PM2.5對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激的影響

李明++++++謝菁菁++++++吳彤++++++王嬰++++++劉方芳++++++王芳++++++李巖

[摘要] 目的 探討大氣細(xì)顆粒物PM2.5對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激的影響。 方法 收集2014年廣州城區(qū)大氣中的PM2.5，以CCK-8法分析6.25～100 μg/ml的PM2.5對(duì)肝L02細(xì)胞的毒性。根據(jù)PM2.5濃度分別設(shè)立6.25 μg/ml組、12.50 μg/ml組和25.00 μg/ml組，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，比較各組細(xì)胞內(nèi)三酰甘油和膽固醇含量、肝X受體α（LXRα）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）的表達(dá)水平及氧自由基水平。 結(jié)果 PM2.5濃度為50.00 μg/ml時(shí)，對(duì)肝L02細(xì)胞有明顯毒性。各劑量組肝細(xì)胞內(nèi)的三酰甘油濃度顯著高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。25.00 μg/ml組的LXRα和SREBP-1c表達(dá)水平顯著高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各劑量組的氧自由基水平顯著高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 PM2.5可通過(guò)LXRα和SREBP-1c誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積，并誘發(fā)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，這可能是PM2.5引起非酒精性脂肪肝的重要機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] PM2.5；肝細(xì)胞；脂質(zhì)代謝；氧化應(yīng)激

[中圖分類號(hào)] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）03（c）-0009-03

[Abstract] Objective To explore the influence of PM2.5 on lipid metabolism and oxidative stress of hepatocyte. Methods PM2.5 was collected from atmosphere in urban area of Guangzhou in 2014.Toxicity of liver L02 cell was analyzed by CCK-8 at PM2.5 levels of 6.25-100 μg/ml.The group of 6.25 μg/ml，12.5 μg/ml，25 μg/ml was set respectively，and the negative control group was set.The contents of intracellular triglyceride and cholesterol，the expression level of LXRα and SREBP-1c，the intracellular oxygen free radical level among four groups was compared. Results When the PM2.5 concentration was 50 g/ml，which had obvious toxicity to liver L02 cells.The concentration of triacylglycerol in the liver cells in each dose group was higher than that in the negative control group，with significant difference （P<0.05）.The expression level of LXRα and SREBP-1c in the group of 25.00 g/ml was higher than that in the negative control group，with significant difference （P<0.01）.The level of oxyradical in each dose group was higher than that in the negative control group，with significant difference （P<0.01）. Conclusion PM2.5 can induce lipid accumulation in hepatocytes via LXRα and SREBP-1c，and induce oxidative stress in hepatocytes，which may be the important mechanism of PM2.5 causing non-alcoholic fatty liver disease.

[Key words] PM2.5；Hepatocyte；Lipid metabolism；Oxidative stress

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指排除酒精及其他明確肝損傷因素之外造成的，以肝臟脂肪沉積和肝細(xì)胞脂肪變性為特征的臨床病理綜合征[1]。近年來(lái)的流行病學(xué)研究顯示，PM2.5與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。目前，關(guān)于PM2.5在NAFLD中的作用，尤其是PM2.5對(duì)肝細(xì)胞的影響并不清楚。本研究通過(guò)培養(yǎng)人肝細(xì)胞L02株，觀察PM2.5對(duì)肝臟細(xì)胞脂肪含量和氧化應(yīng)激的影響，從肝細(xì)胞脂質(zhì)合成關(guān)鍵蛋白肝X受體α（liver X receptor α，LXRα）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c）的表達(dá)變化探討PM2.5引起肝細(xì)胞脂肪堆積的原因。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

CCK-8試劑盒（日本同仁公司），Trizol、PrimeScriptTM RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本TaKaRa公司），DCFH-DA（美國(guó)Lifescience公司），三酰甘油和總膽固醇檢測(cè)試劑盒（南京建成生物有限公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司），定量PCR儀器（美國(guó)Bio-Rad公司）。參照本室所建立的方法于2014年在廣州城區(qū)采集大氣中的PM2.5，采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基配制成一定濃度-80℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.2 指標(biāo)與方法

1.2.1 CCK-8法檢測(cè)PM2.5對(duì)肝細(xì)胞的毒性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02細(xì)胞，加入96孔板中，以終濃度6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μg/ml的PM2.5對(duì)肝細(xì)胞染毒，另設(shè)陰性對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，36 h后按說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定細(xì)胞吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.2 胞內(nèi)脂質(zhì)含量測(cè)定 根據(jù)CCK-8結(jié)果選取6.25、12.50和25.00 μg/ml三個(gè)濃度的PM2.5對(duì)L02細(xì)胞染毒，另設(shè)陰性對(duì)照組。36 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，取細(xì)胞裂解液，按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)總膽固醇和三酰甘油的濃度。

1.2.3 LXRα和SREBP-1c基因表達(dá)檢測(cè) 同步驟1.2.2分組和染毒，提取總RNA，按說(shuō)明書(shū)用定量PCR檢測(cè)兩者的表達(dá)。LXRα上游引物：5′-TCA GAG AGG AAG CCA GGA TG-3′，下游引物：ACG GAT CTC TGT GGG TTC TG；SREBP-1c；上游引物：5′-CGA CAT CGA AGA CAT GCT TCA G-3′，下游引物：5′-GGA AGG CTT CAA GAG AGG AGC-3′；β-actin上游引物：5′-TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A-3′，下游引物：5′-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G-3′。PCR條件為95℃預(yù)變性30 s，然后95℃ 5 s、60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。目的基因的表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 胞內(nèi)ROS水平檢測(cè) 同步驟1.2.2分組和染毒，4 h后用PBS漂洗2次，按說(shuō)明書(shū)步驟以DCFH-DA熒光染料（5μm）標(biāo)記胞內(nèi)的氧自由基，30 min后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5對(duì)L02細(xì)胞的毒性分析

PM2.5濃度為50.00 μg/ml時(shí)，對(duì)肝L02細(xì)胞有明顯的毒性，細(xì)胞存活率為（80.44±6.42）%，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)PM2.5濃度<25.00 μg/ml時(shí)，L02細(xì)胞生長(zhǎng)雖然部分受到抑制，但與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），因此，本研究選用6.25、12.50和25.00 μg/ml作為后繼實(shí)驗(yàn)中PM2.5的終濃度。

2.2 PM2.5對(duì)肝細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響

PM2.5處理后，肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油濃度明顯增高，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1），提示PM2.5使肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量增高，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變。

2.3 PM2.5對(duì)LXRα、SREBP-1c表達(dá)的影響

各劑量組的LXRα和SREBP-1c表達(dá)水平顯著增高。25.00 μg/ml組的LXRα和SREBP-1c表達(dá)水平分別為陰性對(duì)照組的（1.29±016）倍和（1.89±0.21）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖1），提示PM2.5可以上調(diào)兩者的表達(dá)，這可能是PM2.5引起肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量增高的原因之一。

2.4 PM2.5對(duì)L02細(xì)胞氧自由基生成的影響

PM2.5刺激后，各劑量組肝L02細(xì)胞內(nèi)有大量ROS形成，熒光強(qiáng)度分別是陰性對(duì)照組的（153.37±12.35）%、（134.05%±10.30）%和（143.83%±10.08）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示PM2.5可以引起肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增多。

3 討論

近年來(lái)的流行病學(xué)研究顯示，NAFLD在我國(guó)城市人口中的患病率已達(dá)到或超過(guò)某些西方國(guó)家的水平[5]。除嚴(yán)重影響肝臟功能外，NAFLD還與代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化等重大疾病密切相關(guān)，因此，其被認(rèn)為是一種危害全身健康的肝臟疾病[1]?！岸未驌簟睂W(xué)說(shuō)是關(guān)于NAFLD發(fā)病的經(jīng)典學(xué)說(shuō)，認(rèn)為脂類在肝細(xì)胞內(nèi)的聚集是NAFLD發(fā)生中的第一次打擊，在此基礎(chǔ)上各種肝毒性物質(zhì)刺激肝細(xì)胞和庫(kù)普弗細(xì)胞活化，引起氧化應(yīng)激，促使局部肝細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)、脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞損傷，形成第二次打擊，導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生[6]。

PM是大氣中所有顆粒物的總稱，其中影響人類健康的主要是空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的細(xì)顆粒物PM2.5。研究顯示，PM2.5可直接進(jìn)入血液循環(huán)，影響全身多個(gè)組織器官的功能[7]。最近的流行病學(xué)調(diào)查顯示，PM2.5與NAFLD的發(fā)病率呈正相關(guān)[8-9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，PM2.5吸入可使小鼠肝臟組織出現(xiàn)脂肪變[10-11]。這些研究雖然證實(shí)了PM2.5與NAFLD關(guān)系密切，但并未對(duì)PM2.5影響NAFLD的機(jī)制進(jìn)行探討。本研究結(jié)果顯示，PM2.5處理后肝細(xì)胞三酰甘油含量明顯增高，提示PM2.5可以促進(jìn)NAFLD發(fā)病機(jī)制中的第一次打擊。LXRα和SREBP-1c是脂肪酸合成的關(guān)鍵性分子[12-13]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PM2.5可使L02細(xì)胞LXRα和SREBP-1c表達(dá)明顯增高，提示其可能是PM2.5引起肝細(xì)胞脂肪含量增多的機(jī)制之一。

氧化應(yīng)激是造成NAFLD第二次打擊的主要原因[14]。NAFLD大鼠肝臟組織中的氧自由基水平遠(yuǎn)高于正常大鼠，給予抗氧化藥物后則可明顯改善NAFLD的病變程度，提示氧化應(yīng)激在其中具有關(guān)鍵作用[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PM2.5染毒導(dǎo)致肝細(xì)胞生成大量的氧自由基，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示PM2.5還可通過(guò)影響NAFLD發(fā)生中的第二次打擊來(lái)引起肝細(xì)胞損傷。

綜上所述，PM2.5染毒導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和氧自由基增多，這可能是其引起NAFLD的原因。此外，LXRα和SREBP-1c表達(dá)上調(diào)與PM2.5促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 葉欣，張春華，劉青，等.中藥泡服加穴位貼敷治療非酒精性脂肪肝病30例療效觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（9）：71-73，99.

[2] Tarantino G，Capone D，F(xiàn)inelli C.Exposure to ambient air particulate matter and non-alcoholic fatty liver disease[J].World J Gastroenterol，2013，19（25）：3951-3956.

[3] Kim JW，Park S，Lim CW，et al.The role of air pollutants in initiating liver disease[J].Toxicol Res，2014，30（2）：65-70.

[4] 謝菁菁，鄺俊俠，王嬰，等.PM2.5對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積影響及機(jī)制研究[J].環(huán)境與健康雜志，2015，32（6）：509-512.

[5] Jia Q，Xia Y，Zhang Q，et al.Dietary patterns are associated with prevalence of fatty liver disease in adults[J].Eur J Clin Nutr，2015，69（8）：914-921.

[6] Periasamy S，Chien SP，Chang PC，et al.Sesame oil mitigates nutritional steatohepatitis via attenuation of oxidative stress and inflammation：a tale of two-hit hypothesis[J].J Nutr Biochem，2014，25（2）：232-240.

[7] Karottki DG，Spilak M，F(xiàn)rederiksen M，et al.Indoor and outdoor exposure to ultrafine，fine and microbiologically derived particulate matter related to cardiovascular and respiratory effects in a panel of elderly urban citizens[J].Int J Environ Res Public Health，2015，12（2）：1667-1686.

[9] Tong L，Li K，Zhou Q.The association between air pollutants and morbidity for diabetes and liver diseases modified by sexes，ages，and seasons in Tianjin，China[J].Environ Sci Pollut Res Int，2015，22（2）：1215-1219.

[10] Zheng Z，Xu X，Zhang X，et al.Exposure to ambient particulate matter induces a NASH-like phenotype and impairs hepatic glucose metabolism in an animal model[J].J Hepatol，2013，58（1）：148-154.

[11] Vesterdal LK，Danielsen PH，F(xiàn)olkmann JK，et al.Accumulation of lipids and oxidatively damaged DNA in hepatocytes exposed to particles[J].Toxicol Appl Pharmacol，2014，274（2）：350-360.

[12] Berlanga A，Guiu-Jurado E，Porras JA，et al.Molecular pathways in non-alcoholic fatty liver disease[J].Clin Exp Gastroenterol，2014，（7）：221-239.

[13] Jin SH，Yang JH，Shin BY，et al.Resveratrol inhibits LXRα-dependent hepatic lipogenesis through novel antioxidant Sestrin2 gene induction[J].Toxicol Appl Pharmacol，2013， 271（1）：95-105.

[14] Sumida Y，Niki E，Naito Y，et al.Involvement of free radicals and oxidative stress in NAFLD/NASH[J].Free Radic Res，2013，47（11）：869-880.

[15] Teodoro JS，Duarte FV，Gomes AP，et al.Berberine reverts hepatic mitochondrial dysfunction in high-fat fed rats：a possible role for SirT3 activation[J].Mitochondrion，2013，13（6）：637-646.

（收稿日期：2015-11-23 本文編輯：祁海文）