低能量激光聯(lián)合壓力對成骨細(xì)胞ALP活性和胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

史瑞新，付喜宏，莊金良，楊陸一*

1. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科, 吉林 長春 130021

2. 中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機械與物理研究所, 吉林 長春 130033

低能量激光聯(lián)合壓力對成骨細(xì)胞ALP活性和胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

史瑞新1，付喜宏2，莊金良1，楊陸一1*

1. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科, 吉林 長春 130021

2. 中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機械與物理研究所, 吉林 長春 130033

探討低能量激光照射(low-level laser irradiation ，LLLI)聯(lián)合壓力刺激對人成骨樣細(xì)胞的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性和胞內(nèi)Ca2+濃度的變化規(guī)律的影響，揭示LLLI促進(jìn)正畸牙齒壓力側(cè)骨改建的機制。將對數(shù)生長期的人成骨樣細(xì)胞MG-63隨機分為4組, 對細(xì)胞施加壓力采用Forcel四點彎曲體外細(xì)胞力學(xué)加載裝置，用Ga-Al-As半導(dǎo)體激光器(808 nm, 500 mW)進(jìn)行照射。組Ⅰ(對照組)： 不加力，不進(jìn)行激光照射。組Ⅱ(壓力組)： 利用細(xì)胞加載裝置對細(xì)胞加壓力，加力板變形量為3 000 ustrain，加力時間1 h。組Ⅲ(激光組)： 激光照射1 min，劑量3.75 J·cm-2。組Ⅳ(聯(lián)合組)： 細(xì)胞加力(加力方式同組Ⅱ)后，激光照射(方式同組Ⅲ)。四組細(xì)胞均用分光光度計測量細(xì)胞內(nèi)ALP活性。第二部分實驗對胞內(nèi)Ca2+濃度變化進(jìn)行測定，將MG-63細(xì)胞分為2組: 壓力組和激光張力組，2組細(xì)胞分別加力0, 5, 15, 30, 60 min，激光壓力組再激光照射1 min后收取細(xì)胞。用熒光探針Fluo-3-AM測定成骨樣細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。結(jié)果顯示第一部分實驗與對照組相比, 其余3組的ALP活性均明顯增強(p<0.05)，但聯(lián)合組的ALP 活性分別低于壓力組和激光組(p<0.05)。第二部分實驗顯示： 第1組壓力引起胞內(nèi)Ca2+濃度隨時間劇烈變化，第2組變化曲線平緩，但Ca2+濃度水平兩組無明顯差異。由此得出結(jié)論適宜的壓力和弱激光及聯(lián)合應(yīng)用均能增加成骨細(xì)胞的ALP活性，兩者聯(lián)合應(yīng)用時較單獨應(yīng)用時成骨細(xì)胞的ALP活性稍有降低，壓力組和激光壓力組胞內(nèi)Ca2+濃度的變化曲線不同，說明在正畸牙齒的壓力側(cè)，低能量激光的應(yīng)用可以降低由壓力引起的成骨細(xì)胞活性增加，減少成骨，破骨相對增加，促進(jìn)牙齒移動，LLLI極可能通過調(diào)節(jié)Ca2+濃度的變化規(guī)律來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性。

低能量激光照射(LLLI)； 成骨細(xì)胞 ； 壓力； 堿性磷酸酶

引 言

成骨細(xì)胞在骨對機械應(yīng)力的響應(yīng)中起非常重要的作用，成骨細(xì)胞的功能活性與正畸中的牙齒移動、種植體周圍的骨愈合和牽張成骨密切相關(guān)。眾多的離體細(xì)胞實驗顯示拉伸、剪切、壓縮等各種機械刺激都會對成骨細(xì)胞的功能和活性產(chǎn)生一定影響[1-3]。低能量激光照射(LLLI)在實驗和臨床中證明是對促進(jìn)創(chuàng)傷愈合有明顯作用[4-7]，體外研究也顯示低能量激光照射對不同來源的細(xì)胞均有生物刺激作用。

人們在對細(xì)胞生理行為受力學(xué)刺激的影響方面做了大量研究，但是細(xì)胞將胞外的力學(xué)信號如何轉(zhuǎn)導(dǎo)為胞內(nèi)生化的響應(yīng)，依然是有待研究的熱點，大量實驗表明，Ca2+作為第二信使參與細(xì)胞的力轉(zhuǎn)化過程，許多的物理刺激對胞內(nèi)Ca2+濃度都有一定影響，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞對刺激的響應(yīng)。有研究顯示鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞受正弦低頻弱磁場照射，胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高[8]，原代成骨細(xì)胞和MC3T3-E1細(xì)胞受到剪切力后，胞內(nèi)Ca2+濃度的迅速增加[9]，成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1受到電流刺激，引起到胞內(nèi)Ca2+濃度的增加[10]，胞內(nèi)Ca2+濃度的增加與NO的釋放和PG的合成有關(guān)，胞內(nèi)Ca2+濃度變化參與細(xì)胞對物理刺激的響應(yīng)過程但低能量激光照射聯(lián)合壓力刺激對成骨細(xì)胞的影響未見報道。本試驗的目的是研究低能量激光照射聯(lián)合壓力刺激對成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性和胞內(nèi)Ca2+濃度的變化規(guī)律的影響，進(jìn)一步揭示低能量激光如何通過影響壓力側(cè)的成骨細(xì)胞活性，來調(diào)節(jié)正畸牙齒壓力側(cè)骨形成和骨吸收的平衡。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

H-DMEM培養(yǎng)基(Gibco), 新生牛血清(Gibco)，胰酶(Gibco)，堿性磷酸酶試劑盒(碧云天)，細(xì)胞力學(xué)加載裝置為Forcel四點彎曲力學(xué)加載儀 (四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院與電子科技大學(xué)聯(lián)合開發(fā))，低能量半導(dǎo)體激光器(Ga-Al-As)中國科學(xué)院長春光機所研制。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人成骨樣細(xì)胞株MG-63(吉大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理實驗室贈予)，加入含10%胎牛血清的H-DMEM中。置于溫度37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育, 2天換液, 3天傳代1次。將傳代后的MG-63細(xì)胞，胰蛋白酶消化離心，接種于已消毒的加力板上。

1.3 細(xì)胞加力

加力裝置為Forcel四點彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀，將接種細(xì)胞的加力板放入加載儀，施加壓力，原理如圖1所示，加力時間為3 h，頻率為0.5 Hz。

圖1 Forcel四點彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀壓力原理圖

1.4 激光對MG-63細(xì)胞的照射

低能量半導(dǎo)體激光功率66 mW，光纖探頭0.4 mm, 波長808 nm, 照射時間為1 min, 能量密度3 J·cm-2。

1.5 實驗分組

將細(xì)胞隨機分成四組： 組Ⅰ(對照組)： 不做任何處理。組Ⅱ(壓力組)： 細(xì)胞加載裝置對細(xì)胞加壓力，加力板變形量為3 000 ustrain，加力時間3 h。組Ⅲ(激光組)： 激光照射1 min，劑量3 J·cm-2。組Ⅳ(聯(lián)合組)： 細(xì)胞加力(加力方式同組Ⅱ)后，激光照射(方式同組Ⅲ)。4組細(xì)胞均在12 h后收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞堿性磷酸酶，重復(fù)3次。四組測量值用±SD表示，用單因素方差分析法檢驗組間差異顯著性，組間比較用q檢驗。

第二部分實驗分兩組，第一組(張力組)： 分別在加力0，5，15，30，60 min時立即收取細(xì)胞，重復(fù)3次。第二組(激光張力組)： 分別在加力0，5，15，30，60 min后激光照射1 min，立即收取細(xì)胞，重復(fù)3次。用胰酶消化各組細(xì)胞，D-hanks液重懸細(xì)胞，加入熒光探針Fluo-3/AM-DMSO(濃度為5 μmol·L-1)，放入37 ℃水浴箱孵育30～45 min，pbs洗滌細(xì)胞3次，流式細(xì)胞儀檢測，使用FL1通道，觀察鈣離子熒光表達(dá)強度。測定數(shù)據(jù)，3次測量的數(shù)據(jù)表示為±SD，用方差分析組間差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 LLLT聯(lián)合壓力對成骨樣細(xì)胞ALP活性的影響

組Ⅰ—組Ⅳ的ALP活性值分別為35.54±4.46，47.31±2.15，46.55±3.24，40.28±2.73見表1。與組Ⅰ相比，其余三組的ALP值均有增高，差異有顯著性(p<0.05) , 說明壓力和低能量激光照射及其聯(lián)合應(yīng)用均能促進(jìn)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性增強，與組Ⅱ(壓力組)、Ⅲ(激光組)相比，組Ⅳ(聯(lián)合組)的細(xì)胞ALP活性值降低，且有顯著性差異(p<0.05)，說明壓力和低能量激光的聯(lián)合應(yīng)用較單獨應(yīng)用堿性磷酸酶活性降低，組Ⅱ和組Ⅲ之間無明顯差異，表明壓力和低能量激光各自對成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響無明顯差別，各組間ALP表達(dá)量比較圖如圖2。

表1 各組ALP檢測結(jié)果比較

*p<0.05 compared with Group Ⅰ; △p<0.05 compared with Group Ⅳ

圖2 各組ALP表達(dá)量比較圖

2.2 LLLT聯(lián)合壓力對成骨樣細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響

(1)各組成骨細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度值見表2。壓力組胞內(nèi)Ca2+熒光強度隨著受力時間(0, 5, 15, 30, 60 min)的變化趨勢為減弱增強再減弱，為波浪形，在30 min是峰值。激光壓力組胞內(nèi)Ca2+的熒光強度隨受力時間變化趨勢是逐漸增強，變化波形較平緩，峰值出現(xiàn)在60 min(如圖3)。

(2)激光壓力組0 min(即激光組)與壓力組0 min(即空白對照組)相比，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度減少(p<0.05)，表明MG-63對LLLI的響應(yīng)也是通過Ca2+濃度變化發(fā)揮作用。

表2 各組成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強度值

p<0.05 compared with stress group

圖3 各組成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強度值圖(arbitrary unit)

2.3 討論

大量關(guān)于機械力作用下的成骨細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑、增殖活性和基因表達(dá)變化的研究[11-13], 顯示: 細(xì)胞受到機械力學(xué)刺激后, 其本身的形態(tài)、細(xì)胞骨架甚至細(xì)胞核骨架發(fā)生明顯變化, 活化第二信使系統(tǒng)，最終引起細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。對細(xì)胞體外加力的裝置有許多種, 力的性質(zhì)也不盡相同[14]，本實驗應(yīng)用四點彎曲加載儀。

鄭翼等[18]發(fā)現(xiàn)頂?shù)纵S向壓力對成骨樣細(xì)胞的功能狀態(tài)和增殖活性有顯著影響, 并且隨著時間的推移而恢復(fù), 未產(chǎn)生病理性的損害。胡立桉等[19]發(fā)現(xiàn)持續(xù)壓力可降低成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的分泌活性, 適當(dāng)值的壓力在恢復(fù)正常后堿性磷酸酶的分泌活性可恢復(fù)正常, 力值過大則可能影響細(xì)胞的功能。Roelofsen[20]研究表明間歇性的靜水壓提高了細(xì)胞的堿性磷酸酶活力。不同的研究其結(jié)果不盡相同，分析可能與力值大小不同以及加力裝置的不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示壓力使成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活力增加。

Haxsen[21]研究了人成骨細(xì)胞ALP的誘導(dǎo)和低能量激光照射閾值的相關(guān)性，采用51，102，204 mW·cm-2三種功率密度的低能量激光照射細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞受到低能量激光照射后產(chǎn)生的ALP呈對數(shù)變化規(guī)律，具有明顯的閾值。Xu研究脈沖激光照射鼠顱骨成骨細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)目及活性都顯著增加，堿性磷酸酶活性增加，說明LLLI可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，在骨重建中地位十分重要。

實驗顯示壓力組和激光組均較對照組的ALP活性增加，說明適宜的壓力和低能量激光照射均能刺激成骨細(xì)胞的功能，增加其分化成熟。當(dāng)壓力和低能量激光聯(lián)合應(yīng)用時，成骨細(xì)胞的ALP活性較對照組增加，但較壓力組和激光組均有所下降。說明LLLI使受到壓力的成骨細(xì)胞ALP活性稍有降低，使其成骨減少，相對的破骨增加，促進(jìn)正畸壓力側(cè)的破骨過程。

成骨細(xì)胞的增殖、分化及遷移等過程十分復(fù)雜，細(xì)胞間的相互作用均是通過多種第二信使(包括Ca2+)來調(diào)控。機械力學(xué)刺激作用于成骨細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生改變，通過Ca2+濃度變化來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的各種生理行為。Peake[22]的實驗證明成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化早期參與了成骨細(xì)胞對機械刺激的響應(yīng)。Chellini[23]發(fā)現(xiàn)LLLI使成骨樣細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，從而調(diào)節(jié)成骨樣細(xì)胞的分化。Chen[24]的研究顯示剪切力作用于成骨細(xì)胞數(shù)秒后引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加。有臨床實驗[25]對患者尖牙施加拉力150 g/側(cè)，使其向遠(yuǎn)中移動，同時采用LLLI(780 nm)，連續(xù)9個月每個月連續(xù)3天，結(jié)果顯示加快牙齒移動速度，而且牙槽骨和根尖吸收的概率并不增加，說明LLLI對牙周組織的改建包括成骨及破骨均有促進(jìn)作用，與本實驗結(jié)果LLLI促進(jìn)壓力側(cè)的破骨相一致。本課題組前期實驗證明顯示LLLI聯(lián)合張力刺激對成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化早期參與了成骨細(xì)胞對機械刺激和LLLI的響應(yīng)[26]。

對成骨樣細(xì)胞施加壓力, 5 min后發(fā)現(xiàn)和未受力時相比，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低，顯示成骨細(xì)胞對壓力刺激的生理響應(yīng)也是通過胞內(nèi)Ca2+濃度變化來完成。受到壓應(yīng)變的成骨樣細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化隨加力時間在0，5，15，30，60 min時的變化趨勢為先減低，后增高再減低，30 min為峰值。研究資料顯示如果細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度持續(xù)快速地大幅增加會對細(xì)胞造成顯著損傷，甚至?xí)鸺?xì)胞的死亡。對受到壓力的成骨樣細(xì)胞施加低能量激光照射后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化曲線變的相對緩和，由此推測LLLI可能是通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度變化節(jié)奏來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化，從而調(diào)控成骨與破骨之間的平衡，為臨床應(yīng)用LLLI加速牙齒移動提供實驗基礎(chǔ)和理論支持?？谇徽委熓窃诹Φ淖饔孟? 張力側(cè)和壓力側(cè)牙槽骨均有成骨和破骨發(fā)生，但張力側(cè)以成骨為主，而壓力側(cè)以破骨為主的過程。本研究中, LLLI使受到壓力的成骨細(xì)胞ALP活性稍有降低，牙槽骨鈣化程度的降低有利于破骨過程的進(jìn)行，與LLLI加速牙齒移動的理論一致。

3 結(jié) 論

在正畸治療過程中，低能量激光照射使壓力側(cè)的成骨細(xì)胞ALP活性稍有降低，降低了牙槽骨鈣化程度，有利于壓力側(cè)牙槽骨的破骨過程的進(jìn)行，可能是LLLI加速牙齒移動的機理之一。受到壓應(yīng)變的成骨樣細(xì)胞施加低能量激光照射后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化曲線變的相對緩和，由此推測LLLI極有可能是通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化節(jié)奏，來達(dá)到進(jìn)一步調(diào)控成骨細(xì)胞的分化成熟。

[1] Liu J, Liu T, Zheng Y, et al. Biochem Biophys Res Commun., 2006, 348(3): 1167.

[2] Kaspar D, Seidl W, Neidlinger-Wilke C, et al. J. Biomechanics, 2000, 33(1): 45.

[3] Duncan R L, Turner C H. Calcif Tissue Int, 1995, 57(5): 344.

[4] Stein E, Koehn J, Sutter W et al. Wien Klin Wochenschr., 2008, 120(3-4): 112.

[5] Ma Z, Liu Q Y, Yang H X, et al. Light: Science & Applications, 2013, 2: e68.

[6] Judith S, Alexander F G, Brian M S. Light: Science & Applications, 2016, 5: e16001.

[7] Takaaki M, Mitsumasa I. Light: Science & Applications, 2016, 5: e16040.

[8] HUANG Chun-ming, YE Hui, XU Jian-hua，et al(黃春明，葉 輝，徐建華，等). J. Biomed. Eng.(生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志)，2000，79(1)； 63.

[9] Allen F D，Hung C T，Pollack S R, et al. Cell Eng., 1996, 1(1)： 117.

[10] Brighton C T, Wang W, Selders R , et al. J. Bone. Joint. Surg.，2001, 83(10); 1514.

[11] Sandy J R, Famdate R W, Meikle M C. Am. J. Orthod Dentofac Orthop, 1993, 103(3): 212.

[12] Pavalko F M, Chen N X, Turner C H, et al. Am. J. Physiol., 1998 , 275(6 Pt 1): C1591.

[13] Bierbaum S, Notbohm H. Eur. J. Cell. Biol., 1998, 77(1): 60.

[14] El Haj A J, Walker L M, Preston M R, et al. Med. Biol. Eng. Comput., 1999, 37(3): 403.

[15] Wuthier R E, Register T C. Birmingham Alabama: Ebsco. Media. Inc., 1985. 13.

[16] Encina N R, Billotte W G, Hofmann M C. Lab. Invest, 1999, 79(4): 449.

[17] Duong L T, Rodan G A. Reviews in Endocrine&Metabolie Disodrers, 2001，2(1): 95.

[18] ZHENG Yi，CHEN Guo-ping, ZHOU Zheng, et al(鄭 翼，陳國平，周 征，等). West China Journal of Stomatology(華西口腔醫(yī)學(xué)雜志), 2002，20(1): 18.

[19] HU Li-an, CHEN Wei-min, MAO Jing, et al(胡立桉, 陳衛(wèi)民, 毛 靖, 等). Journal of Clinical Stomatology(臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志), 2003, 19(2): 79.

[20] Roelofsen J, Klein-Nulend J, Burger E H. J. Biomech., 1995, 28(12)∶ 1493.

[21] Haxsen V, Schikora D, Sommer U, et al. Lasers Med. Sci., 2008, 23(4): 381.

[22] Peake M A, Cooling L M, Magnay J L, et al. J. Appl. Physiol., 2000, 89(6): 2498.

[23] Chellini F, Sassoli C, Nosi D, et al. Lasers Surg Med., 2010, 42(6):527.

[24] Chen N X, Ryder K D, Pavlko F M, et al. Am. J. Physiol., 2000, 278: C989.

[25] da Silva Sousa M V, Scanavini M A, Sannomiya E K, et al. Photomed Laser Surg., 2011, 29(3): 191.

[26] SHI Rui-xin, ZHOU Yan-min，HU Min, et al(史瑞新，周延民，胡 敏, 等). Optics and Precision Eng.(光學(xué)精密工程), 2015，23(7)： 1984.

(Received Dec. 31, 2015; accepted Apr. 21, 2016)

*Corresponding author

Effect of LLLI on Secretion of ALP and Intracellular Calcium Concentration in Osteoblasts under Mechanical Stress

SHI Rui-xin1, FU Xi-hong2, ZHUANG Jin-liang1, YANG Lu-yi1*

1. Orthodontics Department，School and Hospital of Stomatology, Jilin University, Changchun 130021, China

2. Changchun Institute of Optics, Fine Mechanics and Physics, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130033, China

In order to reveal the mechanism of LLLI accelerating teeth moving, we investigated the changes of alkaline phosphatase and intracellular calcium concentration when osteoblasts under stress were subjected low-level-laser-irradiation (LLLI). MG-63 cells were divided into four groups: control group, stress group, LLLI group and LLLI-stress group. Osteoblasts were subjected to the mechanical stress by a four-point bending system at 0.5 Hz and 3 000 μstrain. The secretions of ALP of each group are measured by spectrophotometer. In the second part, MG-63 cells were divided into two groups: stress group and LLLI-stress group. We checked intracellular calcium concentration via FCM and fluorescent indicator fluo-3/AM at 0, 5, 15, 30 and 60 min under stress. LLLI- stress group will receive LLLI for 1 min after stress. Compared to a control group, increased ALP secretions were observed in the other three groups. But ALP secretions in LLLI-stress group were lower than stress group and LLLI group. THE changing curve of intracellular calcium concentration in laser-stress groups is gentle instead of “jumping” in stress group. Proper stress, LLLI and combined application of these two can increase the secretions of ALP in osteoblasts compared to the control group. But the secretions of ALP decreased when combined application of stress and LLLI compared to using alone. LLLI can regulate the changing rhythm of concentration of the intracellular calcium to promote proliferation of MG-63 cell under stress, which means LLLI can reduce the bone-formation of osteoblasts under stress.

Low-level-laser-irradiation(LLLI); Osteoblast; Stress; Alkaline phosphatase (ALP)

2015-12-31，

2016-04-21

國家自然科學(xué)基金項目(61405190)和吉林省衛(wèi)計委項目(2013zc007)資助

史瑞新, 女，1978年生，吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科主治醫(yī)師 e-mail: srx781110@sina.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: Yangluyi1234@sina.com

R318.5

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)07-2178-05