拉曼光譜在天然纖維素結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

馬建鋒，楊淑敏，田根林，劉杏娥

國(guó)際竹藤中心，北京 100102

拉曼光譜在天然纖維素結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

馬建鋒，楊淑敏，田根林，劉杏娥*

國(guó)際竹藤中心，北京 100102

纖維素是木質(zhì)纖維生物質(zhì)細(xì)胞壁的骨架物質(zhì)，也是生物燃料制備過程中重要的前驅(qū)體。作為重要的天然有機(jī)高分子，纖維素分子結(jié)構(gòu)的研究備受關(guān)注。拉曼光譜儀因其較高的分辨率及無損檢測(cè)的特點(diǎn)可在多尺度研究天然纖維素復(fù)雜分子鏈及聚集態(tài)結(jié)構(gòu)。本文在比較了色散型拉曼光譜儀和傅里葉變換拉曼光譜儀的構(gòu)造及相關(guān)參數(shù)的基礎(chǔ)上，詳細(xì)綜述了拉曼光譜技術(shù)在植物細(xì)胞壁纖維素微區(qū)分布、天然纖維素酶解發(fā)酵、分子鏈空間取向、分子形變、結(jié)晶度與多晶態(tài)轉(zhuǎn)變等方面的研究進(jìn)展。并對(duì)拉曼光譜技術(shù)在天然纖維素分子結(jié)構(gòu)研究中存在的問題進(jìn)行了總結(jié)，提出了可能的解決方案，以促進(jìn)拉曼光譜技術(shù)在天然有機(jī)高分子研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

天然纖維素； 拉曼光譜； 高分子鏈結(jié)構(gòu)； 聚集態(tài)結(jié)構(gòu)

引 言

隨著化石資源的消耗殆盡和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，可再生資源的開發(fā)和應(yīng)用已成為國(guó)內(nèi)外競(jìng)相開展的研究課題。作為棉花、木材、亞麻、草類等高等植物細(xì)胞壁的主要成分，纖維素主要由植物通過光合作用合成，是自然界取之不盡，用之不竭的可再生資源。研究表明纖維素是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷鍵聯(lián)接而成的鏈狀高分子化合物，同時(shí)纖維素分子內(nèi)和分子間存在著大量的氫鍵，形成復(fù)雜的高分子鏈結(jié)構(gòu)和聚集態(tài)結(jié)構(gòu)。復(fù)雜的高分子鏈結(jié)構(gòu)直接影響著纖維素及纖維素復(fù)合材料的物理(潤(rùn)脹、吸濕、熱塑性)以及力學(xué)(拉伸強(qiáng)度、彈性模量)性能，纖維素超分子結(jié)構(gòu)中存在的結(jié)晶區(qū)及非晶區(qū)兩相聚集態(tài)結(jié)構(gòu)直接影響纖維素的化學(xué)反應(yīng)性能。當(dāng)前，纖維素化工行業(yè)存在的能耗高、試劑用量大、產(chǎn)物性能不穩(wěn)定等問題，均與纖維素分子鏈和聚集態(tài)超分子結(jié)構(gòu)的性質(zhì)密切相關(guān)。另外，在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物乙醇的過程中，需使用纖維素酶先將纖維素降解為單糖，而后將單糖發(fā)酵制備生物乙醇。在線監(jiān)控纖維素分子水解生成葡萄糖的過程，可以指導(dǎo)纖維素酶用量，進(jìn)而降低生物乙醇生產(chǎn)的成本。綜上所述，纖維素分子結(jié)構(gòu)的研究對(duì)天然纖維原料的開發(fā)利用具有重要的意義。

傳統(tǒng)研究纖維素高分子結(jié)構(gòu)的方法主要有X射線衍射(XRD)、中子散射以及交叉極化魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振波譜(CP-NMR)技術(shù)。這些方法在研究纖維素分子結(jié)構(gòu)時(shí)，通常需要對(duì)纖維素樣品進(jìn)行物理或是化學(xué)預(yù)處理，處理過程不可避免地會(huì)改變纖維素樣品天然狀態(tài)下的分子結(jié)構(gòu)。相比較而言，分子光譜能夠有效地在原位狀態(tài)下研究纖維素樣品的分子結(jié)構(gòu)。早在1947年紅外光譜就被用于纖維素分子結(jié)構(gòu)的研究，但樣品中水分的存在極大地限制了紅外光譜在纖維素結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用。另外，由于衍射極限的限制顯微紅外光譜僅能提供組織水平的分子結(jié)構(gòu)信息。而作為分子光譜中的另一個(gè)重要分支，拉曼光譜因其制樣簡(jiǎn)易及較高的空間和光譜分辨率在纖維素分子結(jié)構(gòu)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。本文比較了兩種主要類型拉曼光譜儀的構(gòu)造特點(diǎn)，同時(shí)詳細(xì)綜述了拉曼光譜儀在天然纖維素研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，以期為纖維素生物合成、纖維素高效分離以及纖維素基新產(chǎn)品的開發(fā)提供新的研究思路和手段。

1 拉曼光譜儀

激光拉曼光譜儀按分光系統(tǒng)差異主要分為兩種： 色散型拉曼(dispersive Raman, DIS-Raman)和傅里葉變換拉曼(fourier transform Raman, FT-Raman)。色散型拉曼光譜儀主要通過單極或是多級(jí)光柵進(jìn)行分光，而傅里葉變換拉曼采用邁克爾遜干涉儀進(jìn)行分光。

色散型激光拉曼光譜儀主要由以下幾個(gè)部分組成(如圖1)： 激光光源→樣品室→色散系統(tǒng)→檢測(cè)器→數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

圖1 色散型拉曼光譜儀基本結(jié)構(gòu)

傅里葉變換拉曼光譜儀與色散型拉曼光譜儀不同，它主要由以下幾個(gè)部分組成(圖2)： 激光光源→樣品室→相干濾波器→干涉儀→檢測(cè)器→計(jì)算機(jī)處理數(shù)據(jù)(進(jìn)行傅里葉變換)。

圖2 傅里葉變換型拉曼光譜儀基本結(jié)構(gòu)

由于構(gòu)造原理的差異，色散型拉曼和傅里葉變換拉曼的性能有所不同，兩者的比較如表1所示。色散型拉曼通常采用532 nm(可見光)、633 nm(可見光)和785 nm(近紅外)半導(dǎo)體激光器，特別是785 nm，與可見光及紫外激光器相比，能極大地克服熒光問題。同傅里葉變換拉曼相比，色散型拉曼采用的CCD檢測(cè)器具有更高的量子效率，因此具有更高的靈敏度和檢測(cè)限。1990年，色散型拉曼光譜儀首次與顯微鏡結(jié)合并被命名為顯微拉曼光譜(Micro-Raman-spectroscopy)。它將激發(fā)光通過顯微鏡聚焦在直徑為數(shù)微米的光斑上，在這一微小區(qū)域內(nèi)獲得拉曼光譜，利用顯微鏡具有較高的數(shù)值孔徑(NA)，顯微拉曼光譜能夠極大地提高拉曼信號(hào)的采集效率。但采用該法檢測(cè)樣品時(shí)，由于激光被聚焦在數(shù)微米的光斑內(nèi)，可能會(huì)導(dǎo)致樣品因受熱而破壞。

絕大部分的傅里葉變換拉曼光譜儀都采用1064 nm半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光，以減少激光誘導(dǎo)產(chǎn)生的熒光信號(hào)。由于原理上的優(yōu)勢(shì)，傅里葉變換拉曼光譜儀具有較高的光譜分辨率，更易于和傅里葉變換拉紅外光譜儀聯(lián)用，適合于對(duì)光譜分辨率有較高要求的科學(xué)研究中。

表1 色散型及傅里葉變換型拉曼光譜儀比較

2 天然纖維素拉曼光譜特征峰歸屬

拉曼光譜儀應(yīng)用于天然纖維素的研究首先是要對(duì)纖維素拉曼光譜中各個(gè)特征峰進(jìn)行歸屬，通過拉曼光譜峰位的歸屬分析可以得到官能團(tuán)、化學(xué)鍵和電子密度等分子結(jié)構(gòu)及其變化信息。拉曼光譜峰位歸屬結(jié)果列于表2中。其中2 895 cm-1特征峰歸屬于纖維素CH2伸縮振動(dòng)，而在植物細(xì)胞壁中這一特征峰通常包含了半纖維素的貢獻(xiàn)，因此，用來反映細(xì)胞壁中碳水化合物的濃度空間差異。1 096 cm-1特征峰歸屬于纖維素糖苷鍵(C—O—C)不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1 122 cm-1特征峰歸屬于纖維素糖苷鍵(C—O—C)對(duì)稱伸縮振動(dòng)，其中1 098 cm-1特征峰的強(qiáng)度受拉曼光譜儀入射光偏振方向影響極為明顯，因此，這兩個(gè)特征峰的比值反映了天然纖維素的空間取向差異。

表2 天然纖維素拉曼光譜特征峰歸屬

3 天然纖維素拉曼光譜研究

3.1 天然纖維素分子拉曼光譜研究

3.1.1 纖維素微區(qū)分布研究

拉曼光譜研究天然纖維素微區(qū)分布，是通過對(duì)拉曼光譜中纖維素分子特征峰的峰高、峰寬或峰面積積分獲得光譜成像圖實(shí)現(xiàn)的。通過分析獲得的拉曼光譜成像圖，可以定性地研究纖維素濃度的空間差異。在植物細(xì)胞壁組分分布研究中，纖維素空間分布圖像可以通過對(duì)拉曼光譜中345～390 cm-1(β-D-葡萄糖環(huán))、978～1 178 cm-1(C—O—C)和2 810～2 936 cm-1(C—H，C—H2)三個(gè)波數(shù)區(qū)域積分獲得。針葉木管胞、闊葉木纖維細(xì)胞以及禾本科厚壁纖維細(xì)胞的拉曼光譜成像圖表明纖維素主要沉積在細(xì)胞的次生壁中，且濃度沿相鄰的細(xì)胞次生壁成波動(dòng)規(guī)律，在胞間層區(qū)域濃度最低[1-3]。然而，楊木受拉木(由于強(qiáng)風(fēng)和地心引力作用，形成于闊葉木傾斜枝干上端的應(yīng)變組織)中的纖維素微區(qū)分布較為特殊，研究發(fā)現(xiàn)受拉木中纖維細(xì)胞凝膠層的纖維素濃度高于鄰近的次生壁及胞間層。由于2 810～2 936 cm-1含有半纖維素的信號(hào)，978～1 178 cm-1波數(shù)區(qū)域包含的1 096 cm-1特征峰受入射光偏振方向影響，因此在纖維素微區(qū)分布研究中采用345～390 cm-1波數(shù)區(qū)域較為合理，盡管這一區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度較弱。

3.1.2 纖維素分子酶水解研究

在木質(zhì)纖維原料中，細(xì)胞壁中的纖維素經(jīng)酶水解可以轉(zhuǎn)化為單糖，這些單糖進(jìn)一步發(fā)酵可以制成生物乙醇。目前分析水解液中單糖的主要方法有高效液相色譜，紫外可見光譜，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用以及電化學(xué)方法。相比以上分析方法，拉曼光譜能夠在無損條件下研究水解液中各種類型單糖濃度。Shih和Smith[4]利用拉曼光譜儀定量地研究了生物煉制過程中纖維素轉(zhuǎn)化為單糖以及單糖發(fā)酵制備生物乙醇的效率。其中葡萄糖和乙醇定量研究時(shí)選用的特征峰分別為1 090cm-1(C—C伸縮振動(dòng))和883 cm-1(C—C伸縮振動(dòng))，兩者的拉曼譜圖信號(hào)檢測(cè)限分別為8和6 g·L-1，同時(shí)比較不同生物質(zhì)預(yù)處理方法對(duì)纖維素酶水解效率影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有能夠去除木質(zhì)素的預(yù)處理方法才能利用拉曼光譜技術(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。Shih等[5]進(jìn)一步結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)中的去卷積和多峰擬合光譜處理方法定量的研究了生物質(zhì)酶水解過程中葡萄糖(積分區(qū)域519 cm-1)和木糖(積分區(qū)域536 cm-1)的濃度。該方法在總糖濃度高于45 mg·mL-1時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)差為6.1%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)水、乙醇、己烷抽提能夠改善拉曼光譜背景，有助于單糖檢測(cè)限提高。盡管拉曼光譜已經(jīng)成功的應(yīng)用于監(jiān)測(cè)生物質(zhì)預(yù)處理及酶解發(fā)酵過程中單糖濃度變化，但是諸多因素仍然限制了其更廣泛的應(yīng)用，這其中包括，預(yù)處理液體中抑制物產(chǎn)生的熒光背景，各種小分子對(duì)葡萄糖、木糖、乙醇拉曼信號(hào)的干擾。因此，進(jìn)一步推廣這一技術(shù)在生物質(zhì)酶解發(fā)酵研究領(lǐng)域的應(yīng)用，依賴于對(duì)預(yù)處理及水解液中熒光背景來源的詳細(xì)研究以及排除小分子對(duì)單糖信號(hào)的干擾。

3.2 天然纖維素高分子鏈拉曼光譜研究

3.2.1 纖維素分子鏈空間取向

纖維素分子是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷鍵聯(lián)接而成的鏈狀高分子化合物。纖維素分子鏈在氫鍵和范德華力作用下平行排列形成原細(xì)纖維，若干根原細(xì)纖維組成微細(xì)纖維，微細(xì)纖維連同周圍的半纖維素和木質(zhì)素一起，組成了細(xì)胞壁的細(xì)纖維。通過研究細(xì)胞壁中纖維素的高分子鏈取向，可以近似反映微細(xì)纖維(微纖絲)的空間排列方式。植物細(xì)胞壁中聯(lián)接纖維素吡喃環(huán)的糖苷鍵(C—O—C)為平伏鍵，而次甲基(C—H)為直立鍵。這兩個(gè)鍵對(duì)拉曼光譜入射光偏振方向極其敏感，它們的強(qiáng)度與激光的偏振方向存在明顯的相關(guān)性。因此利用增加偏振片附件的顯微拉曼光譜儀可以在細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平研究纖維素高分子鏈/微纖絲的空間取向。Atalla等[6]利用偏振光拉曼光譜技術(shù)研究了苧麻(纖維素高分子鏈均平行于細(xì)胞軸)中纖維素的糖苷鍵(C—O—C，1 098 cm-1)和次甲基(C—H, 2 920 cm-1)強(qiáng)度與入射光方向變化的關(guān)系，結(jié)果表明，當(dāng)入射光電矢量方向平行細(xì)胞軸向時(shí)，1 098 cm-1特征峰較強(qiáng)，而垂直于細(xì)胞軸時(shí)這一特征峰強(qiáng)度明顯降低。2 920 cm-1特征峰強(qiáng)度變化規(guī)律與此相反。隨后Agarwal和Atalla[7]利用偏振光顯微拉曼光譜技術(shù)研究了云杉管胞次生壁中纖維素高分子鏈的空間取向，在管胞弦切面上分別以平行和垂直于細(xì)胞軸的偏振光電矢量方向進(jìn)行信號(hào)采集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)入射光電矢量方向趨近平行于細(xì)胞軸方向變化時(shí)，C—O—C特征峰相對(duì)強(qiáng)度增加，而此時(shí)C—H，C—H2特征峰相對(duì)強(qiáng)度降低。由此可知云杉管胞纖維素高分子鏈中C—O—C趨近平行于細(xì)胞軸排列方向。以上研究表明，當(dāng)拉曼光譜儀激光電矢量偏振方向平行于纖維素高分子鏈時(shí)，糖苷鍵(1 098 cm-1)特征峰強(qiáng)度增加，而趨近垂直于高分子鏈時(shí)強(qiáng)度逐漸降低。

基于以上結(jié)果，Ma等[8]系統(tǒng)地報(bào)道了灌木紅瑞木雜細(xì)胞(導(dǎo)管、薄壁細(xì)胞)與纖維細(xì)胞的微纖絲空間取向差異。結(jié)果表明，相對(duì)于纖維細(xì)胞次生壁，導(dǎo)管細(xì)胞次生壁中纖維素微纖絲排列更趨近垂直于細(xì)胞軸(圖3)。然而，以上研究均是定性地闡述纖維素微纖絲的空間分布，為了突破定量研究微纖絲空間取向這一技術(shù)瓶頸，Gierlinger等[9]結(jié)合二次線性回歸和偏最小二乘法定量地計(jì)算了云杉對(duì)應(yīng)木和應(yīng)壓木管胞次生壁外層S1和中層S2的微纖絲角，且此計(jì)算結(jié)果與X射線衍射法測(cè)量結(jié)果相近似。雖然顯微拉曼光譜技術(shù)能夠定量地研究植物細(xì)胞壁中纖維素微纖絲的空間取向，但這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用受到樣品自身特性的限制，利用這一技術(shù)首先要選擇微纖絲角小于10°且厚度大于激光光斑(0.5～1.0 μm)的細(xì)胞次生壁中層建立模型。然而在植物界中同時(shí)滿足這兩種要求的細(xì)胞種類少之又少。鑒于植物細(xì)胞壁復(fù)雜的壁層結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確測(cè)定不同壁層的微纖絲角方向仍是植物細(xì)胞生物學(xué)未來研究的重點(diǎn)之一。

圖3 紅瑞木纖維及導(dǎo)管細(xì)胞中纖維素 微纖絲空間取向拉曼光譜成像圖

Fig.3 Raman spectroscopic imaging showing the orientation of cellulose microfibrils in the fiber and vessel ofCornusalba, 1 091～1 100 cm-1

3.2.2 纖維素高分子鏈形變

拉曼光譜主要反映的是分子化學(xué)鍵振動(dòng)類型及能量的差異，當(dāng)分子受到外力作用時(shí)必將導(dǎo)致化學(xué)鍵的形變，而形變的程度可以通過拉曼光譜特征峰峰位偏移進(jìn)行定量的描述。Gierlinger等[10]利用拉曼光譜研究了單根纖維拉伸過程中纖維素糖苷鍵(C—O—C)拉曼特征峰1 097 cm-1偏移與拉伸應(yīng)力間的關(guān)系。結(jié)果表明拉伸應(yīng)力與1 097 cm-1位移存在明顯的相關(guān)性(r=0.99)，拉伸過程中1 097 cm-1的拉曼偏移量為-6.5 cm-1，偏移的速率為-6.1 cm-1/GPa。而當(dāng)單根纖維拉斷后纖維素糖苷鍵拉曼特征峰的位移又恢復(fù)到1 097 cm-1，表明了單根纖維的彈性特質(zhì)。另外，在拉伸過程中O—H區(qū)域(3 375～3 402 cm-1)也發(fā)生了明顯的拉曼偏移，這主要?dú)w因于纖維素分子中氫鍵網(wǎng)絡(luò)的破環(huán)。因此，利用1 097 cm-1特征峰偏移量以及特征峰的強(qiáng)度比可以用于研究天然纖維及纖維素復(fù)合材料的形變量。在此基礎(chǔ)上Ma等[11]在細(xì)胞水平研究了黑楊受拉木纖維細(xì)胞不同細(xì)胞壁層的形變特征，結(jié)果表明次生壁及凝膠層拉曼光譜中1 097 cm-1拉曼特征峰向低波數(shù)偏移了3 cm-1，這一結(jié)果從分子水平解釋了受拉木拉伸應(yīng)力產(chǎn)生的原因。而與單根纖維拉伸試驗(yàn)不同的是Ma等的研究結(jié)果表明受拉木凝膠細(xì)胞壁中的纖維素糖苷鍵在拉伸過程中產(chǎn)生了永久的分子形變。盡管拉曼光譜已經(jīng)成功地應(yīng)用于單根纖維及細(xì)胞壁應(yīng)力變化研究，然而實(shí)時(shí)觀測(cè)單根纖維拉伸過程中應(yīng)力變化時(shí)，纖維形變不可避免地會(huì)造成顯微拉曼光譜儀焦點(diǎn)的變化，進(jìn)而影響拉曼光譜中特征峰的信號(hào)強(qiáng)度。因此利用拉曼光譜研究單根纖維拉伸形變時(shí)，若試圖利用特征峰強(qiáng)度解釋應(yīng)力變化，應(yīng)將焦點(diǎn)改變?cè)斐傻恼`差考慮在內(nèi)。

3.3 天然纖維素聚集態(tài)結(jié)構(gòu)研究

3.3.1 纖維素結(jié)晶度

纖維素結(jié)晶度對(duì)生物質(zhì)材料的物理、力學(xué)以及化學(xué)性質(zhì)具有明顯的影響。隨著結(jié)晶度的增加，生物質(zhì)材料的拉伸應(yīng)力、尺寸穩(wěn)定性以及密度增加，而化學(xué)反應(yīng)活性及潤(rùn)脹程度降低。另外，在生物質(zhì)煉制過程中較高的纖維素結(jié)晶度對(duì)酶水解具有抑制作用。因此快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地測(cè)定纖維素結(jié)晶度對(duì)木質(zhì)纖維原料的利用尤為重要。纖維素大分子由結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)交替組成，通過混合不同比例的結(jié)晶纖維素Ⅰ及無定形纖維素，利用拉曼特征峰的相對(duì)強(qiáng)度可以表征混合物的結(jié)晶度。比較高結(jié)晶度的纖維素Ⅰ(冷凍干燥后的細(xì)菌纖維素)和無定形纖維素的拉曼光譜得知結(jié)晶和無定形態(tài)的纖維素I的拉曼光譜差異主要出現(xiàn)在對(duì)構(gòu)像敏感的低頻區(qū)(1 500～950 cm-1)，該區(qū)域存在纖維素骨架吡喃環(huán)C—C，C—O，C—O—C伸縮振動(dòng)以及HC—C，HC—O，C—OH和C—H2彎曲振動(dòng)特征峰。比較發(fā)現(xiàn)結(jié)晶和無定形纖維素Ⅰ拉曼光譜可以發(fā)現(xiàn)兩者分別在1 481和1 462 cm-1出現(xiàn)特征峰 基于這一差異，Schenzel等[12]利用拉曼光譜中纖維素Ⅰ的亞甲基彎曲振動(dòng)特征峰1 481 cm-1(結(jié)晶纖維素)和1 462 cm-1(無定型纖維素)強(qiáng)度比值建立了纖維素Ⅰ的拉曼結(jié)晶指數(shù)(XCRaman=I1 481 cm-1/I1 462 cm-1+I1 481 cm-1)。但是纖維素Ⅰ拉曼光譜中1 481和1 462 cm-1特征峰強(qiáng)度較低，且光譜擬合過程中會(huì)引入誤差。因此，Umesh等[13]利用單變量及多變量分析法建立了新的纖維素I拉曼結(jié)晶指數(shù)(XCRaman=[(I380 cm-1/I1 096 cm-1)-0.028 6]/0.006 5)。在進(jìn)一步研究針葉木、闊葉木、紙漿及各種農(nóng)林殘余物在內(nèi)的41種天然纖維的拉曼結(jié)晶指數(shù)時(shí)，Umesh等[14]發(fā)現(xiàn)紫丁香基木質(zhì)素在370 cm-1處存在的特征峰會(huì)使測(cè)得的結(jié)晶指數(shù)高于真實(shí)值，而半纖維在1 096 cm-1處存在的特征峰會(huì)使測(cè)得的拉曼結(jié)晶指數(shù)偏低。在研究纖維測(cè)試位置及樣品尺寸對(duì)結(jié)晶度影響的實(shí)驗(yàn)中，Umesh等[15]發(fā)現(xiàn)短葉松木塊相對(duì)于激光的電矢量方向變化及木粉顆粒大小對(duì)結(jié)晶度的影響較小。盡管拉曼光譜已經(jīng)逐步應(yīng)用于纖維素結(jié)晶度的計(jì)算，但是將其直接應(yīng)用于木質(zhì)纖維原料(木材、竹材以及草類等)還有待進(jìn)一步研究，研究的重點(diǎn)是探討如何去除半纖維素、木質(zhì)素以及熒光背景對(duì)光譜中纖維素結(jié)晶度相關(guān)特征峰的干擾。

3.3.2 纖維素多晶態(tài)轉(zhuǎn)變

纖維素是一種同質(zhì)多晶體，現(xiàn)在已知的纖維素結(jié)晶變體有纖維素Ⅰ(天然纖維)，Ⅱ(絲光化纖維素或是再生纖維素)，Ⅲ，Ⅳ以及ⅢⅠ，ⅢⅡ，ⅣⅠ，ⅣⅡ。不同的晶型結(jié)構(gòu)對(duì)纖維素的物理化學(xué)性質(zhì)有重要的影響，因而被廣泛研究。早在1975年Atalla和Dimick[16]就利用拉曼光譜研究了纖維素Ⅰ、纖維素Ⅱ和纖維素Ⅲ1的分子結(jié)構(gòu)差異。比較三者的拉曼光譜可以發(fā)現(xiàn)，纖維素Ⅱ和纖維素ⅢⅠ的拉曼光譜近似，而與纖維素Ⅰ存在明顯差異。在O—H伸縮振動(dòng)區(qū)域α-纖維素Ⅱ和α-纖維素ⅢⅠ分別在3 490和3 482 cm-1波數(shù)區(qū)出現(xiàn)拉曼特征峰，而α-纖維素Ⅰ在這一區(qū)域沒有特征峰出現(xiàn)，這很可能是由于分子間或分子內(nèi)的氫鍵差異造成的。在C—H伸縮振動(dòng)區(qū)域三者的拉曼特征峰位置各不相同，這反映出三種纖維素的空間構(gòu)型差異。在C—H剪切振動(dòng)區(qū)域(1 400～1 500 cm-1)，纖維素Ⅰ在1 476和1 461 cm-1出現(xiàn)兩個(gè)特征峰，而纖維素Ⅱ和纖維素ⅢⅠ僅在1 461 cm-1出現(xiàn)一個(gè)特征峰。其中1 476和1 461 cm-1分別歸屬于纖維素碳六位置上CH2OH基團(tuán)的tg和gg構(gòu)型。這表明纖維素Ⅰ具有tg和gg構(gòu)型，而纖維素Ⅱ和纖維素Ⅲ1僅有g(shù)g構(gòu)型。在C—H剪切振動(dòng)的其他區(qū)域，維素Ⅱ和纖維素Ⅲ1分別在1 265，697，577，420 cm-1出現(xiàn)拉曼特征峰，這些特征峰在纖維素Ⅰ中沒有出現(xiàn)。因此利用這些特征峰位置的差異可以快速無損地區(qū)分纖維素Ⅰ與纖維素Ⅱ。比較纖維素Ⅱ和纖維素Ⅲ1拉曼光譜可以發(fā)現(xiàn)纖維素Ⅲ1分別在3 352，2 922，1 420，1 048，550，436，105 cm-1出現(xiàn)拉曼特征峰，而纖維素Ⅱ中拉曼特征峰出現(xiàn)在3 446，3 329，2 984，2 956，2 935，2 911，2 744，1 337，491 cm-1。

在纖維素轉(zhuǎn)化利用過程中，構(gòu)象的轉(zhuǎn)變具有重要意義。Schenzel等[17]以不同比例混合纖維素Ⅰ和纖維素Ⅱ，利用拉曼光譜研究了纖維素多晶態(tài)的轉(zhuǎn)變過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著纖維素Ⅱ比例的增加，纖維素Ⅰ中1 477和1 455 cm-1拉曼特征峰逐漸消失，在純的纖維素Ⅱ樣品中，僅僅1 461 cm-1處出現(xiàn)拉曼特征峰。當(dāng)纖維素Ⅰ向纖維素Ⅱ的晶格轉(zhuǎn)變過程中CH2OH基團(tuán)的扭轉(zhuǎn)振動(dòng)方式也會(huì)發(fā)生變化，這導(dǎo)致了纖維素Ⅰ1 294 cm-1轉(zhuǎn)變成纖維素Ⅱ中的1 465 cm-1拉曼特征峰。在轉(zhuǎn)化過程中葡萄糖環(huán)振動(dòng)模式也發(fā)生了變化。具體表現(xiàn)在纖維素Ⅰ和纖維素Ⅱ拉曼光譜中379和352 cm-1拉曼特征峰相對(duì)強(qiáng)度的變化。

在絲光化(所謂“絲光化”是指用一定濃度的堿液處理纖維素纖維的過程。纖維經(jīng)絲光化處理后將發(fā)生不同程度的物理和化學(xué)變化，在堿的作用下，纖維得到充分潤(rùn)脹，堿液擴(kuò)散至纖維細(xì)胞壁內(nèi)部，使纖維素結(jié)晶區(qū)間的半纖維素、樹脂和色素等都能較好地溶解而除去)過程中纖維素也會(huì)發(fā)生多晶態(tài)的轉(zhuǎn)變，即由纖維素Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維素Ⅱ，且這一過程是不可逆的。J?hn等[18]研究麻纖維絲光化過程中，分析拉曼光譜中亞甲基彎曲振動(dòng)區(qū)域(1 400～1 475 cm-1)發(fā)現(xiàn)當(dāng)堿溶液濃度超過15%時(shí)纖維素Ⅰ全部轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維素Ⅱ，在拉曼光譜中僅1 460 cm-1處出現(xiàn)拉曼特征峰。

Schenzel等[19]利用傅里葉變換拉曼光譜研究了不同濃度堿(0%～16%)溶液處理纖維Ⅰ過程中纖維素的多晶態(tài)轉(zhuǎn)化過程，結(jié)果表明絲光化處理過程中纖維素Ⅰ2 893 cm-1拉曼特征峰向低波數(shù)方向偏移了13 cm-1，且當(dāng)堿溶液濃度超過12%時(shí)開始發(fā)生纖維素Ⅰ向纖維素Ⅱ的轉(zhuǎn)變。將纖維素Ⅰ溶解在無機(jī)鹽的水溶液(ZnCl2·4H2O，LiSCN·2,5 H2O，LiCl·ZnCl2·6H2O)，通過拉曼光譜也可以觀察到纖維素Ⅰ向纖維素Ⅱ的多晶態(tài)轉(zhuǎn)變過程。溶解后的纖維素糖苷鍵拉曼特征峰向低波數(shù)方向偏移10 cm-1。且溶解后的纖維素拉曼光譜與無定形纖維素拉曼光譜類似。

4 展 望

拉曼光譜已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然纖維素結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域的各個(gè)方面，通過纖維素拉曼光譜不僅可以有效觀測(cè)植物細(xì)胞壁內(nèi)纖維素的微區(qū)分布、拉伸狀態(tài)，還可以實(shí)時(shí)檢測(cè)纖維素酶水解過程中葡萄糖和木糖的濃度。在絲光化過程中纖維素內(nèi)化學(xué)鍵的變化和分子間相互作用也能通過拉曼光譜進(jìn)行闡釋。而這些研究大多數(shù)是基于定性的分析，而定量研究的相關(guān)報(bào)道還很少。在今后的研究中，研究人員應(yīng)充分利用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法如偏最小二乘分析，主成分分析等方法定量或半定量地獲取拉曼光譜背后隱藏的信息。除此之外，大部分色散型拉曼系統(tǒng)采用背散射采集方式獲取拉曼信號(hào)，一般只能獲得樣品表面的信息，而透射拉曼可獲得樣品三維體積內(nèi)的整體信息。因此，可以定量研究纖維素濃度，同時(shí)滿足在同一臺(tái)儀器上實(shí)現(xiàn)顯微測(cè)試和整體測(cè)試的目的。在纖維素空間分布研究中，共聚焦顯微拉曼光譜的空間分辨率是主要限制因素，當(dāng)與原子力顯微鏡聯(lián)用后構(gòu)成的針尖增強(qiáng)拉曼光譜儀(Tip Enhanced Raman Spectroscopy)能夠突破衍射極限將空間分辨率提升至納米水平，這為在納米尺度研究生物質(zhì)細(xì)胞壁的化學(xué)信息提供了可能。目前關(guān)于纖維素分布的研究主要集中在二維平面空間，而纖維素的分布在三維空間是存在差異的，對(duì)纖維素在三維空間微區(qū)分布及溶解規(guī)律的探索必將是未來植物顯微領(lǐng)域研究的前沿科學(xué)問題。在纖維素聚集態(tài)研究過程中，由于氫鍵體系為較弱的分子間相互作用，因此探索超低波數(shù)區(qū)域(10～20 cm-1)，有望觀測(cè)到天然以及化學(xué)預(yù)處理過程中纖維素構(gòu)象、晶型、結(jié)晶度的精細(xì)變化信息。由此，我們可以看出拉曼光譜儀必將在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化、植物細(xì)胞生物學(xué)以及材料科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。

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(Received Apr. 13, 2015; accepted Aug. 2, 2015)

*Corresponding author

Study on the Application of Raman Spectroscopy to the Research on Natural Cellulose Structure

MA Jian-feng, YANG Shu-min, TIAN Gen-lin, LIU Xing-e*

International Centre for Bamboo and Rattan, Beijing 100102, China

As the skeleton substances of lignocellulosic biomass cell wall and the precursor of biofuels production, the research on cellulose structure, an important natural biomarcromolecules, attracts great attention. Considering its in situ features and higher resolution, Raman spectroscopy has been used to investigate the structure of cellulose molecular chain and cellulose aggregation structure at multi-scale. In this paper, the configurations and corresponding parameters of two types of Raman spectroscopy (Dispersive Raman and FT-Raman) were compared. Subsequently, the utilization of Raman spectroscopy in cellulose micro-distribution, cellulose enzyme hydrolysis, cellulose chain orientation and deformation, cellulose crystallinity and polymorphic transformation was discussed in detail. Given the existing deficiencies of the Raman spectroscopy when used to investigate the natural cellulose, some suggestions were proposed in order to promote the application of Raman spectroscopy to the research of natural macromolecular.

Natural cellulose; Raman spectroscopy; Cellulose chain structure; Cellulose aggregation structure

2015-04-13，

2015-08-02

國(guó)際竹藤中心基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(1632015002)和“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD54G0103)資助

馬建鋒，1984年生，國(guó)際竹藤中心助理研究員 e-mail： majf@icbr.ac.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail： mjfxl31@126.com

TS01

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)06-1734-06