環(huán)糊精改性Fe3O4納米微球的制備及其負(fù)載多柔比星體外釋放的研究

郭秀麗，許光宇，秦丹丹，白雅竹，任秋穎，鄭林萍*

(1.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004；　2.開封市衛(wèi)生學(xué)校，河南 開封 475002；3.河南大學(xué) 民生學(xué)院，河南 開封 475004)

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環(huán)糊精改性Fe3O4納米微球的制備及其負(fù)載多柔比星體外釋放的研究

郭秀麗1，許光宇2，秦丹丹3，白雅竹3，任秋穎3，鄭林萍1*

(1.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004；2.開封市衛(wèi)生學(xué)校，河南 開封 475002；3.河南大學(xué) 民生學(xué)院，河南 開封 475004)

摘要：采用檸檬酸鈉作為穩(wěn)定劑，通過超聲輔助水相共沉淀法合成了檸檬酸修飾的Fe3O4納米粒(Fe3O4@CA)，進(jìn)一步采用真空干燥法制備了β-環(huán)糊精包覆的Fe3O4納米微球(Fe3O4@β-CD). 分別利用X射線粉末衍射儀、傅立葉變換紅外光譜儀、透射電子顯微鏡、熱重分析儀等表征手段對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和形貌表征. 同時(shí)，以多柔比星為模型藥物,考察了Fe3O4@β-CD微球?qū)Χ嗳岜刃堑捏w外釋放行為. 結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4@CA納米粒子呈球形或類球形，平均流體力學(xué)直徑為84 nm，具有順磁性，室溫下飽和磁化強(qiáng)度為17.5 emu·g-1，紅外光譜結(jié)果表明，β-環(huán)糊精成功的包覆在Fe3O4@CA表面，F(xiàn)e3O4@β-CD的平均流體力學(xué)直徑為104 nm，室溫下飽和磁化強(qiáng)度為15.7 emu·g-1. 體外釋放結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4@β-CD-DOX載藥系統(tǒng)在PBS(pH=7.4)溶液中釋放緩慢，12 h累積釋放率為45.5%. 結(jié)果表明，環(huán)糊精改性的Fe3O4納米微球在體外有明顯的緩釋效果，有望成為理想的抗腫瘤藥物載體.

關(guān)鍵詞：Fe3O4；β-環(huán)糊精；多柔比星；體外釋放

磁性Fe3O4納米粒作為一種新型磁性納米材料，因具有良好的生物相容性、生物可降解性、在外磁場(chǎng)作用下能實(shí)現(xiàn)靶向治療等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域，如磁共振成像[1-2]、催化劑[3]、磁流體材料[4]、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]、生物細(xì)胞富集和分離[6]、靶向藥物傳遞[7-8]、腫瘤熱療[9]等領(lǐng)域. 目前，合成Fe3O4工藝有很多，如水相共沉淀法、微乳液法、熱分解法、溶膠-凝膠法等. 如何找到一條能有效控制納米粒的形貌、粒徑大小與分布的合成方法，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn). 由于Fe3O4納米粒表面積較大，容易發(fā)生團(tuán)聚，因此需要在Fe3O4表面進(jìn)行修飾以提高其穩(wěn)定性. 其中研究較多的是在水相中加入表面活性劑以提高納米粒子的分散性. 常用的表面活性劑有聚乙二醇(PEG)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、油酸鈉(Sodium oleate)等.

當(dāng)Fe3O4納米粒子用于靶向治療藥物的載體時(shí)存在一些問題，如載藥率低、藥物釋放存在明顯突釋現(xiàn)象等.β-環(huán)糊精作為一種常用的包合材料，是具有7個(gè)葡萄糖單元的環(huán)狀聚合物，具有能容納疏水性藥物的空穴結(jié)構(gòu)，其自身毒性很低，適用于提高疏水性藥物的水溶性或者延緩藥物釋放，是一種比較理想的藥物載體. 在醫(yī)藥和食品行業(yè)等領(lǐng)域中，環(huán)糊精已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[10-11]. 我們首先以超聲輔助水相共沉淀法制備Fe3O4納米粒，在控制其形貌、粒徑尺寸與分布及磁性能的基礎(chǔ)上，用生物相溶性好且?guī)в卸喙倌軋F(tuán)的檸檬酸修飾Fe3O4納米粒表面，然后進(jìn)一步與β-環(huán)糊精偶聯(lián)，制備了β-環(huán)糊精改性的Fe3O4納米微球，最后以多柔比星為模型藥物考察了Fe3O4@β-CD微球?qū)Χ嗳岜刃堑呢?fù)載及體外釋放行為.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

六水合三氯化鐵、七水合硫酸亞鐵、氫氧化鈉、檸檬酸、無水乙醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；β-環(huán)糊精、PBS(阿拉丁試劑公司)；鹽酸多柔比星(DOX·HCl，浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；其他試劑均為分析純.

DF-101S型磁力攪拌水浴鍋(河南國(guó)瑞儀器有限公司)；KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PHS-3C型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；D8 ADVANCE型X射線粉末衍射儀(美國(guó)Bruker公司)；VERTEX 70型傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Bruker公司)；SDTA851e型熱重分析儀(瑞士Mettler-Toledo公司)；Tecnai G2 F20型透射電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)；ZetasizerNano ZS 90型激光粒度及Zeta電位儀(英國(guó)Malvern公司)；MPMS-XL-7型超導(dǎo)量子干涉儀(美國(guó)Quantum Design公司)；7200型紫外-可見光譜儀(美國(guó)Unico公司).

1.2檸檬酸修飾Fe3O4納米粒的制備

分別取一定量的FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O溶解于去離子水中，攪拌使其完全溶解，得到n(Fe3+)∶n(Fe2+)=2∶1的黃綠色鐵鹽溶液，記為溶液A. 另取一定量氫氧化鈉和檸檬酸溶解于去離子水中，攪拌使其完全溶解，記為溶液B. 將溶液B加到250 mL三口瓶中，在超聲攪拌條件下，將溶液A逐滴加入溶液B中，60 ℃下繼續(xù)反應(yīng)30 min，利用外加磁場(chǎng)收集產(chǎn)物，然后用去離子水和無水乙醇交替洗滌3次，60 ℃下真空干燥24 h，得到檸檬酸修飾的Fe3O4納米粒(Fe3O4@CA).

1.3環(huán)糊精改性Fe3O4納米微球的制備

稱取Fe3O4@CA 1.0 g，加去離子水1.5 mL，再加入β-環(huán)糊精2.0 g，混合均勻后放入真空干燥箱中，在110 ℃下真空干燥3 h. 干燥后的樣品用無水乙醇和去離子水反復(fù)洗3遍，用磁鐵分離最終產(chǎn)物，在60 ℃下真空干燥24 h，制得β-環(huán)糊精改性的Fe3O4納米微球(Fe3O4@β-CD).

1.4樣品表征

利用X射線衍射儀檢測(cè)樣品的X射線粉末衍射(XRD)；利用傅立葉變換紅外光譜儀,溴化鉀壓片測(cè)試樣品的紅外光譜(FT-IR)；采用透射電子顯微鏡觀察樣品的形貌，操作條件為200 kV；采用激光納米力度儀檢測(cè)樣品的粒徑及分布；采用熱重分析儀測(cè)試樣品的熱穩(wěn)定性，測(cè)試條件：升溫速度10 ℃·min-1，溫度范圍為20～800 ℃；采用超導(dǎo)量子干涉儀測(cè)定樣品的磁性能;使用紫外-可見光譜儀測(cè)試樣品的紫外吸收光譜.

1.5多柔比星的負(fù)載與體外釋放

將10 mg Fe3O4@β-CD分散于0.1 g·L-1多柔比星的PBS溶液中，用超聲儀處理(70 kHz，300 W)，處理時(shí)間分別為10、20、30、60、90 min. 將混懸液高速離心(8 000 r·min-1)5 min，測(cè)上清液紫外吸收，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定上清液中多柔比星的濃度，最后確定最佳超聲時(shí)間、載藥量及包封率. 將離心分離得到的Fe3O4@β-CD-DOX用去離子水洗2遍后冷凍干燥，置于冰箱中密封保存. 載藥量和包封率的計(jì)算公式如下：

精密稱Fe3O4@β-CD-DOX 10 mg，加20 mL去離子水超聲分散后裝入透析袋中(截留摩爾質(zhì)量14 000 g·mol-1)，放入80 mL PBS(pH=7.4)緩沖液中，水浴溫度37 ℃，開動(dòng)磁力攪拌，每隔一段時(shí)間取2 mL溶液測(cè)紫外吸收，同時(shí)補(bǔ)充2 mL 新鮮的PBS緩沖液. 通過測(cè)定所取的緩沖溶液中DOX的紫外吸收可以計(jì)算出不同時(shí)間的釋藥率.

2結(jié)果與討論

2.1表征

圖1為Fe3O4@CA的XRD圖. 從衍射譜圖看，峰的位置、強(qiáng)度與粉末衍射PDF卡(JCPDS NO.82-1533)上的Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)基本吻合，2θ=30.26°、35.61°、43.64°、53.91°、57.33°、62.84°處的6個(gè)明顯衍射峰分別對(duì)應(yīng)于(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)的6個(gè)晶面，這表明通過改進(jìn)化學(xué)共沉淀法制備所得的產(chǎn)物為Fe3O4納米粒子，并具有立方晶系結(jié)構(gòu).

圖1　Fe3O4@CA的XRD圖Fig.1　XRD pattern of Fe3O4@CA

圖2分別為純Fe3O4、檸檬酸、Fe3O4@CA的紅外光譜圖. a曲線中586 cm-1處出現(xiàn)了Fe3O4特征吸收峰，3 416 cm-1為Fe3O4所含少量結(jié)晶水的吸收峰. b曲線中1 394、1 593 cm-1為羰基的碳氧振動(dòng)吸收峰，3 455 cm-1為檸檬酸中羥基的氫氧伸縮振動(dòng)吸收峰. c曲線1 148 cm-1是檸檬酸的羧基與Fe3O4表面羥基鍵合形成的酯鍵的振動(dòng)吸收峰. 從紅外譜圖可以進(jìn)一步證明檸檬酸分子修飾在Fe3O4納米粒表面.

圖2　純Fe3O4(a)、檸檬酸(b)、Fe3O4@CA(c)的紅外光譜圖Fig.2　FT-IR spectra of pure Fe3O4(a),citric acid(b), and Fe3O4@CA(c)

圖3分別為Fe3O4@CA(a)、β-CD(b)、Fe3O4@β-CD(c)的紅外光譜圖. b曲線1 029、1 159、2 927 cm-13個(gè)峰為β-環(huán)糊精特征吸收峰. c曲線中在1 030、2 924 cm-1出現(xiàn)了β-環(huán)糊精的特征吸收峰，1 154、1 590 cm-1出現(xiàn)了檸檬酸的特征吸收峰，說明β-環(huán)糊精的羥基與Fe3O4@CA的游離羧基形成了化學(xué)鍵，β-環(huán)糊精成功的包覆在Fe3O4@CA表面.

圖3　Fe3O4@CA(a)、β-CD(b)、Fe3O4@β-CD(c)的紅外光譜圖Fig.3　FT-IR spectra of Fe3O4@CA(a),β-CD(b), and Fe3O4@β-CD(c)

圖4為Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的透射電鏡圖. 如圖a所示，F(xiàn)e3O4@CA納米粒子近似呈球形，單個(gè)納米粒子粒徑平均在12 nm左右，納米粒子呈簇集狀態(tài)，平均簇徑為80 nm左右. 從圖b可以看出，F(xiàn)e3O4@β-CD近似呈球性，分散較為均勻，平均簇徑為100 nm左右.

圖4　Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的透射電鏡圖Fig.4　TEM images of Fe3O4@CA(a) and Fe3O4@β-CD(b)

圖5為Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的熱失重曲線. 從圖上可以看出，曲線a中從室溫到120 ℃累計(jì)失重為2.4%，是由于樣品中含有的水受熱蒸發(fā). 當(dāng)加熱到400 ℃時(shí)，累計(jì)失重達(dá)到14.5%，由檸檬酸高溫下分解造成. 400 ℃以后重量不再損失，說明檸檬酸已完全分解. 曲線b中從室溫到120 ℃累計(jì)失重為3.3%，是由于樣品中所含結(jié)晶水蒸發(fā). 當(dāng)加熱到800 ℃時(shí)，累計(jì)失重為32.2%. 經(jīng)查詢Scifinder數(shù)據(jù)庫(kù)，β-環(huán)糊精的熔點(diǎn)是293～294 ℃，在該溫度下同時(shí)發(fā)生分解. b曲線是檸檬酸和β-環(huán)糊精先后發(fā)生分解形成的曲線. 熱失重測(cè)試結(jié)果表明β-環(huán)糊精連接在Fe3O4@CA納米粒上，與紅外結(jié)論一致.

圖6分別為Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的平均流體力學(xué)直徑分布圖. 動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得Fe3O4@CA納米粒子的平均流體力學(xué)直徑為84 nm，PDI(多分散指數(shù))=0.194. Fe3O4@CA的Zeta電位為-40.2 mV，其絕對(duì)值大于25 mV，意味著其表面靜電斥力能抵消相鄰微粒間的引力，從而表明Fe3O4@CA納米粒子在堿性溶液中能穩(wěn)定存在. Fe3O4@β-CD的平均流體力學(xué)直徑為104 nm，多分散指數(shù)(PDI)=0.199，相比Fe3O4@CA，其平均流體力學(xué)直徑增大20 nm.

圖5　Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的熱失重曲線Fig.5　TGA curves of Fe3O4@CA (a) and Fe3O4@β-CD(b)

圖6　Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的平均流體力學(xué)直徑分布圖Fig.6　Size distribution of Fe3O4@CA(a) and Fe3O4@β-CD(b)

從圖7可見，當(dāng)外加磁場(chǎng)的強(qiáng)度變?yōu)榱愕臅r(shí)候，樣品的磁化強(qiáng)度也變?yōu)榱悖覠o剩磁. 并且在整個(gè)外加磁場(chǎng)的變化過程中(-20～20 kOe)沒有明顯的磁滯回環(huán)，說明Fe3O4@CA和Fe3O4@β-CD都具有順磁性，飽和磁化強(qiáng)度Ms分別為17.5、15.7 emu·g-1. 與Fe3O4@CA相比，F(xiàn)e3O4@β-CD飽和磁化強(qiáng)度略有降低，原因是Fe3O4@β-CD微球中Fe3O4相對(duì)含量較少.

圖7　Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的磁滯曲線(T=300 K)Fig.7　Magnetization curves of Fe3O4@CA(a)and Fe3O4@β-CD(b)(T=300 K)

2.2藥物的負(fù)載與釋放性能研究

為了研究復(fù)合納米微球的載藥和釋藥性質(zhì),我們選用一種經(jīng)典的抗癌藥物DOX作為模型藥物. 通過超聲實(shí)驗(yàn)把DOX載入復(fù)合納米粒子Fe3O4@β-CD中,確定最佳超聲時(shí)間為30 min，所測(cè)的載藥量為12%，藥物包封率為30%.

如圖8所示，F(xiàn)e3O4@β-CD-DOX載藥系統(tǒng)在PBS(pH=7.4)溶液中釋放緩慢，12 h累積釋放率45.5%，說明該復(fù)合納米微球具有緩釋效果.

圖8　Fe3O4@β-CD-DOX體外釋放曲線Fig.8　In vitro release profile of Fe3O4@β-CD-DOX

3結(jié)論

以FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O為鐵源，NaOH為堿源,檸檬酸為穩(wěn)定劑，采用超聲輔助水相共沉淀法制備了Fe3O4@CA納米粒. 采用真空干燥法合成了β-環(huán)糊精改性的Fe3O4納米微球(Fe3O4@β-CD)，紅外光譜結(jié)果表明β-環(huán)糊精成功包覆在Fe3O4@CA表面，激光粒度儀測(cè)得其粒徑比Fe3O4@CA稍偏大，磁強(qiáng)計(jì)測(cè)得其飽和磁化強(qiáng)度略有降低，原因是Fe3O4@β-CD微球中Fe3O4相對(duì)含量較少. 體外釋放實(shí)驗(yàn)表明環(huán)糊精改性Fe3O4納米微球有明顯的緩釋效果，有望成為理想的抗腫瘤藥物載體.

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[責(zé)任編輯：張普玉]

收稿日期：2016-02-26.

基金項(xiàng)目：省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14A350009)，河南大學(xué)民生學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)支持計(jì)劃項(xiàng)目(MSCXCY2015054).

作者簡(jiǎn)介：郭秀麗(1989-)，女，碩士生，研究方向?yàn)樾滦退幬镏苿? *通訊聯(lián)系人，E-mail: zhenglinping2006@126.com.

中圖分類號(hào)：R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-1011(2016)03-0364-05

Preparation and in vitro release study of doxorubicin-loaded cyclodextrin modified Fe3O4nanospheres

GUO Xiuli1, XU Guangyu2, QIN Dandan3, BAI Yazhu3, REN Qiuying3, ZHENG Linping1*

(1.CollegeofPharmacy,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China;2.KaifengHealthSchool，Kaifeng475002,Henan,China;3.MinshengCollege,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Abstract:Fe3O4@CA nanoparticles were successfully synthesized by ultrasound-assisted coprecipitation method with citric acid as a stabilizer, and Fe3O4@β-CD nanospheres were prepared by vacuum drying. Their structure and morphology were characterized by X-ray powder diffraction, fourier-transform infrared spectroscopy, transmission electron microscopy, thermogravimetric analyzer and other characterization methods.At the same time, the in vitro release behavior of Fe3O4@β-CD microspheres to doxorubicin was investigated using doxorubicin as a model drug. Results showed that Fe3O4@CA nanoparticles were spherical or spherical like, the average hydrodynamic diameter was 84 nm,and the saturation magnetization was 17.5 emu·g-1at room temperature. Fourier-transform infrared spectroscopy results show that β-CD and Fe3O4@CA were successfully coupled and the average hydrodynamic diameter was 104 nm, magnetic properties test showed that the magnetic microspheres saturation magnetization was

15.7 emu·g-1. In vitro release studies showed that the release rate of Fe3O4@β-CD-DOX drug loading system in PBS (pH=7.4) solution was slow, and the cumulative release rate of 12 h was 45.5%. Results show that cyclodextrin modified Fe3O4microspheres have obvious sustained-release effect in vitro. It is a potential drug carrier for the delivery of antitumor drugs.

Keywords:Fe3O4; β-cyclodextrin; doxorubicin; in vitro releasation