白絨山羊PPARγ基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖分化的影響

杜　琛，李金泉，陳秀娟*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

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白絨山羊PPARγ基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖分化的影響

杜琛1，李金泉2*，陳秀娟1*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

摘要：本研究以絨山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞為試驗(yàn)材料，通過靶向阻斷過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ基因，建立穩(wěn)定干擾的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞株，探討絨山羊PPARγ基因在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖和分化過程中的功能。采用慢病毒質(zhì)粒包裝系統(tǒng)構(gòu)建特異靶向白絨山羊PPARγ基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi )慢病毒載體，用以建立PPARγ基因穩(wěn)定沉默的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞株。利用實(shí)時(shí)定量和Western blot 方法檢測PPARγ基因在干擾組和對照組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，并通過MTT和油紅O染色法研究絨山羊PPARγ基因?qū)?nèi)脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響。經(jīng)測序證實(shí)合成的含PPARγ-shRNA慢病毒載體寡核苷酸鏈插入正確，對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的感染效率為80%以上，熒光定量和Western blot檢測慢病毒介導(dǎo)的shRNA可以有效降低PPARγ的表達(dá)，其mRNA和蛋白水平作用的時(shí)間相隔24 h。沉默PPARγ基因后，脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三脂的濃度明顯低于對照組，相反MTT檢測干擾組中細(xì)胞增殖能力高于對照組。本研究構(gòu)建了絨山羊shRNA-PPARγ慢病毒干擾載體，成功轉(zhuǎn)染至肌內(nèi)脂肪細(xì)胞后可明顯抑制脂肪細(xì)胞的分化，而促進(jìn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的增殖，為進(jìn)一步研究PPARγ基因在絨山羊脂肪細(xì)胞代謝通路中的作用及脂肪沉積機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：肌內(nèi)脂肪細(xì)胞；RNA干擾；PPARγ

肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat，IMF)是脂肪沉積的一種主要形式，具有一般脂肪所具有的特點(diǎn)。肌內(nèi)脂肪直接參與了肉質(zhì)嫩度、風(fēng)味和多汁性的形成[1]。脂肪細(xì)胞是研究脂肪形成的理想模型，體外培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞不僅能完整的認(rèn)識(shí)脂肪組織發(fā)生、增殖和分化的全過程，同時(shí)可以直接觀察各種因素在整個(gè)生成過程中的規(guī)律，因此調(diào)控脂肪沉積并改善動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。

脂肪細(xì)胞的分化是在多種轉(zhuǎn)錄因子的精細(xì)調(diào)控下完成的，在此過程中逐步表達(dá)那些能量合成代謝過程中相關(guān)的功能蛋白，其中最主要的分化轉(zhuǎn)錄因子是過氧化物酶體增殖物激活受體(Proxisome proliferators activated receptor，PPARs)，屬于核內(nèi)類固醇激素受體超家族，在調(diào)節(jié)脂肪分化、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程中起重要作用。PPARs分為3種不同的亞型，即PPARα、β、γ，具有組織特異性。其中PPARγ在脂肪分化和發(fā)育的過程中起到分子開關(guān)的作用，與C/EBPs家族和SREBPs家族協(xié)同作用，調(diào)控其靶基因的表達(dá)[2-7]。

RNAi技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種基因阻斷技術(shù)，可以高效特異的阻斷基因表達(dá)[8]。RNA干擾的有效性主要受基因載體轉(zhuǎn)移效率的制約，目前最常見的哺乳動(dòng)物載體是慢病毒表達(dá)載體(Lentivirus)，它可以高效轉(zhuǎn)染任何一種細(xì)胞[9]。因此，本研究通過構(gòu)建PPARγ基因的小發(fā)夾RNA(Short hairp in RNA，shRNA)慢病毒載體并進(jìn)行包裝鑒定，篩選得到穩(wěn)定株，進(jìn)一步研究PPARγ沉默后對脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響。

1材料與方法

1.1材料

本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的內(nèi)蒙古白絨山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞[10]、293T細(xì)胞、慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞、大腸桿菌菌株DH5a、pHBLV-U6-Puro(目的片段插入BamH I，EcoR I酶切位點(diǎn)，由U6啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)，該慢病毒載體中含有PGK啟動(dòng)子調(diào)控的Puro抗性基因表達(dá))質(zhì)粒。

1.2PPARγ-shRNA載體的構(gòu)建和鑒定

在GenBank中查到山羊過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARs)(登錄號(hào)JQ266369.1)的mRNA序列，從起始密碼子下游75 bp處開始，長度為19～25 nt，GC含量為30%～50%的且與其他基因無明顯同源性的序列作為siRNA靶點(diǎn)序列，序列為5′-GGGAAAGACGACAGACAAATT-3′，以靶點(diǎn)序列為正義鏈，互補(bǔ)鏈為反義鏈。并構(gòu)建到shRNA中，序列：5′-GGGGAAAGACGACAGACAAAT-TTTCAAGAGAAATTTGTCTGTCGTCTTTCC-CTTTTTT-3′；5′-AAAAAAGGGAAAGACGAC-AGACAAATTTCTCTTGAAAATTTGTCTGT-CGTCTTTCCCC-3′。把合成的上下游引物溶解于退火緩沖液中，與經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切的pHBLV-U6-Puro載體連接，形成重組質(zhì)粒pLVX-puro-PPARγ-shRNA。然后用一步法轉(zhuǎn)化DH5α菌，挑選陽性克隆，將菌液送上海桑尼公司測序。

1.3慢病毒的包裝和濃縮

對293T細(xì)胞復(fù)蘇傳代，細(xì)胞長至80%～90% 即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按順序加入10 μg pspax，10 μg pMD2G，10 μg pLVXpuro-PPARg-shRNA。轉(zhuǎn)染后12～24 h，將培養(yǎng)基棄去，加入10 mL 10% DMEM開始收集病毒。0.45 μm濾器過濾，7 200 r·min-1離心120 min，之后用500 mL PBS重懸病毒沉淀，置于4 ℃保存。

1.4目的細(xì)胞慢病毒感染

將細(xì)胞鋪盤于6孔板，每孔為5×105個(gè)細(xì)胞，每孔加入MOI=30慢病毒pLVX-puro-PPARγ-shRNA，24 h后換液。48 h后，換以含有2 μg·mL-1的puromycin的培液繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長穩(wěn)定之后，可以進(jìn)行細(xì)胞傳代，2代之后無需加puromycin培養(yǎng)，建系完成。一部分細(xì)胞用于保種，另一部分細(xì)胞用于后續(xù)驗(yàn)證。

1.5基因表達(dá)的檢測及數(shù)據(jù)處理

1.5.1熒光定量檢測PPARγ的mRNA表達(dá)水平根據(jù)GenBank中登錄的山羊過氧化物增殖物激活受體(Perixusome Proliferatoractivated receptors，PPARs)，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物F：5′-CCGGAGGACGATCAGATTG-3′，R：5′-CGCCCAAACCTGATGGCAT-3′ 由上海生工生物工程有限公司合成。所有試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Graph Pad Prism 5統(tǒng)計(jì)分析軟件中的One-way ANOVA 進(jìn)行方差分析，顯著性水平為P<0.05。

1.5.2Western blot檢測PPARγ的表達(dá)水平將篩選得到沉默的PPARγ穩(wěn)定株分入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，檢測siRNA對PPARγ蛋白表達(dá)的沉默效率。所有試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)，使用Genpro32分析軟件檢測PPARγ在不同時(shí)間點(diǎn)蛋白條帶灰度，以β-actin為參照。

2結(jié)果

2.1載體測序結(jié)果

pHBLV-U6-Puro質(zhì)粒載體使用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，之后進(jìn)行回收擴(kuò)增，并連接形成重組質(zhì)粒pLVX-puro-PPARγ-shRNA。測序結(jié)果表明，合成的 PPARγ-shRNA核苷酸序列插入正確，中間為產(chǎn)生針對靶基因的 shRNA寡核苷酸(圖1)。

2.2PPARγ-shRNA干擾組轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

將測序驗(yàn)證后的PPARγ慢病毒載體質(zhì)粒系統(tǒng)，pspax2、pMD2G、和pLVXpuro-PPARg-shRNA共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效果如圖2所示，有80%以上的細(xì)胞帶有綠色熒光標(biāo)記，說明慢病毒載體成功轉(zhuǎn)至293T細(xì)胞中，可以用于后續(xù)慢病毒的大量包裝。

2.3慢病毒轉(zhuǎn)染絨山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞

將細(xì)胞分為3組：未處理的細(xì)胞為空白對照組(WT)，空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陰性對照組(NC)，慢病毒載體pLVX-puro-PPARγ-shRNA轉(zhuǎn)染的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞為轉(zhuǎn)染組(SH)。觀察轉(zhuǎn)染組細(xì)胞未出現(xiàn)大面積漂浮的死細(xì)胞，說明慢病毒載體構(gòu)建成功，得到細(xì)胞穩(wěn)定株(圖3)。

2.4Real-time檢測干擾后PPARγ基因在脂肪細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況

實(shí)時(shí)定量檢測結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)染組PPARγmRNA表達(dá)量在干擾24～72 h顯著低于空白組(WT)和陰性對照組(NC)(P<0.05)，其中在24 h干擾效果最為明顯?？瞻捉M和對照組間PPARγmRNA表達(dá)量無顯著差異(圖4)。

2.5Western blot檢測干擾后PPARγ蛋白在脂肪細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況

Western blot檢測結(jié)果證實(shí)，干擾組PPARγ在48 和72 h蛋白表達(dá)量顯著低于對照組 (P<0.05)(圖5)。使用Genpro32分析軟件檢測PPARγ在不同時(shí)間點(diǎn)蛋白條帶灰度，以β-actin為參照(圖6)。

2.6下調(diào)PPARγ基因表達(dá)量對絨山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖的影響

利用MTT法檢測PPARγ基因表達(dá)量降低后脂肪細(xì)胞的增殖情況。干擾時(shí)間點(diǎn)記為0點(diǎn)，在干擾后每隔12 h分別對干擾組和對照組的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖7所示，干擾后0～24 h干擾組和陰性對照組無顯著差異，干擾后36～72 h干擾組細(xì)胞增殖能力明顯高于陰性對照組。

2.7下調(diào)PPARγ基因表達(dá)量對絨山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的影響

利用油紅O染色的方法，提取萃取液，OD510 nm檢測PPARγ基因表達(dá)量下降后脂肪細(xì)胞中甘油三酯含量的變化。干擾時(shí)間點(diǎn)記為0點(diǎn)，干擾后每隔12 h分別對干擾組和陰性對照組的細(xì)胞分化情況進(jìn)行檢測。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，干擾組中被染色液附著的紅色脂滴與陰性對照組相比明顯減少(圖8)。分光光度計(jì)檢測干擾12～72 h，干擾組中細(xì)胞分化能力顯著低于對照組(P<0.05)(圖9)。

圖1　PPARγ-shRNA的測序結(jié)果Fig.1　Sequencing result of PPARγ-shRNA

A.pLVX-puro-PPARg-shRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；B.pLVX-puro-PPARg-shRNA 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光圖A.pLVX-puro-PPARg-shRNA transfected 293T cell；B.pLVX-puro-PPARg-shRNA transfected 293T cell圖2　慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞熒光圖 200×Fig.2　Lentiviral vector transfected 293T cells 200×

A.未處理的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞；B.空載體轉(zhuǎn)染的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞；C.慢病毒轉(zhuǎn)染的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞A.Intramuscular adipocytes untreated；B.Empty vector transfected intramuscular fat cells；C.Lentivirus vector transfectd intramuscular adipocytes圖3　慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肌內(nèi)脂肪細(xì)胞 200×Fig.3　Lentiviral vector transfected intramuscular adipocytes 200×

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6同Different letters indicate significant difference (P<0.05).The same as Figure 6圖4　Real-time PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)PPARγ基因在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量Fig.4　Real-time PCR detected PPARγ gene expression levels at different time in adipocytes

1～3.空白組24、48、72 h；4～6：陰性對照組24、48、72 h；7～9.干擾組24、48、72 h1-3.Blank group 24，48，72 h；4-6.Negative conrtol group 24，48，72 h；7-9.RNAi group 24，48，72 h圖5　Western bolt檢測各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞蛋白PPARγ表達(dá)量Fig.5　The expression of PPARγ detected by Western blot

1～3.對照組24、48、72 h蛋白表達(dá)量；4～6.干擾組24、48、72 h蛋白表達(dá)量1-3.Negative control group protein expression at 24，48，72 h；4-6.RNAi group protein expression at 24，48，72 h圖6　PPARγ蛋白表達(dá)量相對灰度值Fig.6　The results of the relative density of PPARγ protein expression

3討論

基因沉默是指通過各種方式，在不影響宿主基因組DNA的情況下使特定基因不表達(dá)或是低表達(dá)的現(xiàn)象。一種是轉(zhuǎn)錄水平的沉默，另一種是轉(zhuǎn)錄后水平的沉默。RNAi則屬于后者，在進(jìn)化水平上是高度保守的，由雙鏈RNA誘發(fā)的，特異性降解同源mRNA的現(xiàn)象。如果需要長期抑制基因和蛋白的表達(dá)，需要shRNA表達(dá)載體。目前實(shí)驗(yàn)室常用的載體分為兩類，一類質(zhì)粒載體，另一類是病毒載體。質(zhì)粒載體會(huì)隨著載體復(fù)制擴(kuò)增，抑制效果可以隨細(xì)胞傳代傳遞下去，但會(huì)受到細(xì)胞類型的影響。病毒載體又分為腺病毒載體和慢病毒載體等。腺病毒可以高效干擾多種細(xì)胞株，但不能長期穩(wěn)定的表達(dá)shRNA。慢病毒載體是人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)來源的一種病毒載體,目前廣泛應(yīng)用于基因功能的研究及基因沉默生物模型的制備[11-14]。與其他載體相比，其優(yōu)勢在于轉(zhuǎn)染率高且不受細(xì)胞周期的影響；可以直接整合到染色體，很少發(fā)生炎癥和毒性反應(yīng)，本研究中構(gòu)建的慢病毒載體pLVX-puro-PPARγ-shRNA轉(zhuǎn)染肌內(nèi)脂肪細(xì)胞后未出現(xiàn)大面積細(xì)胞漂浮死亡的現(xiàn)象，載體構(gòu)建成功，得到細(xì)胞穩(wěn)定株。研究報(bào)道，慢病毒載體可以同時(shí)兼容多個(gè)啟動(dòng)子，抑制多個(gè)基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率可以高達(dá)80%～100%，本研究構(gòu)建的白絨山羊shRNA干擾載體轉(zhuǎn)染效率在80%以上，可以用于后續(xù)大規(guī)模包裝使用?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，慢病毒載體技術(shù)在RNA干擾中的應(yīng)用也越來越廣泛，逐漸從實(shí)驗(yàn)室走向了臨床應(yīng)用。

*.P<0.05.The same as Figure 9圖7　PPARγ基因表達(dá)量下降后絨山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的增殖情況Fig.7　Proliferation of intramuscular adipocytes after the PPARγ gene expression levels decreased

A．陰性對照組；B.干擾組A.Negative control group；B.RNAi group圖8　油紅O染色肌內(nèi)脂肪細(xì)胞 200×Fig.8　Oil Red O staining result of intramuscular adipocytes 200×

圖9　PPARγ基因表達(dá)量下降后絨山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化情況Fig.9　Differentiation of intramuscular adipocytes after the expression of PPARγ gene decreased

脂肪細(xì)胞作為糖代謝和脂代謝關(guān)鍵的調(diào)節(jié)器，是研究肥胖及其多種代謝并發(fā)癥如糖尿病、高血壓的理想模型。從育種角度來看，了解脂肪沉積機(jī)理及規(guī)律可為提高肌內(nèi)脂肪含量和改善肉品品質(zhì)提供理論依據(jù)。有研究證明，PPARγ是多功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與脂肪生成和免疫調(diào)控等[15]。許多試驗(yàn)證明類固醇類物質(zhì)可以促進(jìn)骨髓間質(zhì)細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)，上調(diào)PPARγ基因的表達(dá)量可以誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞向脂肪分化方向發(fā)展，促進(jìn)脂質(zhì)的積累，同時(shí)降低骨源性細(xì)胞的分化[16-18]。P.Tontonoz等[19]研究PPARγ可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。另外，PPARγ作為主要的調(diào)控因子可正向調(diào)節(jié)另一轉(zhuǎn)錄因子C/EBPa的啟動(dòng)，其蛋白可以調(diào)節(jié)許多參與糖代謝和脂代謝中關(guān)鍵基因的表達(dá)。R.A.Hegele等[20]研究人類PPARγ基因雜合子突變出現(xiàn)機(jī)體脂肪分布異常，胰島素抗性和高血脂等代謝紊亂癥。所以本研究通過慢病毒介導(dǎo)高效率轉(zhuǎn)染，構(gòu)建穩(wěn)定干擾PPARγ基因的細(xì)胞株，進(jìn)而揭示PPARγ在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中的確切功能，為開拓基因治療提供了一條嶄新途徑。慢病毒載體本身不在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，不會(huì)導(dǎo)致寄主細(xì)胞的死亡，可以根據(jù)注入慢病毒載體不同劑量，調(diào)節(jié)PPARγ的干擾效率。

實(shí)時(shí)定量和Western blot是目前對于RNAi干擾效果最為便捷的檢測方法，分別從基因和蛋白角度對其進(jìn)行全面分析。因?yàn)榛虺聊瑢?dǎo)致的后果是多種多樣，RNAi有可能導(dǎo)致 mRNA水平的降低，也有可能是蛋白水平的改變，從而造成表型和功能的變化。本研究在轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞0～72 h內(nèi)每隔24 h收集細(xì)胞進(jìn)行Real-time和Western blot檢測，在干擾24～72 h后，干擾組PPARγ基因mRNA水平顯著低于對照組，干擾效果顯著，慢病毒體穩(wěn)定抑制了基因的表達(dá)。有趣的是，在RNAi試驗(yàn)中有時(shí)候發(fā)現(xiàn)沉默的目的基因在mRNA水平?jīng)]有發(fā)生顯著性改變，這就需要進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行驗(yàn)證，這是因?yàn)樵诟蓴_過程中siRNA是通過microRNA的作用方式在不影響mRNA表達(dá)水平的基礎(chǔ)上直接調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)。本研究中對轉(zhuǎn)染細(xì)胞24～72 h進(jìn)行蛋白檢測，在24 h檢測PPARγ蛋白在干擾組和對照組中無明顯差別，而在48和72 h干擾組中PPARγ蛋白表達(dá)量明顯降低，說明PPARγ-shRNA慢病毒感染脂肪細(xì)胞后能夠在蛋白水平抑制PPARγ的表達(dá)。通過Real-time檢測顯著抑制時(shí)間點(diǎn)是轉(zhuǎn)染后24 h，而蛋白檢測則為轉(zhuǎn)染后48 h，可能是由于PPARγ在絨山羊脂肪細(xì)胞中首先表現(xiàn)在mRNA水平的降低，其次是蛋白水平的改變，兩者之間有時(shí)間上的先后順序。

MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，PPARγ的表達(dá)量降低后，OD490 nm檢測干擾組細(xì)胞從36～72 h增殖能力增強(qiáng)，顯著高于對照組。OD510 nm檢測干擾組細(xì)胞從24～72 h分化能力減弱，顯著低于對照組，這與染色結(jié)果相一致。即PPARγ基因有促進(jìn)絨山羊肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞分化，抑制增殖的作用，這一結(jié)果與王麗[21]等人的發(fā)現(xiàn)相一致。

4結(jié)論

本研究成功構(gòu)建PPARγ-shRNA慢病毒載體，并將慢病毒載體轉(zhuǎn)染絨山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞后，篩選得到穩(wěn)定株。熒光定量和Western blot檢測慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA 可以有效的降低肌內(nèi)脂肪細(xì)胞PPARγ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其mRNA水平和蛋白水平的作用時(shí)間相隔24 h。RNAi技術(shù)沉默肌內(nèi)脂肪細(xì)胞PPARγ基因后能明顯降低脂肪細(xì)胞甘油三酯的合成，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的增殖。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]WOOD J D，ENSER M，F(xiàn)ISHER A V，et al.Fat deposition，fatty acid composition and meat quality：A review[J].MeatSci，2008，78(4)：343-358.

[2]MUELLER E.Understanding the variegation of fat：Novel regulators of adipocyte differentiation and fat tissue biology[J].BiochimBiophyActa，2014，1842(3)：352-357.

[3]CRISAFULLI C，CUZZOCREA S.The role of endogenous and exogenous ligands for the peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPAR-alpha) in the regulation of inflammation in macrophages[J].Shock，2009，32(1)：62-73.

[4]PYPER S R，VISWAKARMA N，YU S，et al.PPARalpha：energy combustion，hypolipidemia，inflammation and cancer[J].NuclReceptSignal，2010，8：e002.

[5]SHUII S，OLSON P，SEARS D D，et al.PPARγ activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization[J].ProcNatlAcadSciUSA，2009，106(52)：22504-22509.

[6]SCHUPP M，LAZAR M A.Endogenous ligands for nuclear receptors：digging deeper[J].JBiolChem，2010，285(52)：40409-40415.

[7]MEI C L，HE P，CHENG B，et al.Chlamydia pneumoniae induces macrophage-derived foam cell formation via PPARα and PPARγ-dependent pathways[J].CellBiolInt，2009，33(3)：301-308.

[8]MITTAL V.Improving the efficiency of RNA interference in mammals[J].NatRevGenet，2004，5(5)：355-365.

[9]LOIS C，HONG E J，PEASE S，et al.Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors[J].Science，2002，295(5556)：868-872.

[10]杜琛，付紹印，韓志玲，等.絨山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44(10)：1532-1538.

DU C，F(xiàn)U S Y，HAN Z L，et al.Gene expression analysis on intramuscular preadipocytes in the cashmere goats[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(10)：1532-1538.(in Chinese)

[11]MUELLER S，GAUSSON V，VODOVAR N，et al.RNAi-mediated immunity provides strong protection against the negative-strand RNA vesicular stomatitis virus in Drosophila[J].ProcNatlAcadSciUSA， 2010，107(45)：19390-19395.

[12]BRACKENY D E，SCOTT J C，SAGAWA F，et al.C6/36 aedes albopictus cells have a dysfunctional antiviral RNA interference response[J].PLoSNeglTropDis，2010，4(10)：e856.

[13]LéGER P，LARA E，JAGLA B，et al.Dicer-2-and Piwi-mediated RNA interference in Rift Valley fever virus-infected mosquito cells[J].JVirol， 2013，87(3)：1631-1648.

[14]CHARLEY P A，WILUSZ J.Sponging of cellular proteins by viral RNAs[J].CurrOpinVirol，2014，9：14-18.

[15]KLIEWER S A，MANGELSDORF D J.Fibroblast growth factor 21：from pharmacology to physiology[J].AmJClinNutr，2010，91(1)：254S-257S.

[16]AHMADIAN M，DUCAN R E，SUL H S.The skinny on fat：lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes[J].TrendsEndocrinolMetab，2009，20(9)：424-428.

[17]SUGII S，OLSON P，SEARS D D，et al.PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization[J].ProcNatlAcadSciUSA，2009，106(52)：22504-22509.

[18]王義生，王小剛，李月白，等.靶向PPARγ基因RNA干擾對激素抑制家兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，44(2)：275-279.

WANG Y S，WANG X G，LI Y B，et al.Effects of RNAi for target on PPARγ to mainta in osteogenic differentiation of MSCs of rabbit suppressed by steroid[J].JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences)，2009，44(2)：275-279.(in Chinese)

[19]TONTONOZ P，HU E，GRACES R A，et al.mPPAR gamma 2：tissue-specific regulator of an adipocyte enhancer[J].GenesDev，1994，8(10)：1224-1234.

[20]HEGELE R A，POLLEX R L.Genetic and physiological insights into the metabolic syndrome[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol，2005，289(3)：R663-R669.

[21]王麗，那威，王宇祥，等.雞PPARγ 基因的表達(dá)特性及其對脂肪細(xì)胞增殖分化的影響[J].遺傳，2012，34(5)：454-464.

WANG L，NA W，WANG Y X，et al.Characterization of chickenPPARγ expression and its impact on adipocyte proliferation and differentiation[J].Hereditas(Beijing)，2012，34(5)：454-464.(in Chinese)

(編輯郭云雁)

Construction of Lentiviral RNAi Vector of PPARγ Gene in Cashmere Goat and Its Effect on Proliferation and Differentiation of Intramuscular Adipocytes

DU Chen1，LI Jin-quan2*，CHEN Xiu-juan1*

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology，AffiliatedHospital，InnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010050，China；2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductionofInnerMongoliaAutonomousRegion，CollegeofAnimalScience，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China)

Abstract:The cashmere-goat intramuscular adipocytes were used as experimental materials，and aimed to establish the stable intramuscular adipocyte line for the interference through target interrupting the peroxisome proliferation-activated receptor(PPARγ) gene，so as to explore the function of cashmere-goatPPARγgene during the proliferation and differentiation processes of the intramuscular adipocytes.Lentivirural plasmids pack-aging system was adopted to establish a lentiviral vector for RNA interference of specific targeting White Cashmere-goatPPARγgene，which was used to establish the intramuscular adipocyte line to stabilize and silence thePPARγgene.Real-time quantitative and Western blot methods were used to detect the expression ofPPARγgene at different points in time in the interference group and control group，as well as the MTT and Oil Red O Staining methods were used to research the influence of cashmere-goatPPARγgene on the proliferation and differentiation of intramuscular adipocytes.It was confirmed by sequencing that oligonucleotide chains containing PPARγ-shRNA lentivirus vector were inserted properly，its infection efficiency to intramuscular adipocytes was above 80%，lentivirus-mediated shRNA detected by fluorescence quantitative and Western blot could effectively reduce the expression ofPPARγgene，the reaction time interval between mRNA and protein level was 24 h.After silencing ofPPARγgene，the concentration of triglyceride within adipocytes was significantly lower than that in the control group；Contrarily，the cell proliferation ability in MTT test interference group was higher than that in control group.This study established cashmere-goat shRNA-PPARγ lentivirus interference vector，after successfully transfecting into the intramuscular adipocytes，it obviously inhibited the differentiation of adipocytes，and promoted the proliferation of intramuscular adipocytes，which lay foundation for further research the role ofPPARγgene in cashmere-goat metabolic pathways and in the fat deposition mechanism.

Key words:intramuscular adipocyte；RNA interference；PPARγ

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.005

收稿日期：2015-05-23

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30960246)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2010Zd11)；國家科技支撐項(xiàng)目(2011BAD28B05)；國家絨毛用羊現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-40-05)

作者簡介：杜琛(1986-)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，博士，助理研究員，主要從事分子遺傳研究，E-mail：duchen198607@126.com *通信作者：李金泉，博導(dǎo)，教授，主要從事動(dòng)物遺傳學(xué)研究，E-mail：lijinquan_nd@126.com；陳秀娟，碩導(dǎo)，教授，主要從事婦產(chǎn)科學(xué)研究，E-mail：90098687@sina.com

中圖分類號(hào)：S827；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0671-08