培育方式對雙胞胎湖羊羔羊肝基因表達(dá)的影響

王海超，張乃鋒，柴建民，王　波，刁其玉

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

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培育方式對雙胞胎湖羊羔羊肝基因表達(dá)的影響

王海超，張乃鋒，柴建民，王波，刁其玉*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

摘要：旨在研究培育方式對雙胞胎湖羊羔羊肝基因表達(dá)的影響。選取24對雙胞胎湖羊公羔羊，采用配對試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將每對雙胞胎羔羊均勻分成兩組，一組為試驗(yàn)組，7日齡后實(shí)行人工哺育代乳粉(Artificially reared，AR)；另一組為對照組，進(jìn)行隨母哺乳(Ewe reared，ER)，每組24只羔羊。兩組羔羊均在60日齡斷奶，之后飼喂開食料至90日齡。羔羊在60和90日齡時(shí)，分別隨機(jī)選取3對雙胞胎羔羊進(jìn)行屠宰。用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)的方法分析肝組織的差異表達(dá)基因。通過基因芯片分析，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了許多差異表達(dá)基因。AR組和ER組間差異表達(dá)基因在60和90日齡都發(fā)生改變的基因有7個(gè)，它們是OR1E2、S1PR3、KMO、APOA4、ORM2、HTR4和FADS1；60和90日齡間的差異表達(dá)基因在AR組和ER組中表達(dá)也發(fā)生變化的基因有20個(gè)，它們是ACO1、HBA1、MFSD2A、CYSJ、LOC785954、FCN、GRB2、LOC100037663、ORM2、RXRG、LOC100602447、SQLE、HSD17B2、CYP4F2、INHBE、EAAT2，其中有4個(gè)未知基因，探針號(hào)為14780690、14815720、14845504、14854080；在不同日齡和不同處理中，表達(dá)均發(fā)生改變的基因是ORM2。GO功能顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)基因主要參與氨基酸、小分子化合物和有機(jī)酸代謝的生物過程、酶活性反應(yīng)生物過程和免疫反應(yīng)過程。KEGG代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)基因主要參與氨基酸代謝、脂類代謝、激素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。綜上所述，不同的培育方式導(dǎo)致肝的基因表達(dá)發(fā)生了改變，發(fā)現(xiàn)了肝差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程及其發(fā)揮的生物學(xué)功能，初步揭示了羔羊早期培育的分子機(jī)理。

關(guān)鍵詞：雙胞胎羔羊；早期斷奶；代乳粉；差異表達(dá)基因；基因芯片

隨著人類基因組計(jì)劃(Human genome project，HGP)的完成，研究人員將重點(diǎn)聚焦在基因功能的研究上。而以高通量為主要特點(diǎn)的基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使科學(xué)家能夠高效快捷地實(shí)現(xiàn)這一宏偉目標(biāo)。1991年，美國Affymetrix公司生產(chǎn)的第一塊原位雜交合成的寡聚核苷酸基因芯片問世[1]。1994年，美國斯坦福大學(xué)E.M.Southern等用直接點(diǎn)樣法成功制備出第一塊cDNA微陣列芯片[2]。從此，基因芯片技術(shù)便迅速得到普及和推廣?；蛐酒目焖侔l(fā)展使人們能夠深入剖析生命現(xiàn)象，從DNA水平研究生命機(jī)理。1998年，基因芯片技術(shù)被美國科學(xué)促進(jìn)會(huì)(America association for the advancement of science，AAAS)評為1998年度世界自然科學(xué)領(lǐng)域十大科技突破之一[3]。2001年，美國國家牛功能基因組研究協(xié)會(huì)第一次應(yīng)用芯片對牛刀豆球蛋白A (Concanavalin A)刺激的外周血單核細(xì)胞開展研究后[4]，人們開始利用芯片技術(shù)對反芻動(dòng)物的胚胎發(fā)育機(jī)理[5]、組織特異性表達(dá)基因[6]、免疫機(jī)理[7]、營養(yǎng)分子機(jī)理[8]進(jìn)行探索。2005 年，Y.H.Wang 等[9]通過對日本和牛與荷斯坦牛背最長肌差異基因進(jìn)行分析，獲得影響肉質(zhì)和脂肪代謝的候選基因。生物信息網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫能夠?qū)⒒蛐酒诰虻臄?shù)據(jù)信息轉(zhuǎn)換為生命的語言，賦予其生物學(xué)意義?；蛐酒夹g(shù)和生物信息學(xué)方法成為研究系統(tǒng)生物學(xué)的主要工具和方法[10]。

湖羊是世界上著名的多胎綿羊品種之一，平均產(chǎn)羔率達(dá)220%，產(chǎn)雙胞胎的幾率很高。雙胞胎具有相似的遺傳背景，在這個(gè)具有純化性的先天因素條件下，后天環(huán)境對雙胞胎表達(dá)出的不同征候或者表型的影響能夠清晰的體現(xiàn)出來，有利于對影響因子進(jìn)行詳細(xì)剖析[11]。雙胞胎動(dòng)物以其得天獨(dú)厚的優(yōu)越條件成為一種非常理想的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本試?yàn)選用雙胞胎湖羊羔羊作為試驗(yàn)動(dòng)物，通過比較屠宰試驗(yàn)方法，采用基因芯片的手段對肝樣品的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，測定肝基因表達(dá)的變化情況，初步探討營養(yǎng)素對羔羊早期生長發(fā)育和代謝調(diào)控等生命活動(dòng)的影響，為羔羊早期培育的營養(yǎng)調(diào)控提供科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2013年10月—2014年2月在江蘇省姜堰市海倫羊業(yè)有限公司進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用配對試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取發(fā)育正常，出生日齡和體重相近，遺傳基礎(chǔ)相同的雙胞胎湖羊羔羊24對。將每對雙胞胎羔羊均勻的分成兩組，一組為試驗(yàn)組，7日齡后實(shí)行人工哺育代乳粉(Artificial reared，AR)；另一組為對照組，進(jìn)行隨母哺乳(Ewe reared，ER)，每組24只羔羊。兩組羔羊均于60日齡斷奶，之后飼喂開食料至90日齡。羔羊在60和90日齡時(shí)，分別隨機(jī)選取3對雙胞胎羔羊進(jìn)行屠宰試驗(yàn)。

1.3試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)所需代乳粉由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供，代乳粉的主要成分參照我國發(fā)明專利ZL 201210365927.6 “中0～3月齡羔羊的代乳品及其制備方法”[12]。試驗(yàn)中的代乳粉和開食料的營養(yǎng)水平見表1。

1.4飼養(yǎng)管理

羊舍為半開放式暖棚，通風(fēng)良好。所有試驗(yàn)羔羊均打耳號(hào)，并按照羊場的正規(guī)程序進(jìn)行免疫和消毒。試驗(yàn)組羔羊自出生至7日齡隨母羊哺乳，8日齡時(shí)開始由母羊哺乳逐漸過渡到飼喂代乳粉，至10日齡時(shí)完全飼喂代乳粉。羔羊在11～50和51～60日齡期間，代乳粉的飼喂量分別以體重的2.0%和 1.5%為標(biāo)準(zhǔn)[13]。在試驗(yàn)過程中，根據(jù)羔羊的采食和健康狀況調(diào)整代乳粉的飼喂量。30日齡前，每日飼喂3次(07:00、13:00和19:00)，31～60日齡每日飼喂兩次(08:00和18:00)。代乳粉飼喂前用煮沸后冷卻至50 ℃的熱水按代乳粉∶水=1∶5的比例沖泡，再冷卻至(40±1) ℃飼喂。每次飼喂后及時(shí)用干凈的毛巾將羔羊嘴邊的乳液擦拭干凈。對照組羔羊每日在上述時(shí)間和母羊接觸一次哺乳，每次10 min。試驗(yàn)羔羊均于15日齡開始訓(xùn)練采食相同的開食料，自由采食和飲水。

表1代乳粉和開食料的營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

Table 1Nutrient levels of milk replacer and starter(DM basis)

%

表中所列項(xiàng)目均為實(shí)測值。配方由于涉及專利內(nèi)容，未公開

The items in the table were measured values.The formulas involved in patent could not be opened to the public

1.5樣品采集

羔羊在60和90日齡時(shí)，分別隨機(jī)選取3對雙胞胎羔羊于清晨08:00進(jìn)行屠宰。宰前16 h禁水禁食。試驗(yàn)羊經(jīng)二氧化碳?xì)怏w致暈后，頸脈放血屠宰。羔羊解剖后將肝分離，在處理組和對照組的羔羊肝相同的位置分別取肝組織樣品，用生理鹽水沖洗干凈后放到預(yù)先標(biāo)記好的1.5 mL凍存管中，并迅速置于液氮中速凍，運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室后存放到-80 ℃冰箱中備用。

1.6總RNA的提取

用化學(xué)有機(jī)試劑法提取綿羊肝組織的總RNA，然后分別用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測所提RNA的質(zhì)量。

1.7芯片操作

對于1%瓊脂糖凝膠電泳初步質(zhì)檢合格的樣品，進(jìn)一步測定該樣品的總RNA濃度，并將全部樣品的總RNA液均稀釋至濃度為2.0 μg·μL-1。以兩兩配對為設(shè)計(jì)原則，采用Affmetrix綿羊組織基因芯片對不同處理和不同日齡的羔羊肝組織中的表達(dá)基因進(jìn)行檢測，芯片試驗(yàn)操作由北京博奧生物有限公司按照Affmetrix表達(dá)分析技術(shù)手冊完成。

1.8基因芯片的數(shù)據(jù)分析

采用Affymetrix GeneChip?Scanner 3000掃描儀對雜交芯片進(jìn)行掃描，掃描的圖像結(jié)果被保存成.DAT文件，然后將.DAT 文件轉(zhuǎn)存為.JPG 圖片文件。接著用Affymetrix AGCC軟件將圖像信號(hào)(.DAT文件)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)(.CEL文件)，.CEL文件記錄每個(gè)探針(Probe) 的熒光信號(hào)強(qiáng)度。然后用RMA算法[14]對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。用cluster 3.0軟件進(jìn)行聚類分析，并用Treeview軟件進(jìn)行可視化。

1.9差異表達(dá)基因的篩選

按照S.Audic等[15]提出的方法篩選差異表達(dá)基因。按照Y.Benjamini等[16]提出的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate，F(xiàn)DR) 對P值進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，記為q值(qvalue)。本試驗(yàn)采用的差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)是q<0.05，并且差異倍數(shù)(Fold change)>2[17]，差異表達(dá)倍數(shù)計(jì)算方法為同一個(gè)基因在兩個(gè)樣本中表達(dá)量比值的log2對數(shù)。

1.10差異表達(dá)基因的GO功能分析和通路分析

利用DAVID(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)在線分析系統(tǒng)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因注釋(基因基本信息來源于NCBI Entrez Gene 數(shù)據(jù)庫，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)、GO功能聚類分析(Gene Ontology數(shù)據(jù)庫，http://www.geneontology.gov/)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析(http://www.genome.jp/kegg/)。

2結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)檢結(jié)果

經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，從圖1中可以看到，電泳條帶總體比較清晰，部分RNA 樣品略有降解，28S rRNA與18S rRNA 條帶亮度的比值接近1∶1或更大。另外，分光光度計(jì)的結(jié)果顯示，提取的總RNA的A260 nm/A280 nm比值為1.9～2.1，質(zhì)量基本符合表達(dá)譜芯片的試驗(yàn)要求。

2.2芯片質(zhì)檢結(jié)果

通過對芯片中檢測到的表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不同芯片中的基因檢出率為50%～60%(表2)，最低檢出率為53.78%，最高檢出率達(dá)到57.33%，符合芯片試驗(yàn)的結(jié)果。芯片表達(dá)譜的聚類分析顯示(圖2)，60日齡時(shí)的兩個(gè)不同處理聚在了一起，90日齡的兩個(gè)不同處理聚在了一起，這符合試驗(yàn)分組和處理的要求。

2.3差異表達(dá)基因的篩選

60日齡時(shí)，代乳粉組和母乳組(60ARvs60ER)差異表達(dá)的基因有60個(gè)，其中33個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，27個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；90日齡時(shí)，代乳粉組和母乳組(90ARvs90ER)差異表達(dá)的基因有80個(gè)，其中58個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，22個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；代乳粉組中，60日齡和90日齡相比(60ARvs90AR)，差異表達(dá)的基因有102個(gè)，其中64個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，38個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；母乳組中，60日齡和90日齡相比(60ERvs90ER)，差異表達(dá)的基因有76個(gè)，其中49個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，27個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖3)。

表2基因芯片檢出率

Table 2The call rate of gene in microarray

樣品號(hào)SampleID未檢出Absent檢出Present檢出率/%Callrate949193671258457.339715100291192254.31974194461250556.97949395081244356.699625101081184353.95969396931225855.848159101461180553.78968196251232656.15970795501240156.498157101021184953.98961596401231156.08967597361221555.65

圖1　湖羊肝總RNA電泳圖Fig.1　The electrophoregram of total RNA in Hu sheep

圖2　芯片表達(dá)譜聚類熱圖Fig.2　The heat map of microarray clustering

A是60日齡時(shí)，代乳粉組與母乳組的差異表達(dá)基因；B是90日齡時(shí)，代乳粉組與母乳組的差異表達(dá)基因；C是母乳組中，60日齡與90日齡的差異表達(dá)基因；D是代乳粉組中，60日齡與90日齡的差異表達(dá)基因。紅點(diǎn)表示上調(diào)表達(dá)基因，綠點(diǎn)表示下調(diào)表達(dá)基因，黑點(diǎn)表示基因表達(dá)無差異A.DEGs of 60AR vs 60ER；B.DEGs of 90AR vs 90ER；C.DEGs of 60ER vs 90ER；D.DEGs of 60AR vs 90AR.Dots in red mean up regulated genes；Dots in green mean down regulated genes；Dots in black mean no differences圖3　差異表達(dá)基因散點(diǎn)圖Fig.3　Scatter plot of differentially expressed genes

由韋恩圖(圖4)可以看出，在60日齡時(shí)，AR組和ER組的差異表達(dá)基因中有7(=1+2+4)個(gè)基因在90日齡的不同處理之間也發(fā)生了改變，它們是OR1E2、S1PR3、KMO、APOA4、ORM2、HTR4和FADS1。組間差異基因APOA4在60日齡時(shí)表達(dá)上調(diào)，在90日齡時(shí)表達(dá)下調(diào)。而組間差異基因ORM2則相反，它在60日齡時(shí)表達(dá)下調(diào)，在90日齡時(shí)表達(dá)上調(diào)。組間差異基因S1PR3和HTR4的表達(dá)在不同日齡中的表達(dá)均上調(diào)，OR1E2、KMO和FADS1的表達(dá)在不同日齡中的表達(dá)均下調(diào)(表3)；在AR組中，60日齡和90日齡的差異表達(dá)基因中有20(=15+2+2+1)個(gè)基因在ER組的不同日齡中也發(fā)生了改變，其中有4個(gè)基因尚不清楚其符號(hào)(Gene symbol)和功能，它們的探針號(hào)分別為14780690、14815720、14845504、14854080，其他的16個(gè)基因是ACO1、HBA1、MFSD2A、CYSJ、LOC785954、FCN、GRB2、LOC100037663、ORM2、RXRG、LOC100602447、SQLE、HSD17B2、CYP4F2、INHBE、EAAT2。不同日齡差異表達(dá)基因ORM2和LOC100602447在AR組中上調(diào)表達(dá)，在ER組中下調(diào)表達(dá)。而MFSD2A在AR組中下調(diào)表達(dá)，在ER組中上調(diào)表達(dá)。CYSJ、FCN、RXRG、SQLE、HSD17B2、CYP4F2、INHBE和EAAT2在不同處理組之間的表達(dá)均上調(diào)，ACO1、HBA1、LOC785954、LOC100037663和4個(gè)未知的基因在不同處理組之間的表達(dá)均下調(diào)(表4)；在不同日齡和不同處理中，表達(dá)均發(fā)生改變的基因是ORM2。2.4差異表達(dá)基因的GO分析

通過GO(Gene ontology)功能顯著性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60日齡時(shí)，AR組和ER組的差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程主要是氨基酸分解代謝過程、小分子分解代謝過程、有機(jī)酸代謝過程和胺代謝過程等(表5)；90日齡時(shí)，AR組和ER組的差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程包括炎癥反應(yīng)過程、脂蛋白代謝過程和免疫反應(yīng)過程等(表6)；AR組中，60和90日齡差異表達(dá)的基因參與的生物過程包括胰核糖核酸酶活性反應(yīng)過程、單氧化酶活性反應(yīng)過程、離子結(jié)合過程和蛋白酶活性反應(yīng)過程等(表7)；ER組中，60和90日齡差異表達(dá)的基因參與的生物過程包括底物跨膜過程、離子交換過程、電子傳遞過程和有機(jī)酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程等(表8)。

2.5差異表達(dá)基因的Pathway分析

對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG pathway 代謝途徑顯著性富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在60日齡時(shí)，AR組和ER組的差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)途徑主要是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑、色氨酸代謝途徑、鞘糖脂生物合成途徑、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑以及糖類的消化和吸收(表9)；90日齡時(shí)，AR組和ER組的差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)途徑主要是固醇類激素生物合成途徑、氨基糖和核苷酸糖代謝途徑、谷胱甘肽代謝途徑、細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的藥物代謝途徑、P53信號(hào)途徑、神經(jīng)活性腺體受體互作途徑(表10)；AR組中，60和90日齡差異表達(dá)的基因參與的生物途徑主要是花生四烯酸代謝途徑、氨基糖和核苷酸糖代謝途徑、固醇類激素生物合成途徑和膽汁分泌途徑(表11)；ER組中，60和90日齡差異表達(dá)基因參與的生物途徑主要是PPAR信號(hào)途徑、固醇生物合成途徑、膽汁分泌途徑、萜類化合物骨架生物合成途徑、卟啉代謝途徑、固醇類激素生物合成途徑、視黃醇代謝途徑和細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的外源性物質(zhì)代謝途徑(表12)。

圖4　差異表達(dá)基因韋恩圖Fig.4　Venny view of differentially expressed genes

表3不同處理組的差異表達(dá)基因在不同日齡時(shí)表達(dá)也發(fā)生改變的基因

Table 3Differentially expressed genes in both 60ARvs60ER and 90ARvs90ER

探針號(hào)ProbeID基因Gene基因描述Description60ARvs60ER90ARvs90ER倍數(shù)變化Foldchange+/-倍數(shù)變化Foldchange+/-14731708OR1E2olfactoryreceptor1E22.0383-3.2227-14732242S1PR3sphingosine1-phosphatereceptor34.2149+3.5249+14790803KMOkynurenine3-monooxygenase2.2528-2.2594-14791676APOA4apolipoproteinA-IV11.4418+3.1908-14833655ORM2orosomucoid22.4450-3.8018+14840715HTR45-hydroxytryptaminereceptor43.5515+3.5279+14876903FADS1fattyaciddesaturase12.3004-2.2316-

“+” 表示表達(dá)上調(diào)；“-” 表示表達(dá)下調(diào)。下同

“+” means up regulated；“-” means down regulated.The same as below

表4不同日齡的差異表達(dá)基因在不同處理組之間表達(dá)也發(fā)生改變的基因

Table 4Differentially expressed genes in both 60ARvs90AR and 60ERvs90ER

探針號(hào)ProbeID基因Gene基因描述Description60ARvs90AR60ARvs90ER倍數(shù)變化Foldchange+/-倍數(shù)變化Foldchange+/-14709484ACO1aminocyclopropanecarboxylateoxidase2.2952-2.0665-14725669HBA1hemoglobinsubunitalpha6.4061-10.1112-14756654MFSD2Amajorfacilitatorsuperfamilydomaincontaining2A2.0020-3.8621+14758027CYSJsulfitereductase(NADPH)flavoproteinalpha-component2.6658+2.0501+14773310LOC785954smallsubunitribosomalproteinS10e2.2952-2.5602-14776443FCNficolin2.2309+2.2194+14780690NULLnull3.5224-3.8595-14785130GRB2growthfactorreceptor-bindingprotein22.5634-2.2665-14809531LOC100037663glutathionetransferaseM32.2619-2.0670-14815720NULLnull4.1477-5.9312-14833655ORM2orosomucoid3.4285+2.7115-14845504NULLnull7.6394-5.7670-14850419RXRGretinoidXreceptorgamma3.7414+2.3365+14854080NULLnull2.9214-3.3807-14854806LOC100602447serumamyloidAprotein-like2.6755+2.5259-14858743SQLEsqualenemonooxygenase2.1339+6.5550+14862677HSD17B2estradiol17beta-dehydrogenase2.4498+3.5070+14865413CYP4F2cytochromeP4503.2780+3.9278+14885536INHBEinhibin,betaE2.2869+2.2567+14887970EAAT2excitatoryaminoacidtransporter210.4228+2.1005+

null表示暫無基因信息

null mean no gene information found

表560日齡AR組和ER組差異表達(dá)基因最顯著富集的10個(gè)GO條目

Table 5Top 10 significantly enriched GO terms at 60ARvs60ER

GO號(hào)和條目GOIDandterms基因符號(hào)GenesymbolP值PvalueGO:0043436//oxoacidmetabolicprocessACMSD;AFMID;KMO;LOC100297420;SDS;GNMT;IDNK;ELOVL7;LPIN1;FADS1;GLCE;DDAH13.85E-06GO:0006082//organicacidmetabolicprocessACMSD;AFMID;KMO;LOC100297420;SDS;GNMT;IDNK;ELOVL7;LPIN1;FADS1;GLCE;DDAH14.70E-06GO:0019752//carboxylicacidmetabolicprocessACMSD;AFMID;KMO;LOC100297420;SDS;GNMT;IDNK;ELOVL7;LPIN1;FADS1;DDAH19.11E-06GO:0016054//organicacidcatabolicprocessAFMID;KMO;SDS;IDNK;LPIN1;DDAH12.29E-05GO:0046395//carboxylicacidcatabolicprocessAFMID;KMO;SDS;IDNK;LPIN1;DDAH12.29E-05GO:1901605//alpha-aminoacidmetabolicprocessAFMID;KMO;LOC100297420;SDS;GNMT;DDAH14.19E-05GO:0044282//smallmoleculecatabolicprocessAFMID;KMO;SDS;IDNK;LPIN1;DDAH11.24E-04GO:0044712//single-organismcatabolicprocessAFMID;KMO;SDS;IDNK;LPIN1;DDAH11.24E-04GO:0046874//quinolinatemetabolicprocessACMSD;KMO1.85E-04GO:1901606//alpha-aminoacidcatabolicprocessAFMID;KMO;SDS;DDAH11.91E-04

表690日齡AR組和ER組差異表達(dá)基因最顯著富集的10個(gè)GO條目

Table 6Top 10 significantly enriched GO terms at 90ARvs90ER

GO號(hào)和條目GOIDandterms基因符號(hào)GenesymbolP值PvalueGO:0006953//acute-phaseresponseORM2;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA14.45E-06GO:0006954//inflammatoryresponseENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;S1PR3;CHI3L1;ORM2;SAA1;CXCL102.71E-05GO:0002526//acuteinflammatoryresponseORM2;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA13.99E-05GO:0034364//high-densitylipoproteinparticleAPOA4;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA11.5E-06GO:0034358//plasmalipoproteinparticleAPOA4;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA18.22E-06GO:0005615//extracellularspaceENPP2;PAI-1;CHI3L1;APOA4;ORM2;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA1;LCN2;CRELD2;CXCL108.83E-06GO:0032994//protein-lipidcomplexENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;APOA4;SAA19.4E-06GO:0005576//extracellularregionENPP2;PAI-1;AGR2;IL1R1;CHI3L1;APOA4;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;ORM2;RNASE12;BRB;SAA1;MANF;LCN2;CES4A;CRELD2;CXCL102.12E-05GO:0044421//extracellularregionpartENPP2;PAI-1;CHI3L1;APOA4;ORM2;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA1;LCN2;CRELD2;CXCL101.41E-04GO:0006955//immuneresponseENPP2;BCL6;IL1R1;ENSBTAP00000031029-D2;APOA4;IL18BP;SAA1;LCN2;CXCL102.4E-04

表7AR組60和90日齡差異表達(dá)基因最顯著富集的10個(gè)GO條目

Table 7Top 10 significantly enriched GO terms at 90ARvs60AR

GO號(hào)和條目GOIDandterms基因符號(hào)GenesymbolP值PvalueGO:0004522//pancreaticribonucleaseactivityRNASE12;ENSBTAP00000036091-D2;BRB8.63E-05GO:0004497//monooxygenaseactivityLOC537017;ENSBTAP00000050244-D2;CYP7A1;SQLE;CYP4F29.78E-05GO:0016892//endoribonucleaseactivity,produ-cing3-phosphomonoestersRNASE12;ENSBTAP00000036091-D2;BRB1.25E-04GO:0016894//endonucleaseactivity,activewitheitherribo-ordeoxyribonucleicacidsandprodu-cing3-phosphomonoestersRNASE12;ENSBTAP00000036091-D2;BRB2.65E-04GO:0008235//metalloexopeptidaseactivityDPEP1;CPM;CPXM14.31E-04GO:0016705//oxidoreductaseactivity,actingonpaireddonors,withincorporationorreductionofmolecularoxygenLOC537017;ENSBTAP00000050244-D2;CYP7A1;SQLE;CYP4F28.28E-04GO:0051787//misfoldedproteinbindingDNAJB9;DNAJC38.29E-04GO:0005506//ironionbindingCYP7A1;ENSBTAP00000050244-D2;HBA1;CYP4F2;LCN29.46E-04GO:0002020//proteasebindingPAI-1;IL1R1;LCN21.10E-03GO:0004521//endoribonucleaseactivityRNASE12;ENSBTAP00000036091-D2;BRB1.38E-03

表8ER組60和90日齡差異表達(dá)基因最顯著富集的10個(gè)GO條目

Table 8Top 10 significantly enriched GO terms at 90ERvs60ER

GO號(hào)和條目GOIDandterms基因符號(hào)GenesymbolP值PvalueGO:0005310//dicarboxylicacidtransmembranetransporteractivitySLC26A8;SLC13A3;SLC38A7;EAAT23.65E-07GO:0022892//substrate-specifictransporteractivityGABRG1;HBA1;SLC28A1;APOA4;SLC26A8;SLC13A3;LOC100509620;SLC38A7;EAAT21.72E-05GO:0004497//monooxygenaseactivityCYP51A1;LOC511498;SQLE;CYP4F2;MSMO13.72E-05GO:0022891//substrate-specifictransmembranetransporteractivityGABRG1;SLC28A1;SLC26A8;SLC13A3;LOC100509620;SLC38A7;EAAT26.08E-05GO:0015075//iontransmembranetransporteractivityGABRG1;SLC28A1;SLC26A8;SLC13A3;SLC38A7;EAAT21.54E-04GO:0016709//oxidoreductaseactivity,actingonpaireddonors,withincorporationorreductionofmolecularoxygen,NAD(P)Hasonedonor,andincorporationofoneatomofoxygenCYP51A1;SQLE;MSMO11.67E-04GO:0046943//carboxylicacidtransmembranetransporteractivitySLC26A8;SLC13A3;SLC38A7;EAAT21.73E-04GO:0005342//organicacidtransmembranetransporteractivitySLC26A8;SLC13A3;SLC38A7;EAAT22.08E-04GO:0008324//cationtransmembranetransporteractivitySLC28A1;SLC13A3;SLC38A7;EAAT22.21E-04GO:0008514//organicaniontransmembranetransporteractivitySLC26A8;SLC13A3;SLC38A7;EAAT22.48E-04

表960日齡AR組和ER組差異表達(dá)基因顯著富集的途徑

Table 9The significantly enriched pathways of DEGs at 60ARvs60ER

KEGG號(hào)和通路KEGGIDandpathway基因符號(hào)GenesymbolP值Pvalueko00260Glycine,serineandthreoninemetabolismLOC100297420;SDS;GNMT0.0014ko00380TryptophanmetabolismACMSD;AFMID;KMO0.0023ko00601Glycosphingolipidbiosynthesis-lactoandneolactoseriesB3GALT5;ST3GAL40.0092ko00270CysteineandmethioninemetabolismLOC100297420;SDS0.0214ko04973CarbohydratedigestionandabsorptionTFF2;SLC2A50.0214

表1090日齡AR組和ER組差異表達(dá)基因顯著富集的途徑

Table 10The significantly enriched pathways of DEGs at 90ARvs90ER

KEGG號(hào)和通路KEGGIDandpathway基因符號(hào)GenesymbolP值Pvalueko00140SteroidhormonebiosynthesisHSD17B14;ENSBTAP00000030543-D14;LOC7857620.0019ko00520Aminosugarandnucleotidesugarme-tabolismLOC537017;CHI3L1;AMIGO30.0078ko05146AmoebiasisSERPINI2;IL1R1;MCTP20.0159ko00480GlutathionemetabolismENSP00000420168-D2;AGR20.0295ko00982Drugmetabolism-cytochromeP450ENSP00000420168-D2;FMO50.0435ko04115p53signalingpathwayPAI-1;STEAP40.0446ko04080Neuroactiveligand-receptorinteractionGABRG1;S1PR3;GRIA1;ENSBTAP000000530180.0452

表11AR組60和90日齡差異表達(dá)基因顯著富集的途徑

Table 11The significantly enriched pathways of DEGs at 90ARvs60AR

KEGG號(hào)和通路KEGGIDandpathway基因符號(hào)GenesymbolP值Pvalueko00590ArachidonicacidmetabolismENSBTAP00000040874-D5;CYP4F2;LCN20.0076ko00520Aminosugarandnucleotidesugarme-tabolismLOC537017;CHI3L1;AMIGO30.0130ko00140SteroidhormonebiosynthesisCYP7A1;HSD17B20.0359ko04976BilesecretionCYP7A1;NR0B20.0412

表12ER組60和90日齡差異表達(dá)基因顯著富集的途徑

Table 12The significantly enriched pathways of DEGs at 90ERvs60ER

KEGG號(hào)和通路KEGGIDandpathway基因符號(hào)GenesymbolP值Pvalueko03320PPARsignalingpathwayCPT1B;PLIN2;GK;LOC100509620;RXRG0.0003ko00100SteroidbiosynthesisCYP51A1;SQLE;MSMO10.0014ko00900TerpenoidbackbonebiosynthesisENSBTAP00000036625;HMGCR0.0040ko00860PorphyrinandchlorophyllmetabolismALAS2;UGT2B150.0323ko00140SteroidhormonebiosynthesisUGT2B15;HSD17B20.0375ko00830RetinolmetabolismUGT2B15;LOC5114980.0488ko00980MetabolismofxenobioticsbycytochromeP450UGT2B15;LOC5114980.0503

3討論

基因芯片技術(shù)是研究差異表達(dá)基因的有效手段，在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了許多差異表達(dá)基因。60日齡時(shí)，代乳粉組和母乳組(60ARvs60ER)差異表達(dá)的基因有60個(gè)；90日齡時(shí)，代乳粉組和母乳組(90ARvs90ER)差異表達(dá)的基因有80個(gè)；代乳粉組中，60和90日齡相比(60ARvs90AR)差異表達(dá)的基因有102個(gè)；母乳組中，60和90日齡相比(60ERvs90ER)差異表達(dá)的基因有76個(gè)。

酸性糖蛋白(ORM2)主要在肝中合成，是炎癥反應(yīng)急性期的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，存在于人、大鼠、小鼠以及其他的哺乳動(dòng)物中。當(dāng)機(jī)體組織受到傷害、發(fā)生炎癥或受到感染，酸性糖蛋白的濃度會(huì)相應(yīng)的升高[18]。本研究中，ORM2基因在不同的處理組之間以及不同的日齡中，其表達(dá)均發(fā)生了改變。60日齡時(shí)，ORM2在AR組中下調(diào)表達(dá)；90日齡時(shí)，ORM2在AR組中上調(diào)表達(dá)。說明飼喂代乳粉能夠增強(qiáng)羔羊免疫力和對外界惡劣環(huán)境的抵抗力。斷奶后，羔羊的抵抗力降低。X.Zhang 等[19]對人類結(jié)直腸癌的研究表明，ORM2基因的選擇性表達(dá)使其成為診斷腸癌的一個(gè)潛在的生物標(biāo)記基因。載脂蛋白A4(APOA4)主要在哺乳動(dòng)物的小腸中表達(dá)，在小鼠和大鼠的肝中也有表達(dá)。載脂蛋白合成后分泌到血液中吸附在新生成的乳糜微粒的表面。脂肪在小腸的吸收能夠促進(jìn)APOA4的合成和分泌。本試驗(yàn)中，APOA4在60日齡時(shí)表達(dá)上調(diào)，在90日齡時(shí)表達(dá)下調(diào)。說明60日齡時(shí)，脂肪的吸收比較充分。斷奶后，脂肪的吸收相對下降，這也說明代乳粉的脂肪含量比后期的母乳要充足，能夠滿足羔羊的生長需要。在體外試驗(yàn)中，APOA4能夠激活卵磷脂-膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶和膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白[20]。磷酸神經(jīng)胺受體3(S1PR3)是G蛋白偶聯(lián)受體EDG受體家族成員之一，可能的功能是調(diào)節(jié)血管再生和血管內(nèi)皮細(xì)胞[21]。5-羥色胺受體4(HTR4)是G蛋白偶聯(lián)受體5-羥色胺受體家族成員之一，能夠與5-羥色胺結(jié)合刺激cAMP的產(chǎn)生。該受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中合成一種糖基化的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠調(diào)節(jié)許多神經(jīng)傳遞素的釋放。神經(jīng)胺和5-羥色胺都是機(jī)體內(nèi)神經(jīng)活性物質(zhì)，在本試驗(yàn)中，在60和90日齡時(shí)，AR組的表達(dá)較ER組均上調(diào)，說明羔羊的神經(jīng)活動(dòng)在加強(qiáng)，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育比較活躍，代乳粉能促進(jìn)羔羊神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子2(EAAT2)是蛋白質(zhì)溶質(zhì)運(yùn)載體家族成員之一，能夠清除中樞神經(jīng)細(xì)胞樹突周圍的興奮性傳遞素谷氨酸鹽。谷氨酸鹽的清除有利于特定樹突的激活，并能夠防止谷氨酸過多的與受體結(jié)合造成神經(jīng)損傷。EAAT2的上調(diào)表達(dá)能夠修補(bǔ)精神分裂癥患者的前脈沖抑制[22]，有些抗神經(jīng)藥物能夠降低EAAT2的表達(dá)[23]。在本試驗(yàn)中，無論是在AR組還是在ER組，90日齡時(shí)EAAT2的表達(dá)都比60日齡時(shí)上調(diào)，說明在這段時(shí)間中，羔羊的神經(jīng)活動(dòng)比較活躍，需要更多的EAAT2來清除谷氨酸鹽以保證神經(jīng)功能的正常發(fā)揮。MFSD2A在血管中表達(dá)行程血腦屏障，該基因的敲除使緊密連接受到破壞，從而增加血腦屏障的通透性[24]。MFSD2A在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中嚴(yán)格的低表達(dá)，可以作為肺癌細(xì)胞抑制子[25]。

4結(jié)論

本研究采用Affymetrix芯片篩選了不同的培育方式下羔羊肝組織的差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因主要參與氨基酸、小分子化合物和有機(jī)酸代謝的生物過程、酶活性反應(yīng)過程、免疫反應(yīng)過程以及氨基酸代謝、脂類代謝、激素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這些代謝途徑和信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)能夠?yàn)檠芯肯嚓P(guān)基因在幼齡反芻動(dòng)物肝組織中的作用提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]FODOR S P，READ J L，PIRRUNG M C，et al.Light-directed，spatially addressable parallel chemicalsynthesis[J].Science，1991，251(4995)：767-773.

[2]SOUTHERN E M，CASE-GREEN S C，ELDER J K，et al.Arrays of complementary oligonucleotides for analysing the hybridisation behaviour of nucleic acids[J].NucleicAcidsRes， 1994，22(8)：1368-1373.

[3]馮永強(qiáng)，閻小君，蘇成芝.基因芯片技術(shù)[J].國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊，2000，22(1)：1-5.

FENG Y Q，YAN X J，SU C Z.Gene chip technology[J].JournalofMedicalMolecularBiology，2000，22(1)：1-5.(in Chinese)

[4]YAO J，BURTON J L，SAAMA P，et al.Generation of EST and cDNA microarray resources for the study of bovine immunobiology[J].ActaVetScand，2001，42(3)：391-405.

[5]HERATH C B，SHIOJIMA S，ISHIWATA H，et al.Pregnancy-associated changes in genome-wide gene expression profiles in the liver of cow throughout pregnancy[J].BiochemBiophysResCommun，2004，313(3)：666-680.

[6]EVERTS R E，BAND M R，LIU Z L，et al.A 7872 cDNA microarray and its use in bovine functional genomics[J].VetImmunolImmunopathol，2005，105(3-4)：235-245.

[7]RAINARD P，RIOLLET C.Innate immunity of the bovine mammary gland[J].VetRes，2006，37(3)：369-400.

[8]JONES K L，KING S S，IQBAL M J.Endophyte-infected tall fescue diet alters gene expression in heifer luteal tissue as revealed by interspecies microarray analysis[J].MolReprodDev，2004，67(2)：154-161.

[9]WANG Y H，BYRNE K A，REVERTER A，et al.Transcriptional profiling of skeletal muscle tissue from two breeds of cattle[J].MammGenome，2005，16(3)：201-210.

[10]LOOR J J，BIONAZ M，DRACKLEY J K.Systems physiology in dairy cattle：Nutritional genomics and beyond[J].AnnuRevAnimBiosci， 2013，1：365-392.

[11]文欽.基于雙生子研究證候差異的甲基化調(diào)控[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

WEN Q.The study of syndrome differences in methylation egulation based on twins[D].Chengdu:Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，2011.(in Chinese)

[12]屠焰，刁其玉，岳喜新.一種0-3月齡羔羊的代乳品及其制備方法[P].2013-01-30.

TU Y，DIAO Q Y，YUE X X.A kind of milk replacer and its formula for lambs aged 0 to 3 months[P].2013-01-30.(in Chinese)

[13]岳喜新，刁其玉，馬春暉，等.早期斷奶羔羊代乳粉飼喂水平對營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝及血清生化指標(biāo)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(21)：4464-4473.

YUE X X，DIAO Q Y，MA C H，et al.Effects of feeding levels of a milk replacer on digestion and metabolism of nutrients and serum biochemical indexes in lambs[J].ScientiaAgriculturaSinica，2011，44(21)：4464-4473.(in Chinese)

[14]IRIZARRY R A，HOBBS B，COLLIN F，et al.Exploration，normalization，and summaries of high density oligonucleotide array probe level data[J].Biostatistics， 2003，4(2)：249-264.

[15]AUDIC S，CLAVERIE J M.The significance of digital gene expression profiles[J].GenomeRes，1997，7(10)：986-995.

[16]BENJAMINI Y，YEKUTIELI D.The control of the false discovery rate in multiple testing under dependency[J].AnnStat，2001，29(4)：1165-1188.

[17]高媛媛.奶牛泌乳啟動(dòng)過程乳腺組織基因和蛋白表達(dá)研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

GAO Y Y.Bovine mammary gene and protein expression profiling during the onset of lactation[D].Tai'an:Shandong Agricultural University，2013.(in Chinese)

[18]FOURNIER T，MEDJOUBI-N N，PORQUET D.Alpha-1-acid glycoprotein[J].BiochimBiophysActa， 2000，1482(1-2)：157-171.

[19]ZHANG X，XIAO Z，LIU X，et al.The potential role of ORM2 in the development of colorectal cancer[J].PLoSOne，2012，7(2):e31868.

[20]KIM Y S，GU B H，CHOI B C，et al.Apolipoprotein A-IV as a novel gene associated with polycystic ovary syndrome[J].IntJMolMed，2013，31(3)：707-716.

[21]AN S Z，ZHENG Y H，BLEU T.Sphingosine 1-phosphate-induced cell proliferation，survival，and related signaling events mediated by G protein-coupled receptors Edg3 and Edg5[J].JBiolChem，2000，275(1)：288-296.

[22]BELLESI M，MELONE M，GUBBINI A，et al.GLT-1 upregulation impairs prepulse inhibition of the startle reflex in adult rats[J].Glia，2009，57(7)：703-713.

[23]SCHMITT A，ZINK M，PETROIANU G，et al.Decreased gene expression of glial and neuronal glutamate transporters after chronic antipsychotic treatment in rat brain[J].NeurosciLett， 2003，347(2)：81-84.[24]BEN-ZVI A，LACOSTE B，KUR E，et al.Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier[J].Nature， 2014，509(7501)：507-511.

[25]SPINOLA M，F(xiàn)ALVELLA F S，COLOMBO F，et al.MFSD2A is a novel lung tumor suppressor gene modulating cell cycle and matrix attachment[J].MolCancer，2010，9:62.

(編輯郭云雁)

Effect of Different Rearing Systems on Hepatic Gene Expression of Early Weaned Hu Twin Lambs

WANG Hai-chao，ZHANG Nai-feng，CHAI Jian-min，WANG Bo，DIAO Qi-yu*

(KeyLaboratoryofFeedBiotechnologyofMinistryofAgriculture，F(xiàn)eedResearchInstitute，>ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China)

Abstract:This experiment was conducted to study the effect of different rearing systems on hepatic gene expression in twin lambs.Twenty-four pairs of Hu male twin lambs were equally divided into 2 groups.Twenty-four subjects were artificially reared(AR) with milk replacer after 7 days colostrum while 24 others were ewe reared(ER) with mother milk as control.All lambs were weaned at day 60 and then fed with starter till day 90.When the lambs reached 60 and 90 days old，three pairs of twin lambs at each time point were slaughter to collect liver samples.Hepatic gene expression were analyzed via microarray and bioinformatics method.We found many differentially expressed genes(DEGs).They wereOR1E2，S1PR3，KMO，APOA4，ORM2，HTR4，F(xiàn)ADS1 in both 60ARvs60ER and 90ARvs90ER，andACO1，HBA1，MFSD2A，CYSJ，LOC785954，F(xiàn)CN，GRB2，LOC100037663，ORM2，RXRG，LOC100602447，SQLE，HSD17B2，CYP4F2，INHBE，EAAT2 in both 60ARvs90AR and 60ERvs90ER，among which 4 unknown genes were identified with the probe ID 14780690，14815720，14845504，14854080.ORM2 was differentially expressed among all the comparisons.Those DEGs involved in the amino acid metabolism，small molecular metabolism，enzyme activities and immune response of GO process and amino acid metabolism，lipid metabolism，hormone biosynthesis and signaling transductions of KEGG pathways.In summary，different rearing systems altered hepatic gene expression.The pathways and functions those DEGs involved in could shed lights on the mechanisms of early cultivation of lambs.

Key words:twin lambs；early weaning；milk replacer；differentially expressed gene；genechip

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.013

收稿日期：2015-05-05

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303143)；國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-39)

作者簡介：王海超(1990-)，男，河北臨漳人，碩士生，主要從事反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)研究，E-mail：qiusuoba@163.com *通信作者：刁其玉，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail：diaoqiyu@caas.cn

中圖分類號(hào)：S826；S815.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0733-12