ADIG誘導(dǎo)牛成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及相關(guān)基因的表達(dá)分析

梅楚剛，張　瓊，付常振，劉　揚(yáng)，姜碧杰，成　功，2，昝林森，2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100； 2.國(guó)家肉牛改良中心，楊凌 712100)

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ADIG誘導(dǎo)牛成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及相關(guān)基因的表達(dá)分析

梅楚剛1，張瓊1，付常振1，劉揚(yáng)1，姜碧杰1，成功1，2，昝林森1，2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100； 2.國(guó)家肉牛改良中心，楊凌 712100)

摘要：旨在通過(guò)在牛成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ADIG基因，誘導(dǎo)成肌細(xì)胞向成脂轉(zhuǎn)分化，探討該牛脂肪分化轉(zhuǎn)錄因子ADIG基因在脂類代謝過(guò)程中的功能，為闡明牛脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子ADIG基因在牛脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用提供證據(jù)。本研究用AD-ADIG腺病毒原液誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化初生荷斯坦牛的成肌細(xì)胞，并在誘導(dǎo)分化后第2、4、6、8、10、12、14天進(jìn)行油紅O染色觀察誘導(dǎo)成脂情況，同時(shí)收集細(xì)胞提取總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)ADIG、PPARγ、C/EBPα、SREBPF1、FABP4、FAS、MyoD基因的表達(dá)量變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，ADIG基因在第2、4、6、8、10、12、14天均有高水平表達(dá)，且隨著誘導(dǎo)天數(shù)增加脂滴明顯增多。成脂相關(guān)的基因PPARγ、SREBPF1和FAS在后期AD-ADIG組中表達(dá)量均高于空白組，成肌相關(guān)的基因MyoD相對(duì)表達(dá)量在初期就顯著下降，且AD-ADIG組明顯低于對(duì)照組。綜合脂滴染色和相關(guān)基因表達(dá)量方面的研究結(jié)果，說(shuō)明ADIG基因在誘導(dǎo)牛成肌細(xì)胞分化向成脂轉(zhuǎn)分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而且牛成肌細(xì)胞有向脂肪細(xì)胞分化的傾向。

關(guān)鍵詞：牛成肌細(xì)胞；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化；AD-ADIG

牛肉是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的肉食品，一直以來(lái)作為中國(guó)傳統(tǒng)的高檔肉，受到消費(fèi)者的普遍歡迎[1]。如何提高肉牛脂肪沉積、改善牛肉嫩度、增加大理石花紋，已成為國(guó)內(nèi)肉牛選育改良的重要課題之一。

小脂肪細(xì)胞因子(Small adipocyte factor 1，SMAF1)，在牛上命名為ADIG(Adipogenin)。SMAF1基因僅在脂肪細(xì)胞中特異性表達(dá)，有研究表明，其在培養(yǎng)的大鼠和小鼠原代脂肪前體細(xì)胞中表達(dá)缺失，SMAF1基因表達(dá)和脂肪細(xì)胞基因表型呈現(xiàn)密切相關(guān)[2]。SMAF1基因在脂肪細(xì)胞中的mRNA水平和脂肪細(xì)胞成熟分化程度呈正相關(guān)，但目前對(duì)SMAF1基因在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中所起的作用尚不清楚，另外，SMAF1基因在牛上的研究報(bào)道甚少。腺病毒介導(dǎo)的目的基因超表達(dá)和RNA干擾技術(shù)是目前研究基因功能的重要方法，目前常用的腺病毒載體系統(tǒng)主要包括ViraPowerTMAdenoviral Expression System和AdEasyTMAdenoviral Vector System[3-4]。

本研究選擇將牛脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子(ADIG)基因作為目標(biāo)基因，采用ViraPowerTM腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建的重組腺病毒載體，探討該基因在脂類代謝過(guò)程中的功能，為進(jìn)一步研究牛脂類代謝的分子機(jī)制和深入進(jìn)行肉質(zhì)性狀改良以及針對(duì)性地研究調(diào)控牛脂肪沉積，培育低體脂、高肌內(nèi)脂肪的肉牛新品種奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑

DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)basic(1X)培養(yǎng)基和馬血清(Horse serum，HS)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，PBS，E.Z.N.A.Total RNA提取試劑盒，PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)試劑盒，SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(其中包含SYBR Premix Ex TaqⅡ和ROX Reference Dye(50×))。

1.2牛成肌細(xì)胞的培養(yǎng)

本研究成肌細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存的第2代初生荷斯坦牛的背最長(zhǎng)肌來(lái)源的成肌細(xì)胞，細(xì)胞解凍后用培養(yǎng)液(70%DMEM+20%FBS+10%HS)培養(yǎng)，每天進(jìn)行1次換液，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，按照體積比為1∶3的比例進(jìn)行傳代。

1.3牛成肌細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化

本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)3個(gè)處理組，試驗(yàn)周期為14 d，用六孔板培養(yǎng)。第1組為成肌細(xì)胞空白對(duì)照組(control)；第2組為添加AD-NC重組腺病毒原液的成肌細(xì)胞，待成肌細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，添加腺病毒AD-NC重組腺病毒原液；第3組為添加AD-ADIG重組腺病毒原液的成肌細(xì)胞，待成肌細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，添加腺病毒AD-ADIG重組腺病毒原液。第2組添加1 mL AD-NC重組腺病毒原液，第3組添加1 mL AD-ADIG重組腺病毒原液。添加病毒12 h后半量換液，換成肌細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，之后每2 d完全換液1次。分別在培養(yǎng)的第2、4、6、8、10、12、14天時(shí)收集細(xì)胞，提取RNA并進(jìn)行油紅O染色。

1.4油紅O染色

培養(yǎng)細(xì)胞棄去培養(yǎng)液經(jīng)PBS洗3次后，4%多聚甲醛固定液固定30 min；PBS洗2次，加入適量油紅O染液(0.5 g體積分?jǐn)?shù)為0.5%的油紅O染液，加入體積分?jǐn)?shù)為98%的異丙醇100 mL，靜置過(guò)夜，即為原液。使用時(shí)按雙蒸水和原液體積比為2∶3的比例進(jìn)行稀釋過(guò)濾)，染色20～30 min，PBS沖洗，顯微鏡下觀察。

1.5提取細(xì)胞中的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA

使用Total RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA(按照說(shuō)明書操作)。提取的總RNA用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA于-20 ℃中保存待用。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)成肌細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中相關(guān)基因表達(dá)情況

所用ADIG、PPARγ、C/EBPα、SREBP1、FABP4、MyoD、FAS以及GADPH基因的引物見表1。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)總體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，模板2 μL，水6 μL。在7500 Real Time PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)樣3個(gè)重復(fù)，最后取其均值。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，循環(huán)40次。熔解曲線程序：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。

表1PCR引物序列

Table 1Primers for PCR of genes

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物/bpLengthGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionNo.ADIGF-GGAAGATCTTAGCCACACACGCACCATR-ACGCGTCGACCCAAAGTCCTCTCCCCTC399NM_001113720.1PPARγF-GAGATCACAGAGTACGCCAAGR-GGGCTCCATAAAGTCACCAA216NM_181024.2C/EBPαF-ATCTGCGAACACGAGACGR-CCAGGAACTCGTCGTTGAA73NM_176784SREBP1F-CAATGTGTGAGAAGGCCAGTR-CAATGTGTGAGAAGGCCAGT109NM_001113302FABP4F-TGAGATTTCCTTCAAATTGGGR-CTTGTACCAGAGCACCTTCATC101NM_174314.2FASF-TAAGGTTCAAATTGCTGCGTR-TCCAGAGCGAAGGAGAGATT138NM_001012669.1MyoDF-ATACATTCAGACCCTCAGTGCTTTGR-CAGAAACTTGCTGCTGTTCTGGA66NM_001040478.2GAPDHF-CCAACGTGTCTGTTGTGGATR-CTGCTTCACCACCTTCTTGA80NM_001034034

ADIG基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為399 bp，擴(kuò)增效率良好Amplified fragment length ofADIGgene is 399 bp，and the amplification efficiency is fairly good

1.7統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算所得到的的基因相對(duì)表達(dá)量用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05認(rèn)為差異顯著，P<0.01則認(rèn)為差異極顯著。

2結(jié)果

2.1牛成肌細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

解凍后培養(yǎng)的牛成肌細(xì)胞形態(tài)均一清楚，呈梭狀，排列整齊。傳代后可以直接用于成肌細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化(圖1)。

2.2AD-ADIG誘導(dǎo)牛成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化結(jié)果

分別在試驗(yàn)第2、4、6、8、10、12、14 天，對(duì)3個(gè)不同的處理組進(jìn)行油紅O染色，染色結(jié)果如圖2所示?？梢郧宄^察到，在第2天時(shí)，AD-ADIG組的油紅O染色量就已經(jīng)比空白組和AD-NC組多一些。隨著天數(shù)增加，各組的油紅O染色量都在不斷增多?？瞻捉M和AD-NC組的油紅O染色量比較相近，而每天AD-ADIG組的油紅O染色量都是最多的。在第12天時(shí)AD-ADIG組已經(jīng)可以形成一個(gè)很大的脂滴(圖3)，在第14天時(shí)，脂滴聚集成大脂滴量明顯增加(圖3)。

2.3牛成肌細(xì)胞成脂轉(zhuǎn)分化過(guò)程中相關(guān)基因表達(dá)量變化

2.3.1ADIG基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)于ADIG基因，由于第3組是添加AD-ADIG重組腺病毒原液的成肌細(xì)胞的處理組，即是過(guò)表達(dá)ADIG基因的處理組，因此可以看到對(duì)于ADIG基因，在第2、4、6、8、10、12、14天，AD-ADIG組ADIG基因的表達(dá)量顯著高于空白組和AD-NC組(P<0.05)，空白組和AD-NC組間ADIG基因表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)(圖4)。而且，由圖4可以看出自誘導(dǎo)第6天開始，AD-ADIG組ADIG基因表達(dá)量一直較高，且在第4天達(dá)到最高表達(dá)量，之后雖然下降，但也維持著較高水平的表達(dá)量(圖4)。

A.40×；B.100×圖1　牛傳代成肌細(xì)胞的顯微觀察Fig.1　Observation on the bovine sub-culture myoblast using microscope

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同The different letters show significant difference (P<0.05).The same as below圖4　ADIG基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4　ADIG gene relative expression

2.3.2PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)于PPARγ基因，從圖5中我們可以看到，在誘導(dǎo)第2天，空白組和AD-NC組的PPARγ基因表達(dá)量較AD-ADIG組高，但自誘導(dǎo)第4天開始，第4、6、8、10、12、14天中，AD-ADIG組PPARγ基因的表達(dá)量都顯著高于空白組和AD-NC組(P<0.05)。PPARγ基因在第10天時(shí)表達(dá)量最高，隨后開始下降。

2.3.3C/EBPα基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)于C/EBPα基因，在第2天試驗(yàn)3組的差異比較顯著，第4、6、8、10、12天空白組和AD-NC組的相對(duì)表達(dá)量差異均不顯著(P>0.05)。另外，AD-ADIG組的表達(dá)量在整個(gè)過(guò)程中均低于空白組和AD-NC組(第8天除外，圖6)。

圖5　PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5　PPARγ gene relative expression

圖6　C/EBPα基因相對(duì)表達(dá)量Fig.6　C/EBPα gene relative expression

2.3.4SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)于SREBP1基因，第4、6、8、10、12、14天空白組和AD-NC組的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，在4、6、8、10、12天空白組顯著低于AD-ADIG組(P<0.05)。AD-ADIG組的SREBP1基因表達(dá)量一直維持在相對(duì)較穩(wěn)定的水平(圖7)。

圖7　SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量Fig.7　SREBP1 gene relative expression

2.3.5FABP4基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)于FABP4基因，3組的相對(duì)表達(dá)量總體來(lái)說(shuō)表達(dá)量變化規(guī)律不明顯(P>0.05)(圖8)。

2.3.6FAS基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)于FAS基因，在4、6、8、10、12天，AD-ADIG組的FAS基因相對(duì)表達(dá)量均要高于空白組和AD-NC組(P<0.05)。另外，第4、6、8、14天，空白組和AD-NC組的相對(duì)表達(dá)量差異均不顯著(P>0.05)(圖9)。

2.3.7MyoD基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)于MyoD基因，AD-ADIG組自誘導(dǎo)第2天起幾乎沒有表達(dá)量?？瞻捉M和AD-NC組MyoD基因的相對(duì)表達(dá)量不斷下降(圖10)。

圖8　FABP4基因相對(duì)表達(dá)量Fig.8　FABP4 gene relative expression

圖9　FAS基因相對(duì)表達(dá)量Fig.9　FAS gene relative expression

圖10　MyoD基因相對(duì)表達(dá)量Fig.10　MyoD gene relative expression

3討論

成肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞來(lái)源相同，都來(lái)自中胚層。在肌肉中，轉(zhuǎn)錄因子基本的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)蛋白MyoD和MYF5發(fā)揮了重要作用，在決定分化方向中，MyoD是骨骼肌細(xì)胞分化的決定性基因，單一的MyoD即足以使肌干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞。在脂肪細(xì)胞中，細(xì)胞分化是被PPARγ和CEBPs兩個(gè)主要因子或者說(shuō)一組因子調(diào)控的。

研究發(fā)現(xiàn)，可以直接誘導(dǎo)成肌細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化[5]。日本有學(xué)者飼喂高脂肪日糧給小鼠，結(jié)果，SMAF1的mRNA水平明顯提高[6]，這與提高PPARγ的表達(dá)后取得的效果相同。這也是本試驗(yàn)通過(guò)在成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ADIG基因來(lái)探討研究ADIG基因在成脂分化過(guò)程中調(diào)控作用的目的所在。

本研究檢測(cè)了PPARγ、C/EBPα、SREBP1、FABP4、FAS及MyoD基因在ADIG過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)牛成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的表達(dá)情況，PPARγ、SREBP1和FAS在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化開始后呈先升高再下降的趨勢(shì)。結(jié)合相關(guān)基因的功能，PPARγ基因編碼的蛋白是脂肪分化的調(diào)節(jié)器[7-10]；C/EBPα是脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，維持脂肪細(xì)胞基因的表達(dá)并最終促使細(xì)胞分化[11-14]；SREBP1由SREBPF1基因編碼，在維持脂質(zhì)代謝平衡中發(fā)揮著非常重要的作用[15-16]；FAS主要作用是催化細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的從頭合成，是胞內(nèi)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶[17-18]。說(shuō)明在誘導(dǎo)成脂分化的不同階段，ADIG基因可能先后激活PPARγ、SREBP1和FAS基因的表達(dá)，從而發(fā)揮不同的調(diào)控作用，證明了ADIG基因在誘導(dǎo)牛成肌細(xì)胞向成脂轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的重要作用。

同時(shí)，在本試驗(yàn)中，C/EBPα基因在誘導(dǎo)過(guò)程中的表達(dá)量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，該現(xiàn)象與本實(shí)驗(yàn)室先前得出的C/EBPα基因在成脂分化方面功能的研究結(jié)果(在牛成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)C/EBPα基因促進(jìn)成脂的同時(shí)，PPARγ基因的表達(dá)量也升高)不一致，也與1997年C.S.Hwang等[14]研究的結(jié)果(C/EBPα可以促進(jìn)PPARγ表達(dá)，一旦C/EBPα基因的轉(zhuǎn)錄被啟動(dòng)，C/EBPα則可通過(guò)自身的轉(zhuǎn)錄激活而繼續(xù)高水平表達(dá)，從而維持脂肪細(xì)胞基因的表達(dá)并最終促使細(xì)胞分化)不一致。分析原因，有可能是因?yàn)锳DIG基因的過(guò)表達(dá)抑制了C/EBPα基因的表達(dá)，但需要進(jìn)一步深入研究。此外，F(xiàn)AS與SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量相一致，再次驗(yàn)證了卓偉華等[16]的發(fā)現(xiàn)：SREBP1的表達(dá)水平與FAS活性有很強(qiáng)的相關(guān)。同時(shí)，由以上研究可以推測(cè)SREBP1基因可能與激活PPARγ基因的表達(dá)有關(guān)，這與M.Bionaz 等[19]2008年的研究結(jié)果相契合：SREBP1基因在乳脂合成中發(fā)揮中央調(diào)控的作用。

生肌決定因子(MyoD)基因家族也叫肌肉調(diào)節(jié)因子(MRFs)基因家族[20]，是骨骼肌細(xì)胞分化的決定性基因。有研究證明，肌細(xì)胞分化和生長(zhǎng)調(diào)控因子MyoD基因是繼生長(zhǎng)激素(GH)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)之后新發(fā)現(xiàn)的功能基因，了解它的功能、結(jié)構(gòu)及遺傳變異具有重要的意義[21]。因此，本研究選用MyoD基因作為分化的標(biāo)記基因，用于標(biāo)記牛成肌細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)程。結(jié)果表明，MyoD基因AD-ADIG組的表達(dá)量自第0天就受到抑制，結(jié)合觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，MyoD基因表達(dá)量的變化與細(xì)胞分化狀態(tài)相一致，這充分說(shuō)明了過(guò)表達(dá)ADIG基因?qū)Τ杉〖?xì)胞向肌細(xì)胞分化有明顯的抑制作用，也證明了牛成肌細(xì)胞有向脂肪細(xì)胞分化的傾向。

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(編輯郭云雁)

ADIG Inducing the Trans-differentiation of Bovine Myoblasts and Its Related Gene Expression

MEI Chu-gang1，ZHANG Qiong1，F(xiàn)U Chang-zhen1，LIU Yang1，JIANG Bi-jie1，CHENG Gong1，2，ZAN Lin-sen1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.NationalBeefCattleImprovementCenterinChina，Yangling712100，China)

Abstract:The aim of this study was to provide evidence about the role ofADIGgene in bovine adipose tissue during growth and development，and to lay a theoretical basis for further study of the molecular mechanisms of bovine fat metabolism and meat quality improvement through inducing bovine myoblasts trans-differentiating into fat with overexpressingADIGgene in bovine myoblasts.We induced bovine myoblasts trans-differentiating with AD-ADIG recombinant adenovirus，observed the lipid droplets after Oil Red O staining，collected cells to extract RNA at the 0th，2nd，4th，6th，8th，10th，12th，14thday，respectively，and detected relative expressions of fat-related genesADIG，PPARγ，C/EBPα，SREBPF1，F(xiàn)ABP4，F(xiàn)ASas well as the muscle-related geneMyoDby real-time quantitative PCR.The real-time quantitative PCR results showed that during the induced trans-differentiation process，ADIGgene was expressed at high levels at the 2nd，4th，6th，8th，10th，12th，14thday，and lipid droplets increased significantly.The relative expression of the fat-related genesPPARγ，SREBPF1 andFASat late stages were obviously higher in AD-ADIG group than that in other groups，and the relative expression of muscle-related geneMyoDdecreased at early stages，and was obviously lower in AD-ADIG group than that in other groups.The result indicate thatADIGgene play important roles in bovine myoblasts induced into fat and bovine myoblast has the potential of differentiating to adipocyte according to the results of Oil Red O staining and related gene relative expression.

Key words:bovine myoblasts；induced trans-differentiation；AD-ADIG

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.004

收稿日期：2014-04-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家863計(jì)劃(2013AA102505);國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD12B07)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)(2014ZX08007-002)；國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-38)

作者簡(jiǎn)介：梅楚剛(1986-)，男，河南信陽(yáng)人，博士生，主要從事動(dòng)物生物技術(shù)方面的研究，E-mail: meichugang@163.com *通信作者：昝林森，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肉牛、奶牛遺傳改良與健康養(yǎng)殖方面的教學(xué)、科研及技術(shù)推廣工作，E-mail: zanlinsen@163.com

中圖分類號(hào)：S823；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0661-10