白芨實(shí)生種子的快速繁殖技術(shù)

李 川，李二星，劉 洋，吳群軍，殷越閱

（1.安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西安康725000；2.旬陽(yáng)縣新森林生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司，陜西旬陽(yáng)725772）

白芨實(shí)生種子的快速繁殖技術(shù)

李 川1，李二星1，劉 洋1，吳群軍2，殷越閱1

（1.安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西安康725000；2.旬陽(yáng)縣新森林生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司，陜西旬陽(yáng)725772）

為白芨種質(zhì)資源的保存和大面積種植提供依據(jù)，以白芨種子作為接種材料，利用正交試驗(yàn)研究在不同條件下白芨種子的萌芽率，不同激素濃度白芨種子成苗率及白芨種子實(shí)生苗煉苗成活率的條件。結(jié)果表明：貯藏條件為20℃，30d的白芨種子在培養(yǎng)溫度為25℃，光照16h／d的萌發(fā)率最高；培養(yǎng)基配比為MS＋6－BA 3.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%，光照16h／d，溫度25℃條件下白芨種子的萌發(fā)最快，長(zhǎng)勢(shì)較好，而MS＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%對(duì)于誘導(dǎo)生根效果明顯；煉苗基質(zhì)以腐葉土∶鋸末＝1∶1為最好，控制溫濕度，成活率超85%。

白芨種子；實(shí)生苗；原球莖

白芨〔Bletilla striata（thunb）Reichb.f.〕蘭科植物，別名地螺絲、刀口藥和白芨子。主產(chǎn)于貴州、云南和四川等地，在長(zhǎng)江流域及以南各省亦有分布［1］。白芨種子細(xì)小，在自然條件下萌發(fā)率極低，繁殖困難，野生資源較稀少，而白芨用途廣，需求量極大，長(zhǎng)期掠奪式的采挖導(dǎo)致其野生資源已瀕臨枯竭，無法滿足市場(chǎng)需求。因此，必須探索白芨實(shí)生種子繁殖技術(shù)，在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行白芨苗的快速繁殖，增大白芨產(chǎn)量，以解決白芨缺乏的現(xiàn)狀。石云平［2］等研究表明，以白芨?jìng)?cè)芽為外植體并采用0.2%升汞消毒滅菌8min的效果較好；側(cè)芽的叢生芽誘導(dǎo)以培養(yǎng)基MS＋1.5mg／L 6－BA＋0.1mg NAA的效果較好；繼代增殖以培養(yǎng)基MS＋2.0mg／L 6－BA＋0.2mg／L NAA較適合，30d為1個(gè)周期，增殖系數(shù)為5.0；生根培養(yǎng)基以1／2MS＋1.0mg／L NAA＋0.1mg／L 6－BA較好，生根率為83.3%。付志惠［3］等研究表明：白芨種子萌發(fā)率與其胚齡和有胚率成正相關(guān)，萌發(fā)時(shí)間則與胚齡和有胚率成負(fù)相關(guān)；胚齡16周的種子在1g／L花寶1號(hào)＋2g／L花寶2號(hào)的培養(yǎng)基上萌發(fā)率達(dá)84%；胚齡≥20周的種子萌發(fā)率不受培養(yǎng)基成分的影響，均達(dá)100%，萌發(fā)時(shí)間只需7d；叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為1／2MS＋4.0mg／L 6－BA＋0.2mg／L NAA＋100g／LCM，其增殖倍數(shù)達(dá)4.41倍；誘導(dǎo)生根較好的培養(yǎng)基為1／2MS＋0.2mg／L NAA，生根率達(dá)90%。但目前對(duì)于白芨實(shí)生種子方面研究尚少。因此，筆者以白芨種子作為接種材料，利用正交試驗(yàn)研究不同條件下白芨種子的萌芽率，不同激素濃度對(duì)白芨種子萌發(fā)及實(shí)生苗煉苗成活率的影響，旨在討論利用白芨種子進(jìn)行實(shí)生苗組織培養(yǎng)快速繁殖，為該物種種質(zhì)資源的保存和大面積栽培利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為黃花白芨（當(dāng)?shù)仄贩N）種子，由旬陽(yáng)縣新森林生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供。

1.2 無菌材料的獲得

將未開裂白芨蒴果果莢用毛筆輕輕掃去附著在表面的灰塵，在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精棉擦拭表面消毒3min，再用0.15%的HgCl2擦拭表面約10min（操作過程中只需擦濕表面即可，以防試劑浸入蒴果內(nèi)部導(dǎo)致種子失去萌發(fā)能力）。然后用鑷子縱向剖開蒴果，用鑷子夾住蒴果，將碎末狀的種子輕輕抖落在培養(yǎng)基表面。利用pH為5.8，瓊脂為8.0g／L的培養(yǎng)基培養(yǎng)果莢里粉末狀白芨種子，以獲取白芨苗。

1.3 白芨種子最適萌發(fā)條件的確定

采用3因素3水平正交設(shè)計(jì)法L9（33）考察不同條件對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響因素水平（表1）。在墊有3層濾紙直徑90mm的培養(yǎng)皿中按10×10方陣精量播100粒種子，每個(gè)處理培養(yǎng)2皿，每天灑水1次，保證100%的濕度。接種15d后統(tǒng)計(jì)9個(gè)處理白芨種子的萌發(fā)個(gè)數(shù)，計(jì)算不同處理的萌發(fā)率：

萌發(fā)率＝（萌發(fā)的種子數(shù)／接種的種子數(shù)）× 100%

表1 白芨種子萌發(fā)的L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 L9（33）orthogonal experimental design table for Bletillaseeds germination

1.4 白芨種子萌發(fā)的最佳濃度激素配比的確定

選擇萌發(fā)率較高的白芨種子在6－BA （1～3mg／L）和NAA（1～2mg／L）不同激素濃度配比的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，激素濃度為6－BA∶NAA＝1∶1，1∶2，2∶1，2∶2，3∶1，3∶2），篩選出培育白芨種子組培苗的最佳配比濃度。其他條件為pH 5.8，蔗糖30g／L，瓊脂8g／L。在25℃，光照16h／d，光強(qiáng)2500～3000lx環(huán)境條件下培養(yǎng)。

1.5 不同濃度NAA對(duì)白芨生根的影響

待白芨幼苗生長(zhǎng)到2～3cm時(shí)，將幼苗轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根（NAA激素濃度分別為0.5mg／L，1mg／L，1.5mg／L，2mg／L）。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH 5.8，蔗糖含量為30g／L，瓊脂為8g／L。在25℃，光照16h／d，光強(qiáng)2 500～3 000lx環(huán)境條件下培養(yǎng)。

1.6 煉苗

當(dāng)白芨組培苗生根達(dá)4～5條，平均根長(zhǎng)度達(dá)1.5cm，株高約5cm時(shí)，即可進(jìn)行移栽。移栽前打開組培瓶蓋，在自然環(huán)境下放置3d，小心取出白芨幼苗，用自來水將根系上的培養(yǎng)基沖洗干凈，最后定植于已高溫消毒的基質(zhì)中，基質(zhì)為鋸末∶腐葉土＝1∶1較好，室溫，光照16h／d，光強(qiáng)2 500～3 000lx的光照培養(yǎng)箱中煉苗。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

表2 不同處理對(duì)白芨種子的萌發(fā)率Table 2 Germination rate of Bletillaseeds of different treatment

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理白芨種子萌發(fā)率與長(zhǎng)勢(shì)

2.1.1 不同培養(yǎng)條件 由表2可見，不同成熟度的白芨種子在不同培養(yǎng)溫度和不同光照時(shí)間中均能萌發(fā)，但萌發(fā)率有所差異。不同處理白芨種子的萌發(fā)力影響依次為培養(yǎng)溫度＞貯藏條件＞光照時(shí)間，選擇貯藏條件20℃，貯藏30d當(dāng)年的白芨種子，培養(yǎng)溫度為25℃，光照16h／d的處理組合萌發(fā)率最高，達(dá)95%。

表3 不同激素和濃度配比白芨種子生長(zhǎng)情況Table 3 Growing status of Bletillaseeds treated with different hormone and concentration ratio

圖示 白芨種子在培養(yǎng)基上不同時(shí)期生長(zhǎng)情況Fig. Growth of different periods of Bletillaseeds in culture medium

經(jīng)方差分析，溫度（A）和光照（C）對(duì)白芨種子萌發(fā)影響達(dá)顯著水平（P＜0.05），種子成熟度（B）對(duì)白芨種子萌發(fā)影響不顯著。由溫度和光照條件多重比較結(jié)果可知，溫度為25℃與30℃時(shí)差異不顯著，但溫度為20℃時(shí)與前兩者差異顯著；光照時(shí)長(zhǎng)為0與16h／d時(shí)差異不顯著，但光照時(shí)長(zhǎng)為24h／d時(shí)與前兩者差異顯著。

2.1.2 不同激素濃度 由表3可見，在培養(yǎng)基中添加適量激素對(duì)白芨的萌發(fā)有促進(jìn)作用，萌發(fā)率相對(duì)于無激素的培養(yǎng)基有所提高，萌發(fā)速度較快。不同激素和濃度配比對(duì)白芨的萌發(fā)與幼苗的形成效果有明顯的差異。當(dāng)培養(yǎng)基中NAA含量較高時(shí)白芨種子萌發(fā)較慢，萌發(fā)率相對(duì)較低，在種子萌發(fā)形成原球莖表面逐漸長(zhǎng)出一些乳白色瘤狀小突起，繼續(xù)培養(yǎng)可發(fā)育成叢生苗；其次發(fā)現(xiàn)，一定范圍內(nèi)當(dāng)6－BA含量逐漸升高時(shí)形成的原球莖逐漸增大，在激素濃度較高時(shí)幼苗生長(zhǎng)較高。觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6－BA∶NAA＝3∶1時(shí)白芨幼苗長(zhǎng)勢(shì)最好，35～40d后可見2～3片葉，幼苗平均可達(dá)3.1cm且葉為深綠色，長(zhǎng)勢(shì)健壯（圖示）。

2.2 不同激素和濃度白芨根的長(zhǎng)勢(shì)

將白芨幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基20～30d后可觀察到在不同激素濃度下白芨幼苗生根率均在95%以上，生根率較高，且幼苗高度達(dá)5cm左右，得到壯苗，可看到膨大的原球莖（圖示）。由不同激素和濃度配比白芨種子的萌發(fā)與長(zhǎng)勢(shì)可見，添加NAA對(duì)白芨生根有顯著作用，當(dāng)NAA濃度高于1mg／L時(shí)幼苗逐漸出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，不利于日后幼苗成活。當(dāng)NAA濃度為1mg／L時(shí)幼苗生根效果最好，幼苗健壯。

2.3 白芨煉苗的培養(yǎng)條件

將白芨幼苗移栽到腐葉土∶鋸末＝1∶1的基質(zhì)中保證遮光率達(dá)90%左右的環(huán)境下，用黑色遮陽(yáng)網(wǎng)全遮蓋，每天噴霧狀水，空氣濕度在80%～90%即可，過濕則幼苗很快爛根死亡，溫度一般保持在（25±2）℃，30d后白芨可長(zhǎng)出新根系。

3 結(jié)論與討論

1）張建霞［5］等研究表明，隨著白芨胚齡增大，胚成熟度逐漸增加，有胚率逐漸提高，種子萌發(fā)時(shí)間逐漸變短。胚齡為20周時(shí)采收最好，有胚率最高，萌發(fā)率100%，萌發(fā)只需1周。白芨果莢一般在每年7－9月成熟［6］，本發(fā)芽率試驗(yàn)在11月進(jìn)行，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同貯藏條件的白芨種子均能萌發(fā)，但以室溫20℃，貯藏期較短的萌發(fā)率最高，溫度較低和儲(chǔ)藏時(shí)間過長(zhǎng)發(fā)芽率相對(duì)較低，結(jié)果與趙仁全［7］等研究相似，說明白芨種子不存在后熟，貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，種子易老化或發(fā)生劣變影響萌發(fā)率。

2）當(dāng)培養(yǎng)基配比為MS＋6－BA3.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%，培養(yǎng)條件為光照16h／d，溫度25℃時(shí)，白芨種子萌發(fā)最快，幼苗生長(zhǎng)最佳。而MS＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%時(shí)，對(duì)于誘導(dǎo)生根效果明顯，說明NAA在白芨叢生芽增殖中期主導(dǎo)作用，與袁寧［8］等得到的結(jié)果相似，其他結(jié)果與前人研究結(jié)果存在差異［4－5，9－11］，可能與種子的選擇和地域差異有關(guān)。

3）張建霞等［5］發(fā)現(xiàn)，白芨種子在萌發(fā)過程中對(duì)培養(yǎng)基的依賴性很低，萌發(fā)后可直接分化出葉原基和根原基，長(zhǎng)成健苗。吳華芬等［12］研究表明，白芨原球莖誘導(dǎo)、增殖及分化成芽等過程可在同一培養(yǎng)基上進(jìn)行。在此試驗(yàn)之前，在大田條件下利用腐殖土直接播種，約14d后利用放大鏡可觀察到白芨已經(jīng)形成黃綠色的原球莖，60d后可明顯觀察到白芨幼苗1片子葉展開，高2mm左右，說明，完全成熟的白芨種子含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠提供種子萌發(fā)需要，但由于白芨自身營(yíng)養(yǎng)不足在種子萌發(fā)的后期不足以維持幼苗繼續(xù)生長(zhǎng)，故幼苗生長(zhǎng)到一定時(shí)間會(huì)逐漸黃化死亡。在白芨種子萌發(fā)形成幼苗后通過放大鏡可以觀察都莖基部有白色絨毛狀物，可能為原球莖表皮發(fā)生的表皮毛，是具有吸收能力的“假根”［5］。試驗(yàn)中用肉眼同樣可觀察到白芨根部存在白色絨毛狀物，可能與其自然生長(zhǎng)中情況下的“菌根”有關(guān)，利于共生菌的附著，可深入研究形成機(jī)理及其共生菌類型及對(duì)白芨生長(zhǎng)的作用。白芨實(shí)生種子快速繁殖幼苗長(zhǎng)勢(shì)較好，能順利移栽到大田，進(jìn)行大田生產(chǎn)。

4）根據(jù)白芨生長(zhǎng)習(xí)性可知，白芨喜歡生長(zhǎng)在濕潤(rùn)疏松的土壤中，余朝秀等［4］經(jīng)過多次對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煉苗前期的空氣濕度在80%～90%，溫度一般保持在（25±2）℃，使用腐葉土∶鋸末＝1∶1的基質(zhì)中白芨成活率最高，達(dá)85%以上。但通過本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，將白芨幼苗移栽到遮光率達(dá)90%時(shí)，每天噴霧狀水，濕潤(rùn)即可，過濕則幼苗很快爛根死亡。經(jīng)過30d左右的精心管理白芨可長(zhǎng)出新根系，煉苗階段結(jié)束，即可轉(zhuǎn)入常規(guī)管理。

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（責(zé)任編輯：劉忠麗）

Rapid Propagation Technique of Bletilla Seeds

LI Chuan1，LI Erxing1，LIU Yang1，WU Qunjun2，YIN Yueyue1
（1.School of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University，Ankang，Shaanxi 725000；2.Xunyang New Forest Ecological Agriculture Co.Ltd.，Xunyang，Shaanxi 725772，China）

To provide references for germplasm resources preservation and large area planting of Bletilla，taking Bletilla seeds as the inoculating materials，orthogonal experiments were employed to study the germination rates of Bletilla seeds under different conditions，seedling rates of Bletilla seeds treated with different concentrations of hormones and the surviving rates of hardening－seedlings.Results：Germination rates of Bletillaseeds stored at 20℃for 30dreached the highest when culture temperature and illumination were 25℃and 16h／d respectively；Bletilla seeds germinated the fastest with good growth vigor under conditions of culture medium MS＋6－BA 3.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋sucrose 30%，illumination 16h／d，temperature 25℃.Culture medium MS＋NAA 1.0mg／L＋sucrose 30%had significant root inducting effects；The matrix leaf mould∶saw dust＝1∶1had the best hardening－seedling effects，the surviving rate could be above 85%when the temperature and humidity were controlled properly.

Bletillaseeds；seedling；protocorm

S567.23＋9

A

1001－3601（2016）08－0351－0105－04

2015－06－25；2016－07－02修回

陜西省科技廳項(xiàng)目“白及種苗繁殖及標(biāo)準(zhǔn)化栽培技術(shù)研究”（2015SF305）；陜西省教育廳項(xiàng)目“白及種質(zhì)資源保護(hù)與馴化快繁技術(shù)研究”（2013JK0730）；安康學(xué)院項(xiàng)目“白及種子繁殖技術(shù)研究”（AYQDZR201004）；陜西省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2014Sxjy－1799）

李 川（1976－），副教授，碩士，從事植物種質(zhì)資源遺傳育種研究。E－mail：cyberlc＠163.com