激光共聚焦掃描顯微鏡的光學(xué)設(shè)計(jì)

張洪飛+談夢(mèng)科+及少勇+李龍譚+郭漢明

摘要： 為獲得較高分辨率的細(xì)胞圖像，設(shè)計(jì)了激光共聚焦光學(xué)系統(tǒng)。通過(guò)較復(fù)雜結(jié)構(gòu)物鏡實(shí)現(xiàn)了照明光路系統(tǒng)和發(fā)射光路系統(tǒng)的設(shè)計(jì)。用Zemax對(duì)照明光路和發(fā)射光路進(jìn)行了設(shè)計(jì)，仿真過(guò)程中照明光路的聚焦彌散斑直徑小于1 μm，照明針孔處的聚焦彌散斑直徑小于20 μm，發(fā)射光路的聚焦彌散斑直徑小于20 μm，同時(shí)照明光路和發(fā)射光路的MTF曲線接近衍射極限，達(dá)到較理想的情況。

關(guān)鍵詞： 激光共聚焦； 光學(xué)設(shè)計(jì)； 照明光路系統(tǒng)； 發(fā)射光路系統(tǒng)； Zemax

中圖分類號(hào)： TH 703 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A doi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2016.03.006

文章編號(hào)： 1005-5630（2016）03-0221-05

Abstract： In order to obtain the high-resolution cell image，we designed a laser scanning confocal optical system.The light system and emission system were realized based on the objective of complex structure.The Zemax was used for the system optical design.In the simulation the focal spot size of light system was less than 1μm，and the focal spot size was less than 20 μm at the light pinhole position.The focal spot size was less than 20 μm at the emission pinhole position.At the same time light system and emission system of the MTF curve was close to the diffraction limit to reach the ideal situation.

Keywords： laser confocal scanning； optical design； lighting system； emission system； Zemax

引 言

激光共聚焦掃描顯微鏡（LCSM）是以激光作為光源[1]，激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)焦平面上標(biāo)本進(jìn)行掃描，標(biāo)本上的聚焦點(diǎn)在與其共軛的探測(cè)針孔的位置成像[2]，這樣所得到的共焦圖像是樣本的光學(xué)橫斷截面的圖像。由此可知，激光共聚焦掃描顯微鏡的成像原理與普通的光學(xué)顯微鏡明顯不同，它以抑制焦點(diǎn)外物點(diǎn)信息的光信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)高分辨率，再采用掃描技術(shù)來(lái)彌補(bǔ)視場(chǎng)小的缺點(diǎn)[3]。理想情況下，實(shí)現(xiàn)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的成像。與普通光學(xué)顯微鏡相比，它可以獲得更高的橫向分辨率，并且具有較高的縱向分辨率。利用這樣的特性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品三維結(jié)構(gòu)重建和測(cè)量分析的工作，為研究生物組織等物體結(jié)構(gòu)提供了有效的工具[4]。

本文根據(jù)LCSM工作原理設(shè)計(jì)了共聚焦掃描光學(xué)系統(tǒng)，并用Zemax對(duì)所設(shè)計(jì)光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行仿真和優(yōu)化。

1 激光共聚焦工作原理

在共焦顯微成像系統(tǒng)中，使用共焦探測(cè)針孔不但使得整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)擁有了高分辨軸向響應(yīng)特性，同時(shí)具有抗雜散光和增大對(duì)比度的優(yōu)點(diǎn)。激光共聚焦掃描顯微成像系統(tǒng)是利用物鏡使光束聚焦形成很小的光點(diǎn)，通過(guò)光點(diǎn)與樣品之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品逐點(diǎn)掃描成像。激光共聚焦掃描顯微成像采用焦點(diǎn)共軛的技術(shù)，使照明針孔、探測(cè)針孔、被照射的樣品都處在彼此的共軛位置。這樣只有在焦平面上的點(diǎn)被光源照射所激發(fā)出的熒光能夠通過(guò)探測(cè)針孔而被光電探測(cè)器所接收，焦面以外的光線或聚焦在針孔前或聚焦在針孔后，會(huì)很大程度地被抑制掉，因此共焦探測(cè)針孔的作用相當(dāng)于一個(gè)針孔濾波器，可以極大地提高激光共焦顯微成像系統(tǒng)的縱向分辨率[5]。

2 光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)過(guò)程

激光共聚焦光學(xué)系統(tǒng)由照明光路系統(tǒng)和發(fā)射光路系統(tǒng)組成。如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直擴(kuò)束透鏡組（鏡組1、2），變成一束直徑較大的平行光束，二向色鏡4使光束偏轉(zhuǎn)90°，經(jīng)過(guò)物鏡3會(huì)聚在其焦點(diǎn)上。樣品中的熒光物質(zhì)在激光激發(fā)下發(fā)射沿各個(gè)方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過(guò)物鏡、二向色鏡、高通濾波片5、聚焦透鏡（鏡組6）會(huì)聚在聚焦透鏡的焦點(diǎn)處，再通過(guò)焦點(diǎn)處的針孔7，由探測(cè)器8接收。

2.1 照明光路設(shè)計(jì)

2.1.1準(zhǔn)直擴(kuò)束系統(tǒng)

激光準(zhǔn)直擴(kuò)束系統(tǒng)由圖1中的鏡組1和透鏡2組成，其從左到右各面的參數(shù)如表1，通過(guò)改變光束束腰直徑，使激光的準(zhǔn)直性、光束平行度變高，且照明針孔位于鏡組1的聚焦點(diǎn)處，激光經(jīng)過(guò)此針孔后形成點(diǎn)光源，點(diǎn)光源不僅具有方向性強(qiáng)、發(fā)散小、亮度高的特點(diǎn)，而且具有高度的空間和時(shí)間相干性以及平面偏振激發(fā)等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。為了得到較小的聚焦光斑，聚焦光路選擇兩個(gè)透鏡組合（鏡組1）的形式，材料選擇ZF14，其聚焦光斑點(diǎn)列圖如圖2所示，光斑直徑小于20 μm。此處照明針孔和探測(cè)針孔幾何尺寸一致。探測(cè)針孔的大小與艾里斑的直徑相關(guān)，針孔大小為艾里斑經(jīng)過(guò)光學(xué)系統(tǒng)成像的大小時(shí)，探測(cè)器接收光能量較高[6-7]。

2.1.2 顯微物鏡

顯微物鏡是LSCM中最為重要的器件，對(duì)成像質(zhì)量起決定性作用，而數(shù)值孔徑是判斷物鏡性能的重要參數(shù)，表征物鏡的聚光能力，增強(qiáng)物鏡的聚光能力，可提高物鏡的分辨率。根據(jù)初始結(jié)構(gòu)[10]校正軸上點(diǎn)球差，并保證較大的數(shù)值孔徑。圖1物鏡3從上到下各面的參數(shù)如表2所示，點(diǎn)列圖如圖3所示。

由圖3可知此物鏡的像差很小，彌散斑直徑小于1 μm。由數(shù)值孔徑計(jì)算公式NA=nsinθ，可得數(shù)值孔徑為0.69。同時(shí)數(shù)值孔徑?jīng)Q定物鏡的衍射分辨率σ的大小，由σ=0.61λNA且物鏡的工作波長(zhǎng)為405 nm，得其衍射分辨率為0.358 μm。物鏡的MTF曲線如圖4所示，其接近于衍射極限，因此具有極高的分辨率[8-9]。

2.1.3照明光路

將準(zhǔn)直擴(kuò)束光路和物鏡組合在一起并添加二向色鏡的反射面和光闌，得到照明光路的初始結(jié)構(gòu)。其中照明光源是方向性、單色性很好的激光，采用平行入射的方式進(jìn)入光學(xué)系統(tǒng)，因此該照明系統(tǒng)只存在軸上點(diǎn)球差。對(duì)該初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，將準(zhǔn)直擴(kuò)束光路的半徑設(shè)為變量，在默認(rèn)評(píng)價(jià)函數(shù)中加入焦距控制操作數(shù)，使擴(kuò)束比例達(dá)1.875，然后進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化。再將物鏡的所有半徑以及像距設(shè)為變量，采用默認(rèn)評(píng)價(jià)函數(shù)優(yōu)化。優(yōu)化后的MTF曲線和照明光路點(diǎn)列圖如圖5，圖6所示。由圖可知該照明光路的彌散斑直徑小于1 μm，MTF曲線接近其衍射極限，因此該照明光路具有極高的點(diǎn)光源分辨率。優(yōu)化后物鏡的數(shù)值孔徑變?yōu)?.686 8。

2.2 發(fā)射光路設(shè)計(jì)

將之前設(shè)計(jì)的物鏡和一個(gè)雙膠合透鏡（鏡組6）組合在一起并添加二向色鏡的折射面，由此得到了發(fā)射光路的初始結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)射光路（因系統(tǒng)不能改變物鏡），只對(duì)起聚焦作用的雙膠合透鏡進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)半徑為變量，并逐漸修改厚度，用默認(rèn)評(píng)價(jià)函數(shù)進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化。優(yōu)化后的發(fā)射光路點(diǎn)列圖如圖7所示，雙膠合透鏡從下到上各面的參數(shù)如表3所示。

優(yōu)化后發(fā)射光路的MTF曲線分別如圖8所示。由圖可知彌散斑直徑小于20 μm，而探測(cè)針孔直徑等于艾里斑成像的直徑D，即

D=β1.22λNA

式中：β為系統(tǒng)的放大倍率；λ為發(fā)射光的波長(zhǎng)；NA為物鏡的數(shù)值孔徑。且β=40，λ= 480 nm，NA=0.686 8，由此得D=34 μm，探測(cè)針孔直徑為35 μm。因此彌散斑直徑小于20 μm，滿足激光共聚焦探測(cè)針孔直徑為35 μm的要求。發(fā)射光路的MTF曲線接近衍射極限，因此該發(fā)射光路具有極高的光學(xué)傳輸效率。

3 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)了激光共聚焦掃描顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，采用結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的物鏡以及簡(jiǎn)單的準(zhǔn)直擴(kuò)束系統(tǒng)和二向色鏡反射面實(shí)現(xiàn)了照明光路的設(shè)計(jì)，物鏡以及簡(jiǎn)單的雙膠合透鏡和二向色鏡的折射面實(shí)現(xiàn)了發(fā)射光路的設(shè)計(jì)。整個(gè)共聚焦系統(tǒng)中照明光路的聚焦彌散斑直徑小于1 μm，照明針孔處的聚集光斑直徑小于20 μm，滿足照明針孔直徑為35 μm要求。發(fā)射光路的聚集光斑直徑小于20 μm，滿足探測(cè)針孔直徑為35 μm的要求，而且照明光路和發(fā)射光路的MTF曲線都比較接近衍射極限，優(yōu)化的較為理想，具有比較好的光學(xué)傳輸效率。因此激光共聚焦掃描顯微鏡被廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)、生物技術(shù)和納米科學(xué)等領(lǐng)域。然而整個(gè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)也有可以改進(jìn)的地方，此系統(tǒng)的物鏡數(shù)值孔徑較小，可以進(jìn)一步提高物鏡的的數(shù)值孔徑，從而提高激光共聚焦光學(xué)系統(tǒng)的光學(xué)分辨率。

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（編輯：張磊）