高原型藏綿羊附睪細(xì)胞外基質(zhì)的組織化學(xué)研究

李　聰，袁莉剛，曲亞玲，魯玉榮，路琪中

( 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070 )

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高原型藏綿羊附睪細(xì)胞外基質(zhì)的組織化學(xué)研究

李聰，袁莉剛*，曲亞玲，魯玉榮，路琪中

( 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070 )

摘要：旨在探索高原型藏綿羊附睪細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的分布特征。應(yīng)用Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS(pH 2.5)染色組織化學(xué)方法觀察7只健康成年高原型藏綿羊附睪的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)而用免疫組織化學(xué)SP法觀察層粘連蛋白(LN)、IV型膠原蛋白(Col IV)和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的分布特征。高原型成年藏綿羊附睪各部分管腔為柱狀纖毛上皮，附睪尾間質(zhì)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維較附睪頭及附睪體明顯增多。PAS反應(yīng)顯示附睪尾陽(yáng)性強(qiáng)于附睪頭和附睪體，AB-PAS反應(yīng)顯示附睪頭和附睪尾的陽(yáng)性強(qiáng)于附睪體。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，LN在組織中表達(dá)最強(qiáng)，HSPG次之，Col IV表達(dá)較弱，HSPG和LN的陽(yáng)性表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。高原型成年藏綿羊附睪尾間質(zhì)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維的分布較附睪頭和附睪體多，附睪各部分中PAS的反應(yīng)強(qiáng)弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關(guān)，附睪尾輸精管的分泌功能增強(qiáng)；Col IV參與基膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；HSPG與血-附睪屏障構(gòu)成相關(guān)；LN與基膜的形成及其附睪中細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白(ECM)的合成和分泌有關(guān)。

關(guān)鍵詞：高原型藏綿羊；附睪；IV型膠原蛋白；層粘連蛋白；硫酸乙酰肝素蛋白多糖；組織化學(xué)

哺乳動(dòng)物附睪位于睪丸的后外側(cè)，根據(jù)其不同的結(jié)構(gòu)和功能可分為近端的頭部、細(xì)長(zhǎng)的體部和遠(yuǎn)端的尾部3部分[1]，是儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)和成熟精子的器官，并具有分泌和吸收等功能[2]。附睪主要由睪丸輸出管、附睪管、輸精管組成。附睪各部分管壁主要由主細(xì)胞、基細(xì)胞、亮細(xì)胞和暈細(xì)胞及管周肌樣細(xì)胞等組成的柱狀纖毛上皮，由于有其獨(dú)特的上皮細(xì)胞類型和功能特點(diǎn)，組織化學(xué)特征也有明顯差異[3-4]。附睪中細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白(Extracellular matrix，ECM)為附睪的生理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，不僅在黏附細(xì)胞和保持組織的正常形態(tài)中起作用，且對(duì)細(xì)胞形態(tài)、功能乃至生長(zhǎng)、分化均起重要的調(diào)節(jié)作用[5]。

附睪中的細(xì)胞外基質(zhì)由基膜和間質(zhì)等分泌的蛋白、多糖等構(gòu)成，主要包括膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ (Type Ⅳ Collage，Col Ⅳ)、層粘連蛋白(Laminin，LN)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan sulfate proteoglycan，HSPG)等，主要分布于附睪內(nèi)部分固有層、上皮和間質(zhì)區(qū)[6]。Col Ⅳ位于整個(gè)基膜的致密層，含量豐富，屬于非原纖維膠原蛋白，由6型α肽鏈組成獨(dú)特的異源三聚體螺旋結(jié)構(gòu)，能提供結(jié)構(gòu)支持以調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷移和存活[7]；HSPG是ECM分泌較多的一種蛋白多糖，由5個(gè)區(qū)域組成，在基膜中分布較廣泛，可自我裝配成低聚物，參與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，并在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中維持很多組織的穩(wěn)定性[8]；LN是一種異源三聚體糖蛋白，由α、β、γ 3種肽鏈組成，廣泛存在于基膜中，能促進(jìn)細(xì)胞黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、分化及細(xì)胞移動(dòng)[8]。研究表明，小鼠在附睪各部分管壁基膜上有Ⅳ型膠原和LN的分布[9]。A.Hadley等[10]表明嚙齒類動(dòng)物的睪丸中Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖及纖維粘蛋白與生精小管、支持細(xì)胞和精原細(xì)胞形成了基膜。牦牛犢牛睪丸ECM相關(guān)蛋白免疫組化研究顯示，LN、Col Ⅳ和HSPG在生精小管固有膜和肌樣細(xì)胞均有表達(dá)，且強(qiáng)弱差異顯著[11]，而在老齡牦牛睪丸組織Col Ⅳ分泌增加且膠原纖維合成增強(qiáng)，LN和HSPG的顯著降低可能影響leydig細(xì)胞合成分泌能力[12]，可見(jiàn)高原低氧環(huán)境下，Col Ⅳ、HSPG和LN的分布影響牦牛等高原動(dòng)物生殖繁育的調(diào)控。藏綿羊是中國(guó)3大原始綿羊品種之一，對(duì)青藏高原的環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性，能在氣候寒冷、牧草生長(zhǎng)期短、空氣稀薄的惡劣環(huán)境下生活并繁育后代，是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟(jì)中重要的畜種。高原低氧環(huán)境影響藏綿羊的生殖繁育功能，附睪細(xì)胞外基質(zhì)在生殖繁育過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于藏綿羊附睪細(xì)胞外基質(zhì)組織化學(xué)特征及相關(guān)蛋白的定位及分布研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用組織化學(xué)方法對(duì)高原地區(qū)藏綿羊附睪組織中ECM相關(guān)纖維(膠原纖維、網(wǎng)狀纖維)、糖(糖原、酸性粘多糖及中性粘多糖)以及蛋白(LN、Col Ⅳ和HSPG)等成份的分布特征進(jìn)行比較觀察，為進(jìn)一步研究高原型藏綿羊睪丸局部生精微環(huán)境的構(gòu)成及發(fā)育特點(diǎn)提供參考資料。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

成年藏綿羊附睪樣品采自青海省西寧市屠宰場(chǎng)，共7對(duì)，通過(guò)睪丸摘除手術(shù)采集。以4%中性福爾馬林溶液固定3 d后備用。

1.2主要試劑

IV型膠原兔抗鼠多克隆抗體(bs-4595R)、LN兔抗鼠多克隆抗體(bs-8561R)和HSPG兔抗鼠多克隆抗體(bs-5072R)均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化染色試劑盒(sp-0023)美國(guó)ZYMED公司生產(chǎn)；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)和(ZLI-9502)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3切片制備

新鮮組織樣品稱重測(cè)量，記錄解剖數(shù)據(jù)，4%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(片厚5 μm)，相鄰切片分為8套，其中3套分別用于Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)、LN和HSPG免疫組織化學(xué)SP法染色，剩5套用于組織化學(xué)Masson’s、Gomori’s、過(guò)碘酸雪夫染色(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)、阿利新藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫氏染色法(Alcian blue-periodic acid schiff，AB-PAS，pH 2.5)及陰性對(duì)照。

1.4組織化學(xué)染色法

切片脫水、脫蠟后分別進(jìn)行Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS染色，之后繼續(xù)進(jìn)行脫水、透明，然后封片、觀察、拍照。Masson’s三色(亮綠)染色，膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)綠色，細(xì)胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍(lán)色，紅細(xì)胞呈紅色；Gomori’s銀染顯示網(wǎng)狀纖維為灰色，蘇木素-伊紅復(fù)染后呈棕紅色；PAS染色顯示糖原及其他PAS反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)均呈陽(yáng)性，細(xì)胞核呈藍(lán)色；AB-PAS(pH2.5)染色顯示酸性黏液物質(zhì)呈藍(lán)色，中性黏液物質(zhì)呈紅色，混合呈紫紅色，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色。

1.5免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Col Ⅳ、LN和HSPG的分布

免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色，切片脫水、脫蠟后，進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)，后加一抗，一抗用Col Ⅳ、LN和HSPG 3種多克隆抗體，Col Ⅳ按1∶400比例稀釋，LN和HSPG均按1∶600比例稀釋，陰性對(duì)照組用0.01 mol·L-1的PBS代替一抗(Col Ⅳ、LN和HSPG)，4 ℃過(guò)夜，后孵育、清洗、顯色、脫水、透明、封片。然后顯微鏡下觀察、照相。

1.6圖像分析

光鏡下觀察免疫組織化學(xué)切片，隨機(jī)選取5張，每組切片中在400倍顯微鏡(Olympus)下進(jìn)行拍照，每張切片采集5個(gè)視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)定陽(yáng)性反應(yīng)物的平均光密度，并用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果

2.1高原型藏綿羊附睪纖維及糖成份的組織化學(xué)特征

光鏡下，高原型藏綿羊各附睪管上皮均可見(jiàn)3～4層上皮細(xì)胞，大量成熟精子分布于腔面，管周肌樣細(xì)胞胞核呈長(zhǎng)梭形圍繞各附睪管固有膜外周(圖1A)；間質(zhì)結(jié)締組織發(fā)達(dá)，富含膠原纖維(圖1A～C)、網(wǎng)狀纖維和血管(圖1D～F)，且附睪頭和附睪體間質(zhì)膠原纖維(圖1A，B)和網(wǎng)狀纖維(圖1D，E)較少，附睪尾間質(zhì)膠原纖維(圖1C)和網(wǎng)狀纖維(圖1F)明顯增多；附睪頭和附睪體管腔內(nèi)纖毛較長(zhǎng)(圖1A，B)，而附睪尾管腔內(nèi)纖毛較短，變?yōu)樗罹壗Y(jié)構(gòu)清晰(圖1C)。PAS染色顯示各附睪管上皮固有膜、間質(zhì)毛細(xì)血管壁、管周肌樣細(xì)胞及腔面精子紫紅色糖原陽(yáng)性條帶明顯(圖1G～I(xiàn))，附睪尾刷狀緣呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖1I)，且附睪尾PAS陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)于附睪頭和附睪體(圖1G～I(xiàn))。AB-PAS染色顯示各部分細(xì)胞核為藍(lán)色，附睪各部分毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、柱狀上皮下固有膜、上皮游離緣呈深紫紅色(圖1J～L)，附睪頭和附睪尾管周肌樣細(xì)胞呈深紫紅色(圖1J，L)，且其AB-PAS陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)于附睪體(圖1J～L)。

2.2高原型藏綿羊附睪組織中Col IV、LN和HSPG的分布

高原型藏綿羊附睪細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Col IV在各附睪管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖毛和精子呈中等陽(yáng)性表達(dá)，管周肌樣細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖2A～C)，其中附睪頭和附睪體的陽(yáng)性表達(dá)率高于附睪尾，附睪頭和附睪體的陽(yáng)性表達(dá)率差異較小(表1)；HSPG在各附睪管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和纖毛呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，管周肌樣細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)，附睪頭和附睪體腔面精子呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，附睪尾腔面精子呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖2D～F)，但附睪體的陽(yáng)性表達(dá)率高于附睪頭和附睪尾，附睪頭和附睪尾的陽(yáng)性表達(dá)率差異較小(表1)；LN在各附睪管細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖毛和精子呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，管周肌樣細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖2G～I(xiàn))，但附睪頭和附睪體的陽(yáng)性表達(dá)率高于附睪尾，附睪頭和附睪體的陽(yáng)性表達(dá)率差異較小(表1)；各蛋白陰性對(duì)照無(wú)表達(dá)(圖2J～L)。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，LN、HSPG和Col Ⅳ在附睪頭和附睪尾的表達(dá)規(guī)律相一致。LN在組織中表達(dá)最強(qiáng)，HSPG次之，Col Ⅳ表達(dá)較弱，HSPG和LN的陽(yáng)性表達(dá)差異不顯著(表1，P>0.05)；而HSPG在附睪體組織中表達(dá)最強(qiáng)，LN次之，Col IV表達(dá)較弱，HSPG和LN的陽(yáng)性表達(dá)差異不顯著(表1，P>0.05)。

3討論

3.1附睪頭、體、尾膠原纖維和網(wǎng)狀纖維分布的比較分析

附睪細(xì)胞外基質(zhì)是基膜的重要組成部分，主要包括Col Ⅳ、HSPG和LN等。研究表明小鼠附睪管周圍存在Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原纖維，Ⅰ型膠原纖維存在于附睪管外圍，并且其含量從附睪頭至附睪尾逐漸增加[13]，本研究中各附睪管外圍膠原纖維豐富，附睪尾膠原纖維的分布較附睪頭和附睪體明顯增多，可能與膠原良好的韌性促進(jìn)附睪的收縮功能運(yùn)送精子到輸精管有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀纖維主要由Ⅲ型膠原蛋白構(gòu)成，常伴其他類型的膠原、蛋白多糖和糖蛋白。網(wǎng)狀纖維細(xì)而有分支，穿行于細(xì)胞之間，共同構(gòu)成網(wǎng)狀支架[14]。本研究中各附睪管外圍網(wǎng)狀纖維的分布細(xì)而密，相互構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)，并且其分布基本與膠原纖維一致。

BC.基細(xì)胞；CA.纖毛；CF.膠原纖維；ED.附睪管；G.糖原；MC.主細(xì)胞；PC.管周肌樣細(xì)胞；RF.網(wǎng)狀纖維；SD.輸精管；SZ.精子；TED.睪丸輸出管；V.血管. 下同。 A、D、G、J.成年高原型藏綿羊睪丸輸出管；B、E、H、K.成年高原型藏綿羊附睪管；C、F、I、L.成年高原型藏綿羊輸精管。A～C.Masson’s染色；D～F.Gomori’s染色；G～I(xiàn).PAS染色；J～L.AB-PAS染色BC.Basal cells; CA.Cilia; CF.Collagen Fiber; ED.Epididymal duct; G.Glycogen; MC.Main cells; PC.Peritubular Myoid cells; RF.Reticular fiber; SD.Seminiferous duct; SZ.Spermatozoon; TED.Testicular efferent duct; V.Vessel. The same as below. A，D，G，J.The structure of testicular efferent duct in Plateau Tibetan sheep；B，E，H，K.The structure of epididymal duct in Plateau Tibetan sheep；C，F(xiàn)，I，L.The structure of seminiferous duct in Plateau Tibetan sheep. A-C.Masson’s staining；D-F.Gomori’s staining；G-I.PAS staining; J-L.AB-PAS staining圖1　高原型藏綿羊附睪Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS組織化學(xué)染色 (bar=20 μm)Fig.1　The histochemistry of Masson’s,Gomori’s,PAS and AB-PAS staining in epididymis of Plateau Tibetan sheep (bar=20 μm)

A.Col IV在成年高原型藏綿羊睪丸輸出管中的表達(dá)；B.Col IV在成年高原型藏綿羊附睪管中的表達(dá)；C.Col IV在成年高原型藏綿羊輸精管中的表達(dá)；D.HSPG在成年高原型藏綿羊睪丸輸出管中的表達(dá)；E.HSPG在成年高原型藏綿羊附睪管中的表達(dá)；F.HSPG在成年高原型藏綿羊輸精管中的表達(dá)；G.LN在成年高原型藏綿羊睪丸輸出管中的表達(dá)；H.LN在成年高原型藏綿羊附睪管中的表達(dá)；I.LN在成年高原型藏綿羊輸精管中的表達(dá)；J.成年高原型藏綿羊睪丸輸出管(陰性對(duì)照)；K.成年高原型藏綿羊附睪管(陰性對(duì)照)；L.成年高原型藏綿羊輸精管(陰性對(duì)照)A.The expresstion of Col IV in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;B.The expresstion of Col IV in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;C.The expresstion of Col IV in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep;D.The expresstion of HSPG in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;E.The expresstion of HSPG in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;F.The expresstion of HSPG in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep; G.The expresstion of LN in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;H.The expresstion of LN in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;I.The expresstion of LN in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep;J.The control of expresstion in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;K.The control of expresstion in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;L.The control of expresstion in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep圖2　高原型藏綿羊附睪的免疫組織化學(xué)染色(bar=20 μm)Fig.2　The immunohistochemical staining in epididymidis of Plateau Tibetan sheep(bar=20 μm)

3.2附睪頭、體、尾PAS和AB-PAS染色陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)域的比較分析

附睪是精子成熟、保護(hù)、運(yùn)輸和貯存的部位，在哺乳動(dòng)物生殖生育中起著重要作用[15]。附睪上皮不僅需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也會(huì)分泌一些因子和顆粒，對(duì)精子成熟起重要作用。C.Moore等[16]研究表明美國(guó)短吻鱷睪丸組織PAS和AB-PAS反應(yīng)顯示基膜和管周肌樣細(xì)胞呈陽(yáng)性，并且PAS和AB-PAS反應(yīng)呈陽(yáng)性的位置與ECM一致。研究表明大白鼠附睪頭、體、尾PAS反應(yīng)陽(yáng)性逐漸增強(qiáng)是因?yàn)榱良?xì)胞的數(shù)量逐漸增多導(dǎo)致[17]。研究表明亮細(xì)胞是附睪上皮分泌周期中一種細(xì)胞過(guò)渡狀態(tài)，大鼠附睪尾亮細(xì)胞含量較多，其PAS反應(yīng)較強(qiáng)[18]，本研究中成年藏綿羊附睪尾PAS反應(yīng)陽(yáng)性強(qiáng)于附睪頭和附睪體，附睪頭和附睪尾AB-PAS反應(yīng)陽(yáng)性強(qiáng)于附睪體，提示PAS反應(yīng)的強(qiáng)弱與亮細(xì)胞的數(shù)量有直接關(guān)系。本研究中附睪尾PAS和AB-PAS反應(yīng)較強(qiáng)，與亮細(xì)胞數(shù)量表現(xiàn)一致，附睪上皮PAS的反應(yīng)強(qiáng)弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關(guān)，表明藏綿羊附睪尾的分泌功能強(qiáng)于附睪頭和附睪體，本研究中附睪尾以輸精管為主，輸精管分泌功能的增強(qiáng)，對(duì)于精子成熟及輸送等生理功能的影響需進(jìn)一步研究證實(shí)。

表1高原型藏綿羊附睪Col Ⅳ、LN和HSPG的平均光密度

Table 1The average optical density of Col Ⅳ，LN and HSPG in epididymitis of Plateau Tibetan sheep

組別GroupColⅣHSPGLN附睪頭Caputepididymitis0.0313±0.00390.0495±0.00460.0511±0.0041附睪體Corpusepididymitis0.0339±0.00290.0582±0.00640.0523±0.0035附睪尾Caudaepididymitis0.0214±0.00210.0435±0.00350.0442±0.0033

3.3附睪細(xì)胞外基質(zhì)Col Ⅳ、HSPG和LN在附睪頭、體、尾中分布的比較分析

在機(jī)體發(fā)育的過(guò)程中Col Ⅳ是高度特化的細(xì)胞外基質(zhì)，主要存在于各附睪管的基膜[19]，形成了基膜的力學(xué)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞之間黏附、轉(zhuǎn)移和存活提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[9]，對(duì)基質(zhì)和細(xì)胞間物質(zhì)交換具有篩板作用[20]。研究表明，Col Ⅳ 主要在上皮或內(nèi)皮細(xì)胞合成，是上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等生長(zhǎng)的依附和支架。血管的生成需要多種血管基膜成分的參與，Col Ⅳ既可以促進(jìn)血管的生成，也可以抑制血管的生成[21]。本研究中Col Ⅳ在成年藏綿羊附睪各部分上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈中等陽(yáng)性表達(dá)，提示Col Ⅳ與血管、基膜均有密切的關(guān)系。研究報(bào)道，基膜可以作為濾過(guò)屏障使細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移，并且使很多細(xì)胞因子聚集在此[11]，膠原作為細(xì)胞黏附的良好基質(zhì)，其含量有決定性的作用，可直接影響細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)、形態(tài)、增殖和代謝的變化[20]，本研究中Col Ⅳ在基膜有陽(yáng)性表達(dá)，提示Col Ⅳ與基膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。研究表明，主細(xì)胞參與血-附睪屏障[22]，本研究中，Col Ⅳ在主細(xì)胞中有Col Ⅳ陽(yáng)性表達(dá)，但表達(dá)較弱，因此Col Ⅳ與血-附睪屏障構(gòu)成及作用的相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究。HSPG是發(fā)現(xiàn)最早的一種ECM，廣泛存在于基膜中[23]，不僅能結(jié)合基膜的LN、Col Ⅳ等多種成分，而且還可以與基膜外的ECM等多種成分結(jié)合。在脈管系統(tǒng)和上皮細(xì)胞中HSPG位于基膜或它與Ⅳ型膠原、LN等其他一些組分構(gòu)成基膜[24]。本研究中HSPG在成年藏綿羊附睪各部分的整個(gè)上皮均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，基細(xì)胞、主細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，提示HSPG可能參與附睪上皮及血管基膜的構(gòu)成。研究表明基細(xì)胞主要有吸收、吞噬和精子的免疫監(jiān)視作用[25-27]，提示HSPG可能與各附睪管的吸收功能有關(guān)，也可能參與維持各附睪管內(nèi)的酸性環(huán)境，利于精子的成熟及附睪的免疫應(yīng)答。研究表明，主細(xì)胞參與血-附睪屏障[22]，HSPG可以和Ⅳ型膠原和LN構(gòu)成基膜[28]，本研究中，HSPG與Col Ⅳ、LN的表達(dá)規(guī)律基本一致，提示HSPG可與其他多種ECM成分相互作用，與血-附睪屏障構(gòu)成及作用密切相關(guān)。LN作為一種非膠原蛋白成分，是基膜中最豐富的一種ECM[29]。研究表明，LN的構(gòu)造及穩(wěn)定性與Col Ⅳ和HSPG等有關(guān)[30]。在胚胎發(fā)育后期，LN通過(guò)蛋白多糖和聚集蛋白的間接作用與Ⅳ膠原蛋白、HSPG和聚集蛋白等相互作用形成成熟的基膜[31]。在果蠅中，少量的LN使基膜不完整，從而導(dǎo)致ECM的排列紊亂[32]。本研究中，LN在各部分附睪基膜和基細(xì)胞中表達(dá)量較高，提示LN可能與基膜的形成有關(guān)。LN在成年藏綿羊附睪各部分上皮均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，研究表明，PAS和AB-PAS陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白多糖和糖蛋白多存在于結(jié)締組織、黏液和基膜中，睪丸生精小管基膜的基本成分，如LN是PAS特殊反應(yīng)陽(yáng)性糖蛋白[33]，提示各附睪管基膜基本成分LN可能也與PAS合成及分泌相關(guān)。LN可以促進(jìn)上皮細(xì)胞與Ⅳ型膠原的黏連[5]，牦牛犢牛睪丸管周肌樣細(xì)胞可能與Ⅳ型膠原及LN的合成和分泌有關(guān)[11]。本研究中，LN在附睪管周肌樣細(xì)胞中也有表達(dá)，表明藏綿羊附睪各段管周肌樣細(xì)胞同樣具有分泌LN的功能；且在藏綿羊附睪血管內(nèi)皮細(xì)胞為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，提示LN可能在調(diào)節(jié)血管的生長(zhǎng)和完整性方面有重要作用。

4結(jié)論

高原型成年藏綿羊附睪尾間質(zhì)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維的分布較附睪頭和附睪體多，附睪各部分PAS的反應(yīng)強(qiáng)弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關(guān)，附睪尾輸精管的分泌功能增強(qiáng)；Col Ⅳ參與基膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；HSPG與血-附睪屏障構(gòu)成相關(guān)；LN與基膜的形成及其他ECM的合成和分泌有關(guān)。

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(編輯程金華)

The Histochemical Study of Extracellular Matrix in Plateau Tibetan Sheep Epididymis

LI Cong，YUAN Li-gang*，QU Ya-ling，LU Yu-rong，LU Qi-zhong

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

Abstract:To explore the distribution of extracellular matrix proteins of epididymis in Plateau Tibetan sheep.The histochemistry of Masson’s，Gomori’s，PAS and AB-PAS(pH 2.5)stainning were used to study the microstructure of epididymis in 7 Plateau Tibetan sheep，also the distribution of the laminin (LN)，type IV collagen (Col IV) and heparan sulfate glycoprotein (HSPG) was identified by SP immunohistochemical method.The observations made with the light microscope showed that the epithelium of epididymal ducts were columnar ciliated epithelium and the cauda was more abundant with collagen and reticular fiber than in the caput and the corpus，and as well as the PAS positive reaction in the cauda，but AB-PAS positive reaction showed that the caput and the cauda were stronger than the corpus.In addition，immunostaining analysis appeared that LN was strongly presented in the epididymis，the relative expression of HSPG was lower than LN，and Col IV was weakly expressed，but the distribution of LN and HSPG without statistical differences in epididymis (P>0.05).Taken together，the collagen and reticular fiber were more abundant in cauda than caput and corpus in Plateau Tibetan sheep epididymis，and the intensity of the PAS reaction was companied with the changes of the secretion function of epithelium，the Col IV distribution of ECM proteins was participated in basement membrane transport，but HSPG was related to the blood-epididymis barrier，and the distribution of LN may closely related with the membrane construction and secretion the of other extracellular matrix proteins in epididymal ducts.

Key words:Plateau Tibetan sheep；epididymis；type IV collagen；laminin；heparan sulfate proteoglycan；histochemistry

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.023

收稿日期：2015-09-10

基金項(xiàng)目：甘肅省財(cái)政廳基本科研業(yè)務(wù)項(xiàng)目(2012)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160488)；甘肅省自然科學(xué)研究基金(145RJZA223)

作者簡(jiǎn)介：李聰(1991-)，女，青海大通人，碩士生，主要從事動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail:393803599@qq.com,Tel:0931-7631229 *通信作者：袁莉剛，E-mail：yuan2918@126.com

中圖分類號(hào)：S852.16+5；S826

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0820-08