基于454高通量測(cè)序平臺(tái)血液、呼吸道、消化道臨床樣本的快速檢測(cè)

韓 娜強(qiáng)?？堟面妹鐙蓩蓮?雯*（1 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所生物信息室，北京 102206；2 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310003）

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基于454高通量測(cè)序平臺(tái)血液、呼吸道、消化道臨床樣本的快速檢測(cè)

韓 娜1，2強(qiáng)裕俊1，2張婷婷1，2苗嬌嬌1，2張 雯1，2*
（1 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所生物信息室，北京 102206；2 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310003）

【摘要】目的 探討454高通量測(cè)序平臺(tái)應(yīng)用于臨床樣本快速檢測(cè)的可能性。方法 應(yīng)用454高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)定血液、呼吸道和消化道臨床樣本中微生物菌群的16S rDNA基因的V3-V4高變異區(qū)段序列，采用BLAST方法與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，基于比對(duì)結(jié)果，獲得不同種屬的病原菌的所匹配的read數(shù)。結(jié)果 8份臨床模擬樣本中，7份檢測(cè)出目標(biāo)菌屬，檢出率為87.5%。在血液、肺泡灌洗液和咽拭子這類正常狀態(tài)下的無(wú)菌體液，檢測(cè)結(jié)果較為明確，檢出的細(xì)菌較為集中，顯示了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。而對(duì)本身含有較多種類細(xì)菌的糞便樣本，其目標(biāo)菌比例明顯降低。結(jié)論 實(shí)現(xiàn)了80 h內(nèi)得到血液、呼吸道和消化道臨床樣本中含有病原菌情況的檢測(cè)報(bào)告，并探討了高通量測(cè)序技術(shù)在今后臨床實(shí)際應(yīng)用時(shí)進(jìn)一步提高檢測(cè)速度和靈敏度的方法。

【關(guān)鍵詞】454高通量測(cè)序；臨床樣本；病原菌；檢測(cè)

16S rRNA位于原核細(xì)胞核糖體小亞基上，包括10個(gè)保守區(qū)域（conversed regions）和9個(gè)高變區(qū)域（hypervariable regions），其中保守區(qū)在細(xì)菌間差異不大，高變區(qū)具有屬或種的特異性，隨親緣關(guān)系不同而有一定的差異［1］。因此，16S rRNA可以作為揭示生物物種的特征核酸序列，被認(rèn)為是最適于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(biāo)［2］。然而16SrRNA的檢測(cè)前提是需要病原的分離培養(yǎng)。雖然人們已通過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)分離并保存了部分穩(wěn)定的菌株，但實(shí)際上目前僅有上千種（Species水平）的微生物基因組獲得了成功測(cè)序；99%的環(huán)境微生物，尤其以厭氧和極端環(huán)境生存菌，仍無(wú)法分離純化而實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)或尚未成功建立培養(yǎng)體系［3］。由于技術(shù)有限性導(dǎo)致對(duì)大量微生物表型、遺傳信息的認(rèn)知局限性，大大限制了我們對(duì)這些未知菌種的研發(fā)和利用，也限制了我們進(jìn)一步解析微生物和人類健康間的關(guān)聯(lián)性。

近年來(lái)隨著高通量測(cè)序平臺(tái)和技術(shù)的不斷革新，宏基因組研究，不依賴于培養(yǎng)技術(shù)，以整個(gè)微生物群落遺傳物質(zhì)為研究對(duì)象，大力推動(dòng)了整個(gè)微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能基因組學(xué)研究的迅速發(fā)展，促使人們不斷深入了解這些微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能、進(jìn)化以及群落間，群落與環(huán)境間的相互作用關(guān)系，以及微生物和人類健康間的關(guān)聯(lián)性［4-5］。本課題組在前期的工作中，也利用宏基因組學(xué)方法（16S Meta）探索了人類腸道的菌群結(jié)構(gòu)變化和兒童腹瀉、糖尿病等多種疾病之間的關(guān)聯(lián)性［6-7］。然而目前仍缺乏基于16s rDNA的未知病原菌高通量篩查技術(shù)，如何利用宏基因組技術(shù)從患者身上快速檢測(cè)出病原菌仍是傳染病工作目前發(fā)展的技術(shù)難題。在本研究中，本課題組利用454測(cè)序平臺(tái)，對(duì)血液、呼吸道和消化道的臨床模擬樣本進(jìn)行了16S rDNA宏基因組測(cè)序，基于測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了未知病原檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了80 h內(nèi)完成8份模擬臨床樣本的檢測(cè)，對(duì)探索高通量測(cè)序方法在臨床檢測(cè)方面的應(yīng)用做出了一定的貢獻(xiàn)。

1 資料與方法

1.1 樣本準(zhǔn)備：收集8份健康人的樣本，分別為灌洗液、咽拭子、血液和糞便，分別添加8種不同的病原菌（表1），濃度為～104ccfu/g。

1.2 核酸提取：8份模擬樣本的核酸提取是利用Qiagen UCP Pathogen Mini Kit試劑盒。提取方法詳細(xì)如下：加40 μL Proteinase K，渦旋器混合樣本10 s；56 ℃孵化10 min；加200 μL Buffer APL2到樣本，蓋上蓋子，多脈沖渦旋器震蕩混合30 s；70 ℃孵化10 min；瞬時(shí)離心，將蓋子上的液體滴落；加300 μL乙醇到裂解液中，蓋上蓋子，多脈沖震蕩漩渦器震蕩15～30 s混合均勻；加混合物到QIAamp UCP Mini spin column柱子上，6000×g（8000 rpm）離心1 min；小心打開離心柱，加600 μL Buffer APW1，避免污染柱子邊緣，6000×g（8000 rpm）離心1 min；加750 mL Buffer APW2，全速（20000×g，14000 rpm）離心3 min；將離心柱放置到新的2 mL收集管中，棄置含廢液的收集管。全速離心1 min；將離心柱放置到新的2 mL收集管中，打開蓋子，56 ℃孵化整個(gè)裝置3 min，將膜徹底干燥；將離心柱放置到新的1.5 mL洗脫管中，棄置收集管，小心加20～100 μL Buffer AVE到離心柱的中央。蓋上蓋子，室溫靜止1 min；全速離心（20000×g，14000 rpm）1 min，洗脫DNA。

表1 8份模擬樣本的詳細(xì)信息。

1.3 高通量測(cè)序：基于454測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，按照454 Junior測(cè)序平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)進(jìn)行。工作流程見(jiàn)圖1。

1.4 數(shù)據(jù)分析：測(cè)序序結(jié)果，利用FastQC進(jìn)行質(zhì)量控制。剔除低質(zhì)量序列后，我們采用BLAST方法與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，基于比對(duì)結(jié)果，獲得不同種屬的病原菌的所匹配的read數(shù)。

2 結(jié) 果

2015年10月13日9：00實(shí)驗(yàn)室取樣，依次進(jìn)行核酸提取、16S擴(kuò)增、建庫(kù)、油包水實(shí)驗(yàn)、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析步驟（如圖1所示），于10月16日17：35生成鑒定報(bào)告，總工作時(shí)間80 h。所需人力3名，其中實(shí)驗(yàn)室人員2名，數(shù)據(jù)分析人員1名。

樣本一為肺泡灌洗液模擬樣本，測(cè)序序列數(shù)（read）為773。經(jīng)過(guò)與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有458條序列與軍團(tuán)菌屬匹配，比例為59.64%。通過(guò)與16S數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有348條序列與目標(biāo)菌嗜肺軍團(tuán)菌匹配，比例為45.44%。檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

表2 8份臨床模擬樣本的檢測(cè)結(jié)果

圖1 工作流程及時(shí)間

樣本二為咽拭子模擬樣本，測(cè)序序列數(shù)（read）為10376。經(jīng)過(guò)與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有9725條序列與不動(dòng)桿菌屬匹配，比例為94.07%。通過(guò)與16S數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有348條序列與目標(biāo)菌不動(dòng)桿菌屬匹配，比例為42.88%。檢測(cè)結(jié)果屬水平上為陽(yáng)性。

樣本三為血液模擬樣本，測(cè)序序列數(shù)（read）為1279。經(jīng)過(guò)與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有1006條序列與李斯特菌屬匹配，比例為78.66%。通過(guò)與16S數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有915條序列與目標(biāo)菌李斯特菌屬匹配，比例為71.54%。檢測(cè)結(jié)果屬水平上為陽(yáng)性。

樣本四為糞便模擬樣本，測(cè)序序列數(shù)（read）為3262。經(jīng)過(guò)與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)和16S數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，皆無(wú)序列與空腸彎曲菌匹配。檢測(cè)結(jié)果為陰性。

樣本五為糞便模擬樣本，測(cè)序序列數(shù)（read）為7375。經(jīng)過(guò)與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有1425條序列與弧菌屬匹配，比例為19.42%。通過(guò)與16S數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有384條序列與目標(biāo)菌副溶血弧菌匹配，比例為5.23%。檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

樣本六為糞便模擬樣本，測(cè)序序列數(shù)（read）為7464。經(jīng)過(guò)與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有81條序列與弧菌屬匹配，比例為1.09%。通過(guò)與16S數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有4條序列與目標(biāo)菌弧菌屬匹配，比例為0.06%。檢測(cè)結(jié)果屬水平上為陽(yáng)性。

樣本七為糞便模擬樣本，測(cè)序序列數(shù)（read）為425。經(jīng)過(guò)與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有150條序列與沙門菌屬匹配，比例為36.08%。通過(guò)與16S數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有107條序列與目標(biāo)菌腸道沙門菌匹配，比例為25.18%。檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

樣本八為糞便模擬樣本，測(cè)序序列數(shù)（read）為1484。經(jīng)過(guò)與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有1條序列與氣單胞菌屬匹配，比例為0.07%。通過(guò)與16S數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有2條序列與目標(biāo)菌嗜水氣單胞菌匹配，比例為0.13%。檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

8份臨床模擬樣本中，7份檢測(cè)出目標(biāo)菌屬，檢出率為87.5%。詳細(xì)檢測(cè)結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)表2。

3 討 論

目前臨床上，常規(guī)培養(yǎng)、生化血清學(xué)鑒定方法仍是主流的檢測(cè)方法，但存在檢出率低和漏檢率高的缺點(diǎn)?；谔禺愋蛄械腜CR方法靈敏度高、檢測(cè)速度快，但只能針對(duì)一種或幾種特定的菌進(jìn)行鑒定，不利于用于未知病原的篩查。高通量測(cè)序檢測(cè)方法由于其數(shù)據(jù)量大，不依賴于細(xì)菌培養(yǎng)，一經(jīng)面世就被寄予了解決未知病原檢測(cè)問(wèn)題的厚望，本研究模擬臨床實(shí)戰(zhàn)，從樣本接受到返回報(bào)告，實(shí)現(xiàn)了80 h內(nèi)的得到檢測(cè)報(bào)告，檢出率高達(dá)87.5%，具有較高的敏感性。然而目前的實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)還較少，其敏感性和特異性還需要大數(shù)據(jù)量的進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，本次實(shí)驗(yàn)也反映出了一些問(wèn)題。

首先，檢測(cè)時(shí)間需要80 h，從臨床應(yīng)急的角度仍需進(jìn)一步的壓縮。為解決以上問(wèn)題，我們計(jì)劃采取硬件和軟件一起優(yōu)化的策略。在硬件上，升級(jí)測(cè)序平臺(tái)，改用測(cè)序時(shí)間更短的新一代測(cè)序儀；在軟件上，實(shí)現(xiàn)人員的合理配置，從現(xiàn)在的單班8小時(shí)工作優(yōu)化為雙組輪班制，以最大可能的壓縮閑置時(shí)間。

其次，目前的檢測(cè)結(jié)果顯示在血液、肺泡灌洗液和咽拭子這類正常狀態(tài)下的無(wú)菌體液，檢測(cè)結(jié)果較為明確，檢出的細(xì)菌較為集中，目標(biāo)菌比例超過(guò)50%，最高超過(guò)94%，顯示了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。而對(duì)本身含有較多種類細(xì)菌的糞便樣本，其目標(biāo)菌比例明顯降低。這提示了我們未來(lái)在對(duì)有菌體液，如糞便樣本的檢測(cè)中，需要提高測(cè)序數(shù)據(jù)量，以盡可能覆蓋目標(biāo)菌群，提高檢測(cè)的陽(yáng)性率。

最后，目前的檢測(cè)結(jié)果仍局限于屬水平上，在種水平上由于目前的16S數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)量較小的原因，很多病原菌在種水平上不能檢出。因此，我們需要針對(duì)常見(jiàn)的病原菌擴(kuò)增16S全長(zhǎng)，補(bǔ)充到我們目前的數(shù)據(jù)庫(kù)中，以提高檢測(cè)精確度。

綜上所述，454高通量測(cè)序平臺(tái)可用于臨床樣本的快速檢測(cè)，且

中圖分類號(hào)：R446

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）17-0039-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（課題編號(hào)81201322）和國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃課題（2014AA021505）

*通訊作者：E-mail：Zhangwen@icdc.cn