里氏木霉QM9414尿嘧啶缺陷型轉(zhuǎn)化體系改進(jìn)和β-葡萄糖苷酶的過量表達(dá)

鐘立霞，錢遠(yuǎn)超，戴美學(xué)，鐘耀華（山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 5004；山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 5000）

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里氏木霉QM9414尿嘧啶缺陷型轉(zhuǎn)化體系改進(jìn)和β-葡萄糖苷酶的過量表達(dá)

鐘立霞1,2，錢遠(yuǎn)超2，戴美學(xué)1，鐘耀華2
（1山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100）

摘要：里氏木霉是廣泛應(yīng)用于纖維素酶生產(chǎn)的工業(yè)真菌，但高產(chǎn)突變株遺傳操作困難，限制了菌種改良。首先利用定點(diǎn)整合策略敲除里氏木霉突變株QM9414的pyr4基因，成功構(gòu)建尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株QP4，其遺傳轉(zhuǎn)化效率顯著提高，而且產(chǎn)酶能力不受影響。進(jìn)一步在QP4中過量表達(dá)β-葡萄糖苷酶（BGL）基因bgl1，經(jīng)大量平板顯色篩選獲得2株BGL活力明顯增強(qiáng)的工程菌QPB4和QPB5，其酶活分別提高10.01倍和8.26倍。利用發(fā)酵酶液對2種不同預(yù)處理的玉米芯底物進(jìn)行水解糖化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示以酸處理玉米芯為底物時(shí)QPB4和QPB5的葡萄糖得率比QP4分別提高60.98%和52.44%，而以脫木素處理玉米芯為底物時(shí)其葡萄糖得率分別提高80.01%和86.00%。研究表明改進(jìn)里氏木霉高產(chǎn)突變株遺傳轉(zhuǎn)化體系可以顯著促進(jìn)菌株改良，提高糖化應(yīng)用效果。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；里氏木霉高產(chǎn)突變株；遺傳轉(zhuǎn)化；水解糖化；尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記；構(gòu)建和表達(dá)；生物技術(shù)；生物工程

2015-11-03收到初稿，2015-12-26收到修改稿。

聯(lián)系人：戴美學(xué)，鐘耀華。第一作者：鐘立霞（1989—），女，碩士研究生。

Received date: 2015-11-03.

Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (31370135), the Agricultural Science and Technology Achievement Transformation Fund of Shandong Province (2014No.45) and the Fundamental Research Funds of Shandong University (2015CJ005).

引　言

將生物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槿剂弦掖际谦@得可再生性能源的重要途徑，越來越受到世界各國的關(guān)注。而纖維素酶系是纖維素乙醇化過程中的關(guān)鍵酶，其生產(chǎn)成本過高限制了纖維乙醇的發(fā)展[1]。改良纖維素酶系，提高底物糖化效率，對降低酶生產(chǎn)成本、促進(jìn)纖維素轉(zhuǎn)化具有重要意義。目前纖維素酶生產(chǎn)的工業(yè)真菌包括木霉、青霉和曲霉等[2]，其中里氏木霉（Trichoderma reesei）以蛋白質(zhì)分泌量大而成為纖維素酶生產(chǎn)的主要工業(yè)菌株[3]。因此，里氏木霉的菌種改良是構(gòu)建高效纖維素酶系，提高糖化效率的最有效的途徑。

里氏木霉野生型菌株QM6a是第二次世界大戰(zhàn)期間從腐爛的軍人服裝和帆布帳篷中分離到的一種深綠色真菌[4]。隨后經(jīng)過不斷的紫外線、NTG、離子誘變等篩選，獲得了NG14、RUT-C30和QM9414等高產(chǎn)突變菌株[5]。RUT-C30和QM9414是當(dāng)前常用的里氏木霉突變菌株。過度的誘變在獲得高纖維素酶的同時(shí)也給菌株帶來了諸多負(fù)面影響，如經(jīng)過多輪誘變獲得的RUT-C30雖然比QM9414的胞外蛋白質(zhì)和纖維素酶活都大幅度提高[5]，但其生長緩慢、生孢延遲、生孢減少。而QM9414菌株生長快、產(chǎn)孢多、發(fā)酵成熟，是目前進(jìn)行酶系改良和纖維素酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究的重要模式菌株。

當(dāng)前QM9414的遺傳轉(zhuǎn)化操作主要依賴潮霉素B（hygromycin B）等抗性篩選，但抗生素價(jià)格昂貴、篩選背景較高且不方便實(shí)現(xiàn)無痕遺傳操作，而營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記可以克服上述的不足，有利于構(gòu)建高效遺傳轉(zhuǎn)化體系[6-7]。營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶（Pyr4/PyrG：木霉為Pyr4，曲霉為PyrG）是尿嘧啶核苷酸合成的一個(gè)關(guān)鍵酶，該基因的缺失將導(dǎo)致尿嘧啶核苷酸合成受阻，因此缺乏該酶的營養(yǎng)缺陷型菌株需要添加尿嘧啶/尿苷才能生長。當(dāng)pyr4基因成功轉(zhuǎn)化進(jìn)pyr4基因缺失菌株后，該基因的表達(dá)使受體菌能夠自身合成尿嘧啶/尿苷，從而不依賴尿嘧啶/尿苷生長，起到正向篩選的作用。另一方面，5′-氟乳清酸（5′-fluorooroticacid，5′-FOA）是尿嘧啶合成前體的類似物，在pyr4的作用下會(huì)產(chǎn)生對細(xì)胞有毒害物質(zhì)，所以野生型菌株在5′-FOA下不能生長，而變成pyr4基因缺失菌時(shí)就呈現(xiàn)5′-FOA抗性，從而實(shí)現(xiàn)反向篩選[8-9]。目前常用的里氏木霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是TU6，該菌是由QM9414經(jīng)射線誘變而來[10]，盡管TU6遺傳轉(zhuǎn)化效率較高，但菌株生長緩慢、生孢量少，尤其是嚴(yán)重影響了纖維素酶的表達(dá)和分泌。因此，在QM9414中定點(diǎn)敲除pyr4基因，建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，有利于通過基因工程手段實(shí)現(xiàn)工業(yè)菌株的纖維素酶系改良[6,9-13]。

里氏木霉分泌的纖維素酶主要包括3類：外切纖維素酶（CBH，EC3.2.1.91）、內(nèi)切纖維素酶（EG，EC3.2.1.4）和β-葡萄糖苷酶（BGL，EC3.2.1.21）。在降解復(fù)雜底物時(shí)BGL能夠?qū)⒗w維寡糖水解為葡萄糖，從而解除了纖維寡糖對外切酶的抑制。普遍認(rèn)為里氏木霉降解纖維素的瓶頸是BGL的不足[14]。向里氏木霉酶系中外源補(bǔ)加BGL能夠顯著提高水解纖維素作底物時(shí)的葡萄糖得率[15]。另外，在里氏木霉中本源和異源表達(dá)BGL1可以提高其纖維素酶系降解纖維素底物的能力[16-17]，但目前纖維素酶系組分中的BGL表達(dá)水平仍然不高。因此，在里氏木霉中高水平表達(dá)BGL是構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶菌株和提升纖維素酶系整體糖化效率的關(guān)鍵。

為了實(shí)現(xiàn)遺傳改良里氏木霉從而提高纖維素底物的糖化能力，本研究首先利用里氏木霉QM9414構(gòu)建了用于高效遺傳轉(zhuǎn)化的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，在此基礎(chǔ)上過表達(dá)β-葡萄糖苷酶BGL1，通過大量篩選轉(zhuǎn)化子獲得高水平表達(dá)β-葡萄糖苷酶的工程菌株，并進(jìn)一步利用不同預(yù)處理的玉米芯底物進(jìn)行了糖化應(yīng)用。

1　實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒里氏木霉（Trichoderma reesei）QM9414來源于美國菌種保藏中心（ATCC26921），TU6菌株來自奧地利維也納技術(shù)大學(xué)Christian Kubicek教授惠贈(zèng)。質(zhì)粒pTHB[18]、pAB4-1和pAN7-1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基PDA產(chǎn)孢培養(yǎng)基（g·L?1）：去皮土豆薄片200，加水煮沸30 min，8層紗布過濾，濾液添加葡萄糖20，并補(bǔ)足水分至1 L，自然pH，2%瓊脂粉。115℃滅菌30 min。

MM培養(yǎng)基（g·L?1）：葡萄糖20，KH2PO415，(NH4)2SO45，CaCl20.6，MgSO4·7H2O 0.6，蛋白胨2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005，MnSO4·H2O 0.0016，ZnSO4·7H2O 0.0014，CoCl2·2H2O 0.002，調(diào)節(jié)pH 至4.5～5.5，配固體培養(yǎng)基需添加2%瓊脂粉，菌株表型分析時(shí)將葡萄糖替換為其他碳源。115℃滅菌30 min。

里氏木霉轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（g·L?1）：葡萄糖 10，MgSO4·7H2O 1，KH2PO410，(NH4)2SO46，C6H5O7Na3·2H2O 3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005，MnSO4·H2O 0.0016，ZnSO4·7H2O 0.0014，CoCl2·2H2O 0.002，調(diào)節(jié)pH 至4.5～5.5，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基加入滲透壓穩(wěn)定劑山梨醇182.18、瓊脂粉12。115℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基（g·L?1）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉。115℃滅菌30 min。若需要加入氨芐青霉素至終濃度100 μg·ml?1。

七葉苷培養(yǎng)基（g·L?1）：CMC-Na 10，七葉苷3，檸檬酸鐵0.5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41，酵母膏 1，2.5%瓊脂粉。115℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基（g·L?1）：葡萄糖 10，CaCl21，MgSO4·7H2O 0.6，KH2PO45，(NH4)2SO42.5，玉米漿20。115℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L?1）：結(jié)晶纖維20，CaCl21，MgSO4·7H2O 0.6，KH2PO45，(NH4)2SO42.5，玉米漿20。115℃滅菌30 min。

以上培養(yǎng)基在培養(yǎng)尿嘧啶缺陷型時(shí)均需添加10 mmol·L?1的尿嘧啶。

1.1.3玉米芯底物用于纖維素酶糖化效率測定的酸處理玉米芯和脫木素處理玉米芯均來自山東龍力生物科技股份有限公司，其中酸處理玉米芯的處理方式采用Schell等[19]的方法，脫木素處理玉米芯的處理方式參照Zhao等[20]的方法。酸處理玉米芯的處理方式其化學(xué)成分為：纖維素62.6%，半纖維素2.4%,木素17.7%，灰分6.8%，其他成分為10.5%；脫木素處理玉米芯的處理方式其化學(xué)成分為纖維素65.7%，半纖維素1.8%，木素3.2%，灰分5.9%，其他成分為23.4%[21]。

1.1.4酶和試劑里氏木霉原生質(zhì)體制備所用的哈茨木霉裂解酶，酶活測定所用的pNPC、pNPG、CMC-Na購自SIGMA；酶活測定所用濾紙為Whaterman 1號濾紙；瓊脂糖凝膠回收純化、PCR純化和質(zhì)粒小提試劑盒均購自O(shè)MEGA；DNA聚合酶HiFiTaq polymerase、EasyTaq polymerase 購自TransGen；DNA GeneRuler 1 kb購自ThermoFisher Scientific；潮霉素B（Hygromycin B）購自Roche；尿嘧啶（Uracil）、5′-氟乳清酸（5′-FOA）購自BB；引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。1.1.5儀器設(shè)備臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf），恒溫?fù)u床（上海博彩生物科技有限公司），DYY-Ⅱ電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），PCR儀（Eppendorf）。

1.2方法

1.2.2里氏木霉基因組提取里氏木霉染色體的提取參照文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行。

1.2.3引物設(shè)計(jì)在里氏組數(shù)據(jù)庫（http://genome. jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）中，使用BLASTN程序搜索與釀酒酵母pryG的同源基因ura3（GenBank accession no. NC_001137.3）的基因序列同源性最高的序列。結(jié)果顯示編號為74020的蛋白同源性最高，根據(jù)注釋為乳清酸-5′-單磷酸脫羧酶，即pyr4基因序列信息，運(yùn)用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，本研究所用的引物序列見表1。

1.2.4pyr4敲除盒的構(gòu)建和黑曲霉pyrG基因片段的擴(kuò)增以里氏木霉QM9414基因組為模板，利用引物pyr4-UF1/pyr4-UR1和pyr4-DF1/pyr4-DR1分別擴(kuò)增得到1.3 kb的pyr4基因上游同源臂和1.3 kb 的pyr4基因下游同源臂；以PAN7-1質(zhì)粒為模板，利用引物hph-F1/hph-R1擴(kuò)增得到2.8 kb的潮霉素B基因。然后，利用Double-joint PCR[23]將pyr4基因上下游同源臂和潮霉素B基因利用引物pyr4-UF3/pyr4-UR3融合得到5.2 kb的pyr4敲除盒。

表1　本研究所用引物Table 1　Primers used in this study

以質(zhì)粒pAB4-l為模板，利用引物pyrG-S/pyrG-A擴(kuò)增得到2.7 kb的黑曲霉pyrG基因片段，用于回補(bǔ)pyr4敲除菌株以及與質(zhì)粒pTHB共轉(zhuǎn)化pyr4敲除菌株，從而構(gòu)建BGL1過表達(dá)菌株。

1.2.5pyr4敲除菌株、pyrG回補(bǔ)菌株和BGL1過表達(dá)菌株的構(gòu)建里氏木霉原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)主要參照文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行。

pyr4敲除菌株的構(gòu)建：將1μg pyr4敲除盒與適量里氏木霉QM9414原生質(zhì)體、100 μg·ml?1潮霉素B、1.5 mg·ml?15′-FOA混合，傾倒在已凝固的轉(zhuǎn)化平板上，30°C培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

pyrG回補(bǔ)菌株的構(gòu)建：1 μg pyrG基因片段與尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株QP4原生質(zhì)體傾倒在不含有尿嘧啶的轉(zhuǎn)化下層平板上，30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

對于初中生而言，年齡相對較小，對任何事情都具有著很大的好奇心，因此只要初中語文教師注重活躍課堂氛圍，就很容易將學(xué)生帶到相應(yīng)的情境之中，激發(fā)他們的學(xué)習(xí)興趣。在過去傳統(tǒng)的初中語文教學(xué)中，教師并不重視課堂氛圍，只是簡單地講授知識點(diǎn)，造成學(xué)生認(rèn)為語文學(xué)習(xí)枯燥乏味，出現(xiàn)排斥心理，影響到初中語文的教學(xué)質(zhì)量。因此，為了打破過去教學(xué)方法的束縛，教師應(yīng)該積極使用多元化的教學(xué)方法。在講課的過程中，教師可以面帶微笑，在課堂上營造出輕松、活躍的課堂氛圍，通過提問或是小故事等形式引導(dǎo)學(xué)生積極發(fā)言，多與學(xué)生進(jìn)行互動(dòng)。例如在講述詩歌古文時(shí)，教師可以以小組為單位舉行朗誦比賽，讓學(xué)生們扮演詩人來抒發(fā)自己的情懷等。

BGL1過表達(dá)菌株的構(gòu)建：將2 μg含有Pcbh1啟動(dòng)子控制表達(dá)bgl1表達(dá)盒（Pcbh1-bgl1）的pTHB質(zhì)粒[18]和1 μg pyrG基因片段同時(shí)與適量尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株QP4原生質(zhì)體傾倒在不含有尿嘧啶的轉(zhuǎn)化平板上，30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.2.6PCR驗(yàn)證、單孢分離和菌株表型分析PCR驗(yàn)證：參照1.2.2節(jié)的方法提取染色體，pyr4敲除菌株的驗(yàn)證利用pyr4敲除盒中潮霉素B基因驗(yàn)證引物Yhph-F1/Yhph-R1，上游染色體錨定引物Ypyr4-UF2/Yhph-R1和下游染色體錨定引物Yhph-F2/pyr4-DR1分別擴(kuò)增800 bp、3.1 kb、2.1 kb大小片段?；匮a(bǔ)菌株的驗(yàn)證PCR引物為YpyrG-F1/YpyrG-R1擴(kuò)增600 bp左右。BGL過表達(dá)菌株的驗(yàn)證以Y1/Y2為引物擴(kuò)增Pcbh1-bgl1表達(dá)盒中橫跨啟動(dòng)子和編碼區(qū)的1.0 kb片段。

單孢分離：將孢子懸液稀釋一定倍數(shù)后，在添加有0.5%的TritonX-100、1 mg·ml?1的尿嘧啶的MM固體培養(yǎng)基上涂覆或劃線培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將分離純化得到的陽性轉(zhuǎn)化子命名為QP4并生孢保存?；匮a(bǔ)菌株及BGL過表達(dá)菌株單孢分離時(shí)MM培養(yǎng)基上不需添加1 mg·ml?1的尿嘧啶。

表型驗(yàn)證：取1 μl新鮮孢子（或取菌絲塊），在加有尿嘧啶的MM平板上30℃培養(yǎng)4 d。

1.2.7生長及碳源利用情況測定菌落大小測定：取1 μl新鮮孢子點(diǎn)至不同碳源（葡萄糖、甘油、乳糖、纖維素）MM培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)60 h，記錄菌落形態(tài)并測量菌落直徑來表征菌落的大小。

1.2.8纖維素酶活測定取新鮮孢子懸液，以106個(gè)·ml?1的接種量接種于種子培養(yǎng)基，30℃、200 r·min?1振蕩培養(yǎng)36 h，以10%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200 r·min?1振蕩培養(yǎng)。誘導(dǎo)一定時(shí)間后取上清測定濾紙酶活（FPA）、內(nèi)切葡聚糖酶活（EG）、外切葡聚糖酶活（CBH）、β-葡萄糖苷酶活（BGL），F(xiàn)PA、EG活力測定參照曲音波等[24]的方法進(jìn)行，CBH、BGL活力測定參照文獻(xiàn)[25]。

1.2.9BGL表達(dá)菌株的平板定性檢測將β-葡萄糖苷酶過表達(dá)菌株在β-葡萄糖苷酶篩選培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)12 h、24 h，記錄菌落形態(tài)并測量菌落直徑大小來表征β-葡萄糖苷酶活。

1.2.10不同底物糖化分析糖化實(shí)驗(yàn)參照Cheng 等[26]的方法進(jìn)行。反應(yīng)體系為30 ml，糖化底物為5%的酸處理玉米芯、脫木素處理玉米芯，纖維素酶添加量為10 FPU·g?1底物，為了防止染菌加入0.1% NaN3，用0.1 mol·L?1pH4.8的醋酸緩沖液補(bǔ)齊至30 ml，50℃、150 r·min?1進(jìn)行糖化，取糖化24 h、48 h糖化液，利用SBA-40C（BISAS，China）生物傳感儀進(jìn)行葡萄糖的測定。

圖1　里氏木霉pyr4敲除菌株QP4的PCR驗(yàn)證圖及表型差異比較Fig.1　PCR confirmation and phenotypic assay of pyr4 deletion strain

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1里氏木霉菌株的pyr4敲除

為了在里氏木霉QM9414中敲除pyr4基因，首先利用該菌基因組擴(kuò)增得到均為1.3 kb的pyr4基因上下游同源臂與pAN7-1質(zhì)粒擴(kuò)增得到的2.8 kb潮霉素B抗性表達(dá)元件經(jīng)融合PCR得到5.2 kb的pyr4敲除盒。然后以pyr4敲除盒轉(zhuǎn)化里氏木霉QM9414原生質(zhì)體，在100 μg·ml?1潮霉素B、1.5 mg·ml?15′-FOA雙篩選壓力下初步得到2株轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過復(fù)篩、單孢分離，隨后挑取1株遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子命名為QP4，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證（圖1）。結(jié)果顯示，QP4轉(zhuǎn)化子中可以擴(kuò)增得到敲除盒潮霉素編碼區(qū)800 bp[圖1(a)左]、染色體上游錨定片段3.0 kb[圖1(a)中]和染色體下游錨定片段1.8 kb左右的條帶[圖1(a)右]，而出發(fā)菌QM9414染色體和陰性對照H2O為模板時(shí)沒有擴(kuò)展片段的條帶，與預(yù)期結(jié)果符合。這表明pyr4敲除盒已經(jīng)發(fā)生同源交換，成功插入里氏木霉QM9414染色體中，并且染色體中沒有其他位點(diǎn)的片段整合，從而在染色體水平驗(yàn)證了pyr4基因被定點(diǎn)敲除。

為了進(jìn)一步確認(rèn)pyr4基因的敲除，用來自黑曲霉（Aspergillus niger）的pyr4同源基因pyrG對QP4菌株進(jìn)行回補(bǔ)。轉(zhuǎn)化后在無尿嘧啶篩選平板上得到17個(gè)轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過PCR擴(kuò)增pyrG基因驗(yàn)證均為陽性轉(zhuǎn)化子，表明利用pyr4作為正向篩選基因可大大提高轉(zhuǎn)化效率。隨機(jī)挑取一株轉(zhuǎn)化子命名為R-pyrG，經(jīng)單孢分離傳代后進(jìn)行表型分析。圖1(b)結(jié)果顯示，出發(fā)菌株QM9414和回補(bǔ)菌株R-pyrG表型相似，在加有尿嘧啶的MM平板和不含尿嘧啶的MM平板上都生長，而敲除pyr4的QP4菌株在加有尿嘧啶的MM上平板生長，在不含尿嘧啶的MM平板上不生長。該結(jié)果說明R-pyrG能夠恢復(fù)到野生型狀態(tài)，QP4菌株的表型變化確實(shí)是由pyr4基因敲除造成的。因此，本研究成功構(gòu)建了里氏木霉pyr4基因敲除的并可用于高效遺傳轉(zhuǎn)化的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株QP4。

2.2不同碳源條件下QP4生長情況分析

為驗(yàn)證pyr4的敲除是否影響菌株的生長，本研究分析了QP4在不同碳源條件下的生長情況（圖2）。與出發(fā)菌株QM9414相比，pyr4敲除菌株QP4的菌落大小、菌落顏色和菌落蔓延狀態(tài)在不同碳源（葡萄糖、甘油、乳糖、纖維素和PDA）上均變化不大，而誘變的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株TU6菌落明顯變小且菌落顏色也有差異。其中各菌株在葡萄糖、PDA上的生長速度最快，乳糖、纖維素上次之，甘油上最慢。另外，TU6的生孢量明顯低于QP4和QM9414。對菌落大小的測定結(jié)果顯示，菌株QP4菌落大小與QM9414基本一致，而TU6菌落在葡萄糖、甘油、乳糖、纖維素條件下分別減小了35.8%、28.1%、15.5%和12.5%[圖2(b)]。以上結(jié)果顯示，不同碳源條件下pyr4敲除菌株QP4的生長并沒有受到影響，可用于后續(xù)研究。

2.3搖瓶發(fā)酵條件下QP4產(chǎn)酶情況分析

為進(jìn)一步確認(rèn)pyr4敲除對產(chǎn)酶能力的影響，本研究對QP4在產(chǎn)酶發(fā)酵條件下7 d的纖維素酶活及各組分酶活進(jìn)行測定。如圖3所示，pyr4敲除菌株QP4的濾紙酶活（FPA）、內(nèi)切葡聚糖酶活（EG）、外切葡聚糖酶活（CBH）和β-葡萄糖苷酶活（BGL）與出發(fā)菌株QM9414相比并未發(fā)生明顯變化，卻都顯著高于誘變菌株TU6。其中，QP4的FPA和CBH分別是TU6的2.13倍和2.12倍，而EG和BGL分別是TU6的1.36倍和1.35倍。該結(jié)果表明，pyr4的敲除并未影響里氏木霉原有纖維素酶的表達(dá)和分泌，而且明顯優(yōu)于誘變菌株TU6。因此，QP4可用于對里氏木霉進(jìn)行高產(chǎn)纖維素酶菌種改良的后續(xù)遺傳操作。

圖2　里氏木霉pyr4敲除菌株QP4在不同碳源下的表型分析和生長差異比較Fig.2　Phenotypic analysis and growth comparison of QM9414, QP4 and TU6 strains on different carbon sources after 60 h (Data are represented as mean of three independent experiments. Error bars express standard deviations)

圖3　里氏木霉pyr4敲除菌株纖維素酶活力分析Fig.3　Cellulase activities of T. reesei QP4, TU6 and QM9414 [Filter paper activity (FPA), endoglucanase activity (EG), cellobiohydrolase activity (CBH) and β-glucosidase activity (BGL) were measured after being induced with cellulase production medium for 7 d. Data are represented as mean ofthree independent experiments. Error bars expressstandard deviations]

2.4QP4菌株過表達(dá)β-葡萄糖苷酶改良纖維素酶系

為進(jìn)一步驗(yàn)證QP4菌株作為高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的可操作性，同時(shí)改良里氏木霉纖維素酶系組分，本研究針對里氏木霉β-葡萄糖苷酶（BGL）表達(dá)量低的問題，利用帶有強(qiáng)啟動(dòng)子Pcbh1控制表達(dá)β-葡萄糖苷酶基因bgl1表達(dá)盒（Pcbh1-bgl1）的質(zhì)粒pTHB[15]與來自黑曲霉的pyrG片段共轉(zhuǎn)化QP4。轉(zhuǎn)化平板上獲得了135個(gè)轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過PCR驗(yàn)證，123個(gè)為pyrG整合入染色體的陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子率達(dá)到91.1%，遠(yuǎn)高于潮霉素B抗性篩選的陽性轉(zhuǎn)化子效率（63%）[12]。這表明QP4可以作為pyr4篩選標(biāo)記的高效遺傳轉(zhuǎn)化菌株。

圖4　里氏木霉β-葡萄糖苷酶過表達(dá)菌株的分子驗(yàn)證和平板BGL活力檢測Fig.4　PCR analysis and detection of BGL activity on esculin substrate in bgl1 overexpression transformants

β-葡萄糖苷酶（BGL）能夠?qū)⑵呷~苷分解為七葉素，與Fe3+螯合形成黑色的螯合物，在培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)明顯的黑色暈圈，因此利用七葉苷培養(yǎng)基平板可以進(jìn)行高通量BGL表達(dá)菌株的篩選。本研究將獲得的pyrG整合陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了快速七葉苷平板檢測，挑選出2株BGL酶活顯著增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子，分別命名為QPB4和QPB5。然后進(jìn)行單孢分離和PCR驗(yàn)證，證明Pcbh1控制表達(dá)的bgl1基因成功整合到染色體中[圖4(a)]。表型分析表明，QPB4和QPB5轉(zhuǎn)化子在無尿嘧啶培養(yǎng)基上可以生長，而QP4不能生長，說明篩選標(biāo)記pyrG基因在轉(zhuǎn)化子中穩(wěn)定遺傳。七葉苷平板測定顯示，QPB4 和QPB5在12h時(shí)能夠形成明顯的黑色暈圈，而QP4菌株未發(fā)現(xiàn)明顯的黑色暈圈；24 h時(shí)QPB4和QPB5的黑色暈圈的直徑分別達(dá)到了1.3 cm和1.6 cm，而QP4的黑色暈圈的直徑為0.7 cm[圖4(b)]，這說明BGL在QP4中成功實(shí)現(xiàn)了過表達(dá)。

2.5β-葡萄糖苷酶過表達(dá)菌株的產(chǎn)酶分析

為進(jìn)一步確認(rèn)BGL過表達(dá)菌株的纖維素酶產(chǎn)生情況，取搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)5 d的酶液進(jìn)行酶活測定。如圖5所示，過表達(dá)菌株QPB4和QPB5的β-葡萄糖苷酶活力分別達(dá)到了13.65 U·ml?1和11.49 U·ml?1，比QP4（1.24 U·ml?1）分別提高了10.01倍和8.26倍。但其濾紙酶活變化有差異，QPB5的FPA為2.14 U·ml?1，比QP4提高了43.6%，而QPB4的FPA為1.29 U·ml?1，比QP4卻降低了13.4%。QPB4產(chǎn)生這種情況的原因可能是由于其染色體中bgl1表達(dá)盒的不合理插入或cbh1啟動(dòng)子過表達(dá)引起轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子滴定效應(yīng)等導(dǎo)致的[27]。但測定QPB4的纖維素外切酶活和內(nèi)切酶活，發(fā)現(xiàn)基本沒有發(fā)生變化[圖5(b)]。這種過表達(dá)一個(gè)纖維素酶基因而引起總纖維素酶活降低的現(xiàn)象在前期研究中也有報(bào)道[14]。而通過大量篩選得到的另一菌株QPB5并沒有發(fā)生這種情況，BGL和FPA活力均顯著提高（如上所述）。

圖5　里氏木霉β-葡萄糖苷酶過表達(dá)菌株纖維素酶活測定Fig.5　Enzyme activities of BGL-overexpresion transformants (FPA, BGL, CBH and EG were measured after being induced in cellulase fermentation medium for 5 d. Data are represented as mean of three independent experiments. Error bars express standard deviations)

2.6β-葡萄糖苷酶過表達(dá)菌株的糖化應(yīng)用

圖6　過表達(dá)β-葡萄糖苷酶菌株發(fā)酵酶液對玉米芯材料的糖化應(yīng)用Fig.6　Saccharification of different pretreated corncob residues by crude enzyme preparations of BGL-overexpression strains (Data are represented as mean of three independent experiments. Error bars express standard deviations)

為了檢測里氏木霉高水平過表達(dá)β-葡萄糖苷酶對改良纖維素酶系的效果，本研究采用2種不同預(yù)處理的玉米芯材料作為糖化底物，測定了β-葡萄糖苷酶過表達(dá)菌株發(fā)酵酶液的糖化效率（圖6）。結(jié)果顯示，當(dāng)以酸處理玉米芯作為底物時(shí)，糖化效率在24 h和48 h時(shí)均有大幅提升，尤其是24 h時(shí)更加明顯，QPB4和QPB5發(fā)酵酶液的葡萄糖得率分別為13.20 mg·ml?1和12.50 mg·ml?1，比QP4 （8.20 mg·ml?1）分別提高了60.98%和52.44%[圖6(a)]。當(dāng)以脫木素處理玉米芯作為底物糖化時(shí)，過表達(dá)β-葡萄糖苷酶菌株提高糖化效率更加明顯，24 h時(shí)QPB4（15.56 mg·ml?1）和QPB5（16.07 mg·ml?1）比QP4（8.64 mg·ml?1）分別提高了80.09%和86.00%[圖6(b)]。QPB4和QPB5在糖化2種底物時(shí)，雖然葡萄糖得率均有大幅提升，但也出現(xiàn)一定差異，如QPB4糖化酸處理玉米芯底物效果比QPB5好，而QPB5糖化脫木素處理玉米芯底物效果比QPB4好，這可能與兩個(gè)工程菌株酶系差異有關(guān)。總之，本研究成功實(shí)現(xiàn)了里氏木霉QM9414遺傳操作體系的改進(jìn)，并以此為基礎(chǔ)改良纖維素酶組分，獲得了糖化效率顯著提高的工程菌，為下一步實(shí)際工業(yè)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

3　結(jié)　論

（1）通過定點(diǎn)敲除pyr4基因建立了里氏木霉高產(chǎn)突變株QM9414的尿嘧啶缺陷菌株QP4，顯著提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率，而且沒有影響菌株生長和纖維素酶表達(dá)，成為替換尿嘧啶缺陷誘變菌株TU6進(jìn)行遺傳改良和纖維素酶表達(dá)機(jī)制研究的優(yōu)良菌株。

（2）利用構(gòu)建的尿嘧啶缺陷菌株QP4進(jìn)行本源bgl1過表達(dá)，通過高效轉(zhuǎn)化和篩選，僅進(jìn)行一輪轉(zhuǎn)化便獲得了135個(gè)轉(zhuǎn)化子，其中123株為遺傳穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子，從中進(jìn)一步篩選出2株BGL活力最高的菌株，活力分別提高了10.01倍和8.26倍。這說明本研究對里氏木霉QM9414菌株的遺傳轉(zhuǎn)化體系改進(jìn)是成功的，同時(shí)高水平過表達(dá)了β-葡萄糖苷酶。在進(jìn)一步糖化應(yīng)用方面，本研究獲得的QPB5菌株發(fā)酵酶液將玉米芯底物水解的葡萄糖得率在24 h時(shí)就達(dá)到了16.07 mg·ml?1，比出發(fā)菌株提高了86.00%，這在本源過表達(dá)β-葡萄糖苷酶菌株提高糖化效率方面是非常顯著的。

本研究借助轉(zhuǎn)化體系改進(jìn)和高水平過表達(dá)β-葡萄糖苷酶解決了里氏木霉高產(chǎn)突變株遺傳操作困難和酶系組分缺陷兩個(gè)限制菌種改良的因素，顯著提升了里氏木霉的糖化應(yīng)用能力。同時(shí)，高效遺傳轉(zhuǎn)化菌株的構(gòu)建和高產(chǎn)菌株的獲得也為研究里氏木霉纖維素酶高產(chǎn)機(jī)制以及進(jìn)一步的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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Improvement of uracil auxotrophic transformation system in Trichoderma reesei QM9414 and overexpression of β-glucosidase

ZHONG Lixia1,2, QIAN Yuanchao2, DAI Meixue1, ZHONG Yaohua2
(1College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014, Shandong, China;2State Key Laboratory of Microbial Technology, School of Life Sciences, Shandong University, Jinan 250100, Shandong, China)

Abstract:Trichoderma reesei is an industrial filamentous fungus widely used for cellulase production. However, the difficulty in genetic modification of the high-production mutants limits the strain improvement. Firstly, the pyr4 gene was successfully deleted by target integration strategy in T. reesei QM9414 to construct a uracil auxotroph strain QP4. Compared with those in the parental strain, not only the genetic transformation efficiency was improved, but also the cellulase production was not influenced in QP4. The β-glucosidase (BGL) encoding gene bgl1 was further overexpressed in the QP4 strain. The transformants QPB4 and QPB5 with increased BGL activity were obtained by rapid screening based on the esculin plate. The BGL activities in the culture supernatants of QPB4 and QPB5 exhibited 10.01- and 8.26- fold higher than that in QP4, respectively. The crude enzyme preparations were used to saccharify two types of differently pretreated corncob residues. The glucose yields from saccharification of acid-pretreated corncob by QPB4 and QPB5 were 60.98% and 52.44% higher than that by QP4,respectively, while using the delignined corncob as substrate, the glucose yields by QPB4 and QPB5 were improved 80.01% and 86.00%, respectively. These results suggested that improvement of the genetic manipulation system in T. reesei greatly facilitated the strain improvement and increased the saccharification efficiency.

Key words:cellulases; Trichoderma reesei high-production mutant; genetic transformation; saccharification; uracil auxotroph; construction and expression; biotechnology; biological engineering

中圖分類號：TQ 812

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）06—2510—09

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151654

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31370135）；山東省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2014No.45）；山東大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2015CJ005）。

Corresponding author:DAI Meixue, daimeixue@sdnu.edu.cn; ZHONG Yaohua, zhongyaohua@sdu.edu.cn