胎鼠不同造血部位的形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)研究

李亞梅， 梁愛斌， 汪俊幫， 方 霞， 張 炎， 張 虹

(1. 同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院臨床藥理室，上海 200065； 2. 同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院血液科，上海 200065)

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·基礎(chǔ)研究·

胎鼠不同造血部位的形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)研究

李亞梅1， 梁愛斌2， 汪俊幫2， 方 霞1， 張 炎1， 張 虹1

(1. 同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院臨床藥理室，上海 200065； 2. 同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院血液科，上海 200065)

目的 觀察胚胎11.5d(embryonic 11.5d, E11.5)不同造血部位的解剖結(jié)構(gòu)和造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell, HSC)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平、定位和形態(tài)，探討不同造血部位HSC的起源、遷移、擴增和發(fā)育機制。方法 運用尼氏(Nissl)染色、蘇木精-伊紅(htoxylin eosin, H-E)染色和免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique, IF)觀察E11.5小鼠胎盤(placenta， PL)、卵黃囊(yolk sac, YS)、主動脈-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonephros, AGM)區(qū)、胎肝(fetal liver, FL)和頭部(head, Hd)的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)變化，以及運用實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)(real-time quantitative， PCR， detecting system， QPCR)檢測HSC相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果 Nissl和H-E染色結(jié)果顯示E11.5小鼠AGM區(qū)背主動脈、PL血管迷路、YS血管、Hd腦血管和FL血竇富含血細(xì)胞；CD34、CD45、CD133、c-kit、Sca-1和Runx1在不同造血部位均有表達(dá)(P<0.05)，其中PL表達(dá)水平顯著高于其他造血部位(P<0.05)；IF結(jié)果顯示CD34在不同造血部位均有表達(dá)，YS血管和PL迷路血管呈強陽性；AGM區(qū)背主動脈和泌尿生殖嵴內(nèi)皮細(xì)胞、Hd腦血管周圍可見CD45呈弱陽性，而FL則顯示CD45為陰性。c-kit和CD133在YS血管和PL迷路血管同為強陽性。結(jié)論 HSC產(chǎn)生關(guān)鍵時期，胚鼠PL和YS中HSC發(fā)育最旺盛。永久造血起源于小鼠胚內(nèi)AGM區(qū)，而不同造血部位HSC的遷移與血管內(nèi)皮細(xì)胞密切相關(guān)，HSC可能通過AGM區(qū)血管內(nèi)皮遷移進(jìn)入血液循環(huán)，首先到達(dá) PL的血管迷路，然后定植于FL，擴增或維持HSC。

組織學(xué)； 形態(tài)學(xué)； 造血干細(xì)胞； 造血部位； 胎鼠

造血的研究經(jīng)過漫長的探索，目前已經(jīng)在小鼠胚胎卵黃囊(Yolk sac, YS)、主動脈-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonephros，AGM)區(qū)、胎盤(placenta, PL)和胎肝(fetal liver, FL)中發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell, HSC)的存在[1]，而胚胎11.5d(embryonic 11.5d, E11.5)則為HSC產(chǎn)生的關(guān)鍵時期[2-3]。近來研究顯示，小鼠頭部(Head, Hd)亦為HSC的發(fā)育位點[4]。然而，對于HSC產(chǎn)生的關(guān)鍵時期胚鼠不同造血部位的形態(tài)學(xué)與組織學(xué)比較研究尚未見報道。為了推進(jìn)我國造血系統(tǒng)的基礎(chǔ)和臨床研究，本實驗旨在探討E11.5小鼠不同造血部位的解剖結(jié)構(gòu)和HSC的表達(dá)水平、定位及形態(tài)，以期為小鼠HSC起源、遷移、擴增及發(fā)育機制提供直接的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗小鼠

6～8周齡雌、雄性清潔級ICR小鼠(體質(zhì)量： 28～35g)，購買自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院實驗動物中心。開展的所有實驗動物研究符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見的要求》。

1.2 試劑和實驗器材

1×磷酸鹽緩沖液(1×PBS，索萊寶，北京)、4%多聚甲醛(PFA，賽戈，上海)、胎牛血清(FBS, Gibco, USA)、0.25%胰酶(Gibco, USA)、蘇木精-伊紅染料(H-E，索萊寶，北京)、Nissl染料、PrimeScriptTM RT試劑盒(Takara, Japan)、HieffTM qPCR SYBR?Green Master Mix(翊圣，上海)、TRIzol(Invitrogen, USA)、CD34(BD, USA)、CD117(Cat.553356, BD, USA)、CD45(Cat. 35-0451, eBioscience, USA)、CD133(eBioscience, USA)、分析天平、70目尼龍過濾網(wǎng)、眼科剪刀兩把、眼科鑷子兩把、胰島素針2支、35mm和100mm培養(yǎng)皿、15ml EP管、解剖顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、切片機、ABI 7900HT 實時定量PCR儀、Eppendorf 5702R低溫離心機。

1.3 方法

1.3.1 E11.5小鼠不同造血部位的獲取 于傍晚將ICR雌、雄小鼠按3∶1合籠過夜，次日清晨觀察到陰栓的雌鼠予以分籠喂養(yǎng)，記為胚齡0.5d(E 0.5)。于雌鼠受孕后11.5d取出胎鼠PL、YS、Hd、AGM區(qū)和FL組織。操作方法： 頸椎脫臼處死妊娠小鼠后用75%酒精噴灑腹部，剪開腹腔，暴露子宮，剪斷子宮頸與子宮系膜，用鑷子將子宮拉出體腔，立即放入含10%FBS的PBS培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放在解剖顯微鏡下分別剝除胎膜和PL；分離出YS；截斷胎鼠Hd；截取胎鼠前、后肢芽中間部分，去除背部體節(jié)和腸系膜分離獲取AGM區(qū)；打開胸腔，暴露內(nèi)臟，小心分離FL。

1.3.2 E11.5小鼠整胚Nissl染色 將E11.5小鼠整胚(含YS)和PL用4% PFA固定過夜，次日清晨更換25%蔗糖脫水過夜，24h后進(jìn)行標(biāo)本縱斷面冰凍組織切片，行Nissl染色，顯微鏡下觀察不同造血部位的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.3 E11.5小鼠整胚H-E染色 將E11.5小鼠整胚(含YS)和PL用4% PFA固定過夜，次日清晨更換25%蔗糖脫水過夜，24h后進(jìn)行標(biāo)本縱斷面冰凍組織切片，行H-E染色，顯微鏡下觀察不同造血部位的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.4 實時定量基因擴增熒光檢測

1.3.4.1 RNA提取 使用TRIzol?(美國生命技術(shù)公司)分別提取E11.5不同造血部位，包括PL、YS、Hd、AGM區(qū)和FL的總RNA，利用分光光度儀測量RNA濃度。

1.3.4.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄 使用PrimeScriptTMRT試劑盒(RR047A, Takara)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，具體步驟如下： (1) 去除RNA中的基因組DNA： 400ng RNA，加入2.0μl 5×gDNA Eraser Buffer，1.0μl gDNA Eraser，用RNase Free水補齊至10μl。42℃反應(yīng)2min后立即放置冰上。(2) RNA反轉(zhuǎn)錄： 在上一步反應(yīng)完成的10μl體系基礎(chǔ)上，加入1.0μl PrimeScript RT Enzyme Mix, 1.0μl RT Primer Mix，4.0μl 5×PrimeScript Buffer, 用 4.0μl 的RNase Free水補齊至20μl。37℃反應(yīng) 15min，85℃反應(yīng)5s，4℃ 終止反應(yīng)。

1.3.4.3 QPCR 采用HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(High Rox Plus)(11203ES03，上海翊圣生物科技有限公司)，具體反應(yīng)體系如下： Master Mix(High Rox Plus)5μl，上游引物0.2μl，下游引物 0.2μl，cDNA 50ng，RNase Free水補齊至10μl。應(yīng)用ABI 7900HTPCR儀進(jìn)行反應(yīng)： 95℃ 5min預(yù)變性；95℃解鏈10s，60℃反應(yīng)30s，40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，確保反應(yīng)的質(zhì)量和效率。每個樣本(PL、YS、Hd、AGM區(qū)和FL)均取三只孕鼠，每只孕鼠取7個胚胎的PL、YS、Hd、AGM區(qū)和FL，重復(fù)三次。本研究中各基因引物序列如下(5′～3′)，見表1。

表1 各基因引物序列

1.3.5 免疫熒光 烤溫箱55℃烤片30min。滴加一抗(1∶500)，4℃冰箱過夜。滴加二抗(HAM，1∶500)，室溫孵育 3h，再滴加三抗Cy3(1∶1000)，Hoechest33258(1∶2000)，避光孵育1h。晾干，75%甘油封片。

2 結(jié) 果

2.1 E11.5小鼠不同造血部位

顯微鏡下可見此時胚胎血液循環(huán)已經(jīng)建立。PL呈圓盤狀；YS為一層富含血管的透明膜囊，膜囊上卵黃動脈(vitelline artery, Va)清晰可辨，胚胎被包裹在內(nèi)。Hd血管明顯，心臟呈橢圓形，F(xiàn)L位于心臟下方，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯。AGM區(qū)為去除背側(cè)神經(jīng)管后的下方條形組織，中空結(jié)構(gòu)，背主動脈清晰可見，見圖1。

圖1 E11.5小鼠不同造血部位解剖示意圖Fig.1 Anatomical diagrams of multiple hematopoietic at E11.5 mice圖a： E11.5小鼠單個子宮；b： 剝除胎膜、胎盤后，由卵黃囊(用YS表示)包裹的胚胎；c： 剝離YS，以及卵黃動脈和臍帶；d： 完整的小鼠胚胎，頭部(用Hd表示)以及胎肝(用FL表示)；e： 截取小鼠上肢芽(用ALb表示)和下肢芽(用PLb表示)之間的部分，以及背主動脈(用Ao表示)；f： 去除背側(cè)神經(jīng)管后分離得到AGM區(qū)

2.2 E11.5小鼠PL和整胚Nissl染色結(jié)果

Nissl染色結(jié)果顯示： Hd間腦漏斗狀凹槽處可見散在的血細(xì)胞；YS邊緣曲折，可見血細(xì)胞分布；FL肝細(xì)胞呈索狀排列，F(xiàn)L中不規(guī)則血竇明顯；AGM區(qū)背主動脈腔內(nèi)可見較多的造血細(xì)胞，生殖嵴腺可見圓形中腎管；PL為盤型，最外層為絨毛膜板(chorionic plate, CP)，中間為胎盤迷路(labyrinthine placenta, Lb)，Lb中有很多附著薄層內(nèi)皮細(xì)胞的血管，血管腔內(nèi)富含血細(xì)胞，見圖2。

圖2 E11.5小鼠整胚Nissl染色Fig.2 Nissl staining of whole embryo at E11.5 mice圖a： 發(fā)育第11.5天小鼠完整胚胎，Nissl染色(×40)；b： 頭部，“→”代表端腦泡，“△”代表第四腦室(×40)；c： 卵黃囊，“△”代表血細(xì)胞(×200)；d： 胎肝，“※”代表胎肝血細(xì)胞(×100)；e： AGM區(qū)，“→”中腎管(午非管)，“△”代表背主動脈(×100)；f： 完整胎盤，最外圍絨毛膜板用CP表示，中間胎盤迷路用Lb表示(×40)；g： Lb血管腔內(nèi)富含血細(xì)胞(×200)；小圖bo、co、do、eo、go分別為原b、c、d、e、g圖的基礎(chǔ)上擴大2倍，下方標(biāo)尺為50μm?！?0下方標(biāo)尺代表500μm；×100下方標(biāo)尺代表200μm；×200下方標(biāo)尺代表50μm

2.3 E11.5小鼠PL和整胚H-E染色結(jié)果

H-E染色結(jié)果顯示： 細(xì)胞核被染成深藍(lán)紫色，細(xì)胞漿被染成粉紅色，血細(xì)胞呈鮮紅色；Hd第三、四腦室壁、間腦漏斗狀凹槽處可見散在的血細(xì)胞；YS邊緣曲折，血島細(xì)胞較大，核仁明顯；FL中可見肝細(xì)胞呈不規(guī)則的索狀，胞核較大，肝細(xì)胞索之間相互連接成網(wǎng)并與血竇相互交錯，血竇形狀不規(guī)則，內(nèi)含造血細(xì)胞，個別細(xì)胞胞核較大；胎盤為盤型，可見Lb中有很多附著薄層內(nèi)皮細(xì)胞的血管，形狀不規(guī)則，血管管腔內(nèi)富含血細(xì)胞，且在CP大血管中含有許多大核細(xì)胞；背主動脈由1～2層扁平細(xì)胞組成，腔內(nèi)可見較多的血細(xì)胞，胞核圓形，見圖3。

圖3 E11.5小鼠整胚H-E染色Fig.3 H-E staining of whole embryo at E11.5 mice圖a： 發(fā)育第11.5天小鼠完整胚胎，蘇木精-伊紅染色(×40)；b： 頭部，“△”代表間腦漏斗狀區(qū)域內(nèi)血細(xì)胞(×200)；c： 卵黃囊，“△”代表血細(xì)胞(×200)；d： 胎肝，“△”代表FL血細(xì)胞(×200)；e： AGM區(qū)，“△”代表背主動脈血細(xì)胞(×200)；f： 完整胎盤(×40)；g： Lb血管腔內(nèi)富含血細(xì)胞(×200)；小圖bo、co、do、eo、go(×400)，下方標(biāo)尺代表50μm；×40下方標(biāo)尺代表500μm；×200下方標(biāo)尺代表50μm

2.4 HSC相關(guān)基因在E11.5小鼠不同造血部位中的表達(dá)

運用QPCR技術(shù)分析E11.5小鼠胚胎AGM區(qū)、PL、YS、Hd和FL中HSC相關(guān)基因的表達(dá)差異，見圖4。結(jié)果顯示CD34、CD45、CD133、c-kit、Sca-1，以及 HSC發(fā)育調(diào)控分子的主要轉(zhuǎn)錄因子Runx1在E11.5均有表達(dá)。

在造血組織PL中，CD34 、CD45、c-kit、Sca-1和Runx1表達(dá)明顯高于AGM區(qū)對照組(P<0.05)；而CD133表達(dá)與AGM區(qū)之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

FL中的c-kit和Runx1表達(dá)水平較AGM區(qū)升高(P<0.05)；E11.5中CD34、CD45、CD133和Sca-1在FL均有表達(dá)，但與AGM區(qū)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 免疫熒光

冰凍切片的免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎發(fā)育過程中，造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cells， HSPC)的標(biāo)志物CD34在不同的造血部位(PL、YS、AGM區(qū)、Hd和FL)中均有表達(dá)，并且在PL和YS中CD34、CD45、CD133和c-kit表達(dá)均為強陽性。

PL中HSC陽性細(xì)胞主要分布于Lb血管周圍內(nèi)皮細(xì)胞及腔內(nèi)血細(xì)胞，且細(xì)胞核大，表明內(nèi)皮生血活動的發(fā)生；在YS中很多細(xì)胞并不表達(dá)HSC標(biāo)志物，而表達(dá)的部位也主要集中于YS血管周圍，且較薄胞質(zhì)中常見表達(dá)；CD34在頭部腦血管周圍為陽性，CD45表現(xiàn)為散在的幾個弱陽性細(xì)胞，而CD133和c-kit未見表達(dá)。而在AGM區(qū)和FL中只有散在的幾個細(xì)胞為陽性；在AGM區(qū)背主動脈(dorsal aorta, Ao)內(nèi)皮細(xì)胞和泌尿生殖嵴(urogenital ridges， UGR)內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)CD34弱陽性表達(dá)；而非生血組織FL，作為HSC的擴增場所，不表達(dá)CD45、CD133和c-kit。FL中CD34陽性細(xì)胞數(shù)目也非常稀少，表達(dá)呈弱陽性，見圖5。

圖4 QPCR檢測不同造血部位HSC相關(guān)基因的表達(dá)情況Fig.4 The expression of HSC related genes in multiple hematopoietic sites by qPCR

圖5 免疫熒光檢測不同造血部位HSC相關(guān)基因的表達(dá)情況Fig.5 The expression of HSC related genes in multiple hematopoietic sites by immunofluorescenceE11.5不同造血部位HSC反應(yīng)，箭頭所示為陽性細(xì)胞，最右下角白色“—”表示標(biāo)尺，大圖為50μm(×200)，小圖為25μm(×400)

3 討 論

哺乳動物造血分為原始造血和永久造血，第一次出現(xiàn)的造血是原始造血，小鼠發(fā)生于E7.5 YS血島，HSC首次出現(xiàn)于E9 YS血島[5-6]。永久造血的發(fā)生晚于原始造血，一般認(rèn)為小鼠胚胎HSC起源于E10.5 AGM區(qū)，到E11.5時HSC數(shù)量達(dá)到峰值，E12.5 AGM區(qū)消失。而E11時HSC可能通過臍動脈遷移至PL，尤其是在E11～E12 Lb中HSC數(shù)量急劇增加[7-8]。隨后，HSC通過胎兒血液循環(huán)逐漸遷移至FL，在E13.5后，HSC在FL中大量增殖、分化，而PL中HSC數(shù)量開始逐漸減少。最終BM取代FL成為HSC的主要來源。E10～E12是小鼠胚胎造血的關(guān)鍵時期，因而本研究選取E11.5小鼠不同造血部位進(jìn)行了相關(guān)的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)研究。

胚胎中HSC在遷移至FL之前數(shù)量非常稀少，而目前胚胎HSC缺乏特異性的標(biāo)志物，CD34選擇性地表達(dá)于短期HSC、造血祖細(xì)胞、髓系祖細(xì)胞、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞和小血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，被認(rèn)為是HSPC的標(biāo)志物[9]。證明擁有完全的再建能力的小鼠HSC也可以是CD34陰性。HSC可能是CD34+或CD34-。另外，CD133+富集的亞群與CD34+富集的亞群擴增方式相似，可保留多系增殖的能力[10]。因此，同為HSC標(biāo)志物的CD133可作為用CD34篩選HSC 和體外擴增的補充。HSC膜上還表達(dá)c-kit，其配體分子HSC因子(stem cell factor, SCF)對HSC的分化至關(guān)重要。干細(xì)胞抗原1(Sca-1)在造血組織和非造血組織中均有表達(dá)，可能參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞和T細(xì)胞的活化[11]。本研究選用多種表面標(biāo)志物探索E11.5不同造血部位的組織學(xué)特征。

PL是高度血管化的造血器官，介導(dǎo)母胎氧氣和養(yǎng)分交換，對小鼠胚胎存活與發(fā)育至關(guān)重要[12]。Christos等[13]發(fā)現(xiàn)小鼠PL獨立于其他造血器官，PL造血形成包含兩種不同的血管區(qū)： 一個是能產(chǎn)生HSPC的絨毛膜板大血管，另一個是能產(chǎn)生HSPC的迷路血管。通過Nissl染色，可以清楚地看到組織結(jié)構(gòu)和血細(xì)胞的分布，但是并不能分辨細(xì)胞核的大小，H-E染色可以清楚地看到在Lb中有很多附著薄層內(nèi)皮細(xì)胞的血管，形狀不規(guī)則，血管腔內(nèi)富含血細(xì)胞，細(xì)胞較小，血管周圍富有一層核仁明顯的細(xì)胞，并散在分布于血管腔內(nèi)；其次，PL最外層CP大血管中，許多細(xì)胞的核仁較大。免疫熒光也顯示這些部位的細(xì)胞為CD34強陽性。為了鑒定造血組織中是否有HSC 的存在，從表型特征上看其是否有表達(dá)CD34、CD133、c-kit等。E11.5 PL中QPCR結(jié)果顯示CD34、CD45、CD133、c-kit、Sca-1和Runx1明顯高表達(dá)，說明E11.5時PL中產(chǎn)生大量的造血細(xì)胞；而AGM區(qū)HSC表達(dá)數(shù)量卻比PL低，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫熒光顯示CD34、CD45、CD133和c-kit為強陽性，均表達(dá)于Lb血管薄層內(nèi)皮細(xì)胞及腔中血細(xì)胞。證實了小鼠胚胎PL迷路血管的內(nèi)皮細(xì)胞具有生血潛能，E11時HSC遷移至PL，E11～E12 HSC數(shù)量急劇增加，即HSC擴散的第一個適宜位置是胎盤的血管迷路。

小鼠胚胎YS是一層富含血管的胚外膜囊，由臟層卵黃囊(visceral yolk sac， VYS)和壁卵黃囊(parietal yolk sac, PYS)組成，主要為紅系和髓系細(xì)胞。而Yamasaki等[14]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠E9.5～E14.5均有CD45和c-kit的表達(dá)，說明E11.5的YS確實產(chǎn)生了T細(xì)胞、B細(xì)胞各系細(xì)胞等。YS邊緣曲折，不規(guī)則，免疫熒光顯示CD34、CD45、CD133和c-kit均為強陽性，但是在YS中很多細(xì)胞并不表達(dá)HSC標(biāo)志物，而且表達(dá)的部位也主要集中于YS血管周圍，常見表達(dá)于較薄胞質(zhì)中。Nissl染色和 H-E 染色顯示血管中心血細(xì)胞較大。E11.5小鼠YS中CD34、CD45、CD133、Sca-1和Runx1均低表達(dá)(P<0.05)，與AGM區(qū)比較，沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明HSC在YS中的擴增并不明顯。

研究已證實小鼠AGM區(qū)HSC全部富集于背主動脈腹側(cè)。本實驗發(fā)現(xiàn)E11.5 的AGM區(qū)有表達(dá)CD45結(jié)果。免疫熒光結(jié)果顯示在AGM區(qū)背主動脈腹側(cè)分布有散在的幾個CD34和CD45陽性細(xì)胞。背主動脈由血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，AGM區(qū)的產(chǎn)生被認(rèn)為是內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化 (endothelial-to-hematopoietic transition, EHT)而成。只在AGM區(qū)背主動脈和泌尿生殖嵴內(nèi)皮細(xì)胞可見表達(dá)，充分證明了內(nèi)皮生血活動的發(fā)生。CD133和c-kit也未見明顯表達(dá)。這也暗示了在胎肝發(fā)育過程中，生血細(xì)胞與生血內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用至關(guān)重要。

眾所周知，小鼠AGM區(qū)是胚內(nèi)HSC發(fā)生位點。研究發(fā)現(xiàn)Hd也是小鼠胚胎造血發(fā)生位點，頭部間腦漏斗狀凹槽處可見明顯的散在血細(xì)胞HSC共表達(dá)CD34和c-kit，證實小鼠胚胎頭部腦血管內(nèi)皮細(xì)胞可能具生血潛能。

在E11時YS和AGM區(qū)的HSC就開始遷移至FL，直到E13.5時HSC才開始在FL中增殖、分化，隨后FL成為主要的造血器官。E11.5的FL中存在巨核祖細(xì)胞(megakaryocyte progenitors, MKPs)，表達(dá)數(shù)個肝臟特異性蛋白，比如甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)，但是這并不像成體骨髓中的巨核細(xì)胞(megakaryocytes, MKs)，且胚胎MKPs顯示CD45為陰性[15]。本實驗H-E染色顯示在整個FL中散在有很多血細(xì)胞，免疫熒光顯示FL間隙腔中血細(xì)胞并不表達(dá)，只有散在的幾個細(xì)胞呈現(xiàn)為CD34陽性，考慮為干細(xì)胞。而QRT-PCR結(jié)果顯示CD45表達(dá)很低，幾乎不表達(dá)，免疫熒光也未見CD45表達(dá)。其他干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和c-kit也均未見表達(dá)。值得一提的是，Victoria[16]發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段的肝干細(xì)胞也表達(dá)HSC表面標(biāo)志物CD34。由此說明，從陽性細(xì)胞形態(tài)和定位看，表達(dá)的極少數(shù)陽性細(xì)胞很有可能為肝干細(xì)胞[17]。上述結(jié)果表明，在E11.5小鼠FL肝干細(xì)胞主要富集于血管周圍，這里可能是肝干細(xì)胞或肝造血干細(xì)胞的儲備區(qū)。

綜上所述，PL、YS、Hd、AGM區(qū)和FL中的HSC有相同的表面標(biāo)志物CD34，說明這些造血位點可能支持HSC自我更新、分化和遷移。而造血關(guān)鍵是HSC的產(chǎn)生和HSC池的擴增，不同造血組織中檢測到的HSC 并不能確定這些組織是否能夠產(chǎn)生擴增或維持HSC。HSC產(chǎn)生的關(guān)鍵時期，胚鼠PL和YS中HSC發(fā)育最旺盛。永久造血起源于小鼠胚內(nèi)AGM區(qū)，而不同造血部位HSC的遷移與血管內(nèi)皮細(xì)胞密切相關(guān)，HSC可能通過AGM區(qū)血管內(nèi)皮遷移進(jìn)入血液循環(huán)，首先到達(dá) PL的血管迷路，然后定植于FL，擴增或維持HSC。目前人們在造血領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，胚胎造血細(xì)胞發(fā)生與發(fā)育和血液系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生之間相互關(guān)系的深入研究，將促進(jìn)血液疾病相關(guān)干細(xì)胞的靶向治療[27]。

相信隨著研究的不斷深入，胚胎造血基礎(chǔ)研究也將會取得進(jìn)一步的成功，并有利于再生醫(yī)學(xué)、基因靶向治療血液類疾病、先天性免疫相關(guān)疾病、擴增臍帶血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用。

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Morphological and histochemical study of fetal mice in multiple hematopoietic sites

LIYa-mei1,LIANGAi-bin2,WANGJun-bang2,FANGXia1,ZHANGYan1,ZHANGHong1

(1. Dept. of Clinical Pharmacology, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China; 2. Dept. of Hematology, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To observe the anatomical structure and related gene expression in multiple hematopoietic sites of fetal mice at embryonic 11.5 d (E11.5). Methods The morphology and histology were observed by using Nissl staining, Hematoxylin and Eosin (HE) staining, and immunofluorescence technique; and the mRNA expression of hematopoietic stem cell (HSC) related genes was detected by Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) at different hematopoietic sites, including the placenta (PL), yolk sac (YS), aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, head (Hd) and fetal liver (FL) of fetal mice at E11.5. Results Nissl and HE staining indicated that placenta labyrinthica, blood vessel of yolk sac, dorsal aorta of AGM, the cerebrovascular head and fetal liver blood sinus contained abundant amount of blood cells. CD34, CD45, CD133, c-kit, sca-1 and Runx1 were expressed significantly at different hematopoietic sites (P<0.05), and compared with other hematopoietic sites, the expression of HSC marker was significantly high in PL(P<0.05). Immunofluorescence technique demonstrated that CD34+HSC was expressed at different hematopoietic sites, and strongly positive in placenta vascular labyrinth and blood vessels of yolk sac. Additional HSC marker CD45 was lower expressed at dorsal aorta and urogenital ridges of AGM region, head cerebrovascular region， but CD45-cells were present in the fetal liver. Besides, vascular labyrinth of placenta and blood vessel of yolk sac was highly expressed with c-kit and CD133. Conclusion This study demonstrates that HSCs are the most active in embryonic mice PL and YS during a key period of HSC emergence. Definitive hematopoiesis originates from AGM region, and migration of HSCs in multiple hematopoietic sites is closely to the endothelial cells. HSCs may migrate through the vascular endothelial, the first niche for expansion of blood stem cells is the placenta’s vascular labyrinth, HSCs engraft in FL, then amplify or maintain.

morphology; histology; hematopoietic stem cell; hematopoietic sites; fetal mice

10.16118/j.1008-0392.2016.03.001

2016-03-22

李亞梅(1989—)，女，碩士研究生.E-mail： heartlove616@163.com

張 虹.E-mail： hongzh97@#edu.cn

R 551

A

1008-0392(2016)03-0001-07