital；3 Tianjin Medical University General Hospital；4 Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital Corresponding Author E-mail：sunbaocun@aliyun.com

Objective To explore whether hypoxia could promote epithelial-mesenchymal transition（EMT）in various differentiated colorectal cancer cells，and analyse the effect of hypoxia on invasion and migration of colorectal cancer cells. Methods HCT116（poorly differentiated）and HT-29（highly differentiated）colorectal adenocarcinoma cells were selected respectively. The morphological changes of two cell lines were observed after 0，10，25，50，100 and 150 mg/L cobalt chloride（CoCl2）treatment for 48 h. The expression of hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）protein was analysed after 0，10，25，50，100 and 150 mg/L CoCl2treatment for 48 h. An optimal concentration of CoCl2was then selected. Methylthiazolyl tetrazolium（MTT）assay was used to detect the proliferation of two kinds of colorectal cancer cells induced by CoCl2at different time points（0，24，48，72 and 96 h），and to select an optimal time. Under the optimal concentration and time conditions，the HCT116 and HT- 29 cells were processed by hypoxia（hypoxia group）and normoxia（normoxic group）. Transwell invasion assay and Wound healing assay were used to detect cell invasion and migration in two groups. Western blot assay and RT-PCR were used to detect protein and mRNA expression levels of HIF-1α，E-cadherin and Vimentin in two groups. Results Two kinds of cells showed obvious morphological changes after 50 mg/L CoCl2treatment for 48 h. HIF-1α protein level first increased and then decreased in two groups of cells with the increased concentration of CoCl2，and 50mg/L CoCl2was the optimal concentration（P＜0.05）. The cell proliferation showed a tendency to decrease after the increase in both kinds of cells with or without hypoxia for 0-96 h（P＜0.05），and 48 h was the optimal time. The transmembrane number and cell migration rate were significantly more in hypoxia group than those of normoxic group（P＜0.05）. The protein and mRNA levels of HIF-1α and Vimentin were significantly higher in hypoxia group than those of normoxic group in HCT116 and HT-29 cell lines（P＜0.05）. E-cadherin protein and mRNA levels were significantly lower in hypoxia group than those of normoxic group（P＜0.05）. Conclusion Hypoxia can promote EMT in different differentiated colorectal cancer cells，and can enhance invasion and migration of two kinds of colorectal cancer cells.

hypoxia-inducible factor1，α subunit；colorectal neoplasms；epithelial-mesenchymal transition；cell proliferation；neoplasm invasion；cell movement

R735.34

A

10.11958/20150385

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（81230050）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81572872）

1天津醫(yī)科大學(xué)（郵編300070）；2天津市南開(kāi)醫(yī)院；3天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院；4天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院

吳麗麗（1989），女，碩士在讀，主要從事腫瘤血管生成擬態(tài)的分子調(diào)控機(jī)制研究

E-mail：sunbaocun@aliyun.com