Nesfatin-1及其mRNA在大鼠生長軸中的表達

李　冉，王堯堯，李運生，方富貴，李福寶

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

Nesfatin-1及其mRNA在大鼠生長軸中的表達

李冉，王堯堯，李運生，方富貴，李福寶

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

[摘要]【目的】 探討Nesfatin-1在大鼠生長軸(下丘腦、腺垂體、肝臟、胰腺、肌肉)中的定位及其mRNA的表達情況?！痉椒ā?對雌性大鼠進行深度麻醉灌注后，采集下丘腦、腺垂體、肝臟、胰腺、腓腸肌肌肉組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定，采用免疫組化PV-9000二步法、DAB顯色技術檢測Nesfatin-1在生長軸上的分布，另取雌性大鼠斷頭處死，取相同組織用熒光定量PCR方法檢測其中Nesfatin-1 mRNA的表達情況?！窘Y果】 Nesfatin-1主要分布于下丘腦的室旁核、背內側核、室周核、外側區(qū)、弓狀核、視上核、腺垂體、胰腺的胰島和腺泡及肝臟與肌肉中。平均光密度分析顯示，Nesfatin-1在室周核和胰島的表達量顯著地高于其他組織(P<0.05)，在胰腺腺泡、肝臟及肌肉中的表達量則顯著地低于其他組織(P<0.05)，在下丘腦背內側核、外側區(qū)和室旁核中的表達量顯著高于視上核、弓狀核和腺垂體(P<0.05)。Nesfatin-1 mRNA在胰腺中表達量最高，腺垂體次之，下丘腦和肝臟較低，在胰腺和腺垂體的表達量顯著高于下丘腦和肝臟，但下丘腦與肝臟差異不顯著(P>0.05)；在腓腸肌中未檢測出Nesfatin-1 mRNA的表達?！窘Y論】 Nesfatin-1及其mRNA在生長軸中的廣泛表達，表明Nesfatin-1可能對大鼠生長發(fā)育具有調控作用。

[關鍵詞]Nesfatin-1；大鼠；生長軸；表達與調控

2006年，日本教授OH-Is首次報告了存在于下丘腦的神經(jīng)肽Nesfatin-1，其為核組蛋白2(NucleobindinⅡ, 簡稱NUCB2)的裂解產(chǎn)物，NUCB2在前激素酶的作用下可以裂解成3個片段，分別命名為Nesfatin-1、Nesfatin-2及Nesfatin-3[1]。進一步的試驗研究發(fā)現(xiàn)，只有Nesfatin-1在注入大鼠腦內后，其攝食量呈劑量依賴性減少，提示3個片段中，僅Nesfatin-1對攝食具有抑制功能[1-2]。另有研究發(fā)現(xiàn)，NUCB2 mRNA在腦中主要分布于皮層、邊緣、腦橋，下丘腦背內側核(Dorsomedial hypothalami nucleus，DMH)、外側區(qū)(Lateral hypothalami area，LHA)、視上核(Supraoptic nucleus，SON)、室旁核(Nucleus paraventricular，PVN)、弓狀核(Hypothalami arcuate nucleus，ARC)、室周核(Periventricular nucleus，PeN)和下丘腦正中隆起，延髓中縫核、孤束核，以及背側迷走神經(jīng)運動核、交感神經(jīng)節(jié)前、副交感神經(jīng)元等[3-5]。另外，Nesfatin-1還廣泛分布于外周消化系統(tǒng)中,如RT-PCR檢測到大鼠胃分泌黏膜的NUCB2 mRNA較腦部高10倍[6-7]。Nesfatin-1在中樞和外周的廣泛分布提示其具有多種生物學功能，近來年的研究還表明，Nesfatin-1不僅能夠抑制飲食飲水，還具有調節(jié)生物體的肥胖、胰島素分泌及生殖等功能[8-9]。

攝食是生物體生命延續(xù)的最基本需求之一，通過進食生命體才能生長、發(fā)育[10]。鑒于Nesfatin-1對動物體的攝食行為有抑制作用，而生長主要由生長軸調控，由此推測Nesfatin-1與生長軸密切相關，但Nesfatin-1及其mRNA在生長軸中的分布與表達情況還未見報道。為此，本試驗采用免疫組化及實時熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)對Nesfatin-1在大鼠生長軸中的表達情況進行檢測，以期為進一步研究Nesfatin-1在生長方面的作用提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物

成年雌性SD大鼠(體質量220～250 g/只)10只，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，在室溫(23±2) ℃、12 h(晝)/12 h(夜)循環(huán)光照條件下自由攝食與飲水。

1.2試劑及儀器

1.2.1免疫組化所用主要試劑和儀器Nesfatin-1一抗為山羊抗鼠Nesfatin-1多克隆抗體(AF6895)，美國R&D公司；PV-9000兩步法免疫組化檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。半自動石蠟切片機(LS-2055+)，沈陽市龍首電子儀器有限公司。

1.2.2熒光定量PCR所用主要試劑和儀器TRIzol、DEPC、引物、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、QuantiFast SYBR Green PCR kit，均購自上海閃晶分子生物科技有限公司；DNA Marker DL2000，TAKARA。熒光定量PCR儀，Thermo PIKOREAL 96；紫外分光光度計，Gene Quant Ⅱ，Pharmacia Biotech。

1.3組織樣品的采集

取5只SD雌性大鼠，腹腔注射10%(質量濃度0.1 g/mL)水合氯醛進行深度麻醉，注射劑量為5 mL/kg，使用0.9%生理鹽水溶液進行心臟快速灌注沖洗，然后用4%多聚甲醛溶液灌注。打開大鼠顱腔，采集下丘腦(以灰結節(jié)和視交叉之間的中心點為中心確定下丘腦組織，前界為視交叉前緣，后界為乳頭體后緣，兩側為顳側溝，寬約4 mm，深約2 mm，長約4 mm[11])、腺垂體、肝臟、胰腺、腓腸肌肌肉組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定。其余5只SD大鼠斷頭處死，開顱取下丘腦、整個垂體、肝臟、胰腺、腓腸肌裝入無RNA酶的EP管中，置于液氮速凍后，轉到-80 ℃冰箱中保存待用。

1.4Nesfatin-1表達的免疫組化檢測

1.4.1組織切片的制作將上述固定24 h的組織經(jīng)流水充分洗滌后，修整，依次經(jīng)體積分數(shù)50%，70%，80%，95%，100%酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)。以上組織各制備2套切片，分別作為免疫組化組和陰性對照組備測。

1.4.2免疫組織化學染色免疫組化組切片化學染色程序按試劑盒說明書進行；對照組用PBS代替一抗，其余步驟同免疫組化組。

1.4.3圖像采集光學顯微鏡下拍照(400×)，參考雌性大鼠下丘腦各核團圖譜[12]分別采集照片，獲取Nesfatin-1在下丘腦室旁核、外側區(qū)、弓狀核、背內側核、室周核、腺垂體、肝臟、胰腺胰島和腺泡及肌肉中的免疫陽性部位照片。每個動物每個組織選5張照片，采用江蘇捷達科技JEDA801D形態(tài)分析系統(tǒng)分析平均光密度。

1.5Nesfatin-1 mRNA的實時熒光定量PCR檢測

1.5.1組織中總RNA的提取及cDNA的合成用TRIzol提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖-甲醛變性凝膠電泳，檢測RNA完整性，紫外分光光度計測定RNA樣品濃度及純度。每個RNA樣品取3 μg反轉錄為cDNA，于-80 ℃保存。

1.5.2引物設計和合成根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中大鼠β-actin和NUCB2基因序列(GenBank序列號分別為NM_031144和NM_021663.2)，采用Primer express 3.0軟件分別設計β-actin和Nesfatin-1 mRNA擴增引物，交由Invitrogen公司合成?；蛞镄蛄腥绫?所示。

表 1　實時熒光定量PCR引物序列

1.5.3Nesfatin-1 mRNA的實時熒光定量PCR檢測按SYBR Premix ExTaqTMⅡ說明進行RT-PCR：分別取2 μL cDNA、2 μL Primers、25 μL Buffer、0.5 μL SYBR green Ⅰ，加DEPC水至終體積為50 μL。NUCB2的PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt(Relative Quantification Study)方法計算Nesfatin-1 mRNA的相對表達量。每個樣本重復3次。

1.6數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計與分析，以P<0.05表示差異顯著。

2結果與分析

2.1Nesfatin-1在大鼠生長軸中表達的免疫組化染色分析

Nesfatin-1在下丘腦的背內側核(圖1-A)、外側區(qū)(圖1-B)、視上核(圖1-C)、室周核(圖1-A，D，E)、室旁核(圖1-D)、弓狀核(圖1-E)及腺垂體(圖1-F，G)、肝臟(圖1-H)和胰腺胰島、腺泡(圖1-I)等部位均有陽性表達。而在腓腸肌肌肉中的表達呈弱陽性(圖1-J)，陰性對照組均呈陰性(圖1-K，L)。對采集的照片進行平均光密度值分析，結果(圖2)表明：室周核與胰腺胰島的平均光密度值最高，顯著高于其他組織(P<0.05)，胰腺腺泡、肝臟及肌肉的平均光密度值則較低(P<0.05)；另外，背內側核、外側區(qū)和室旁核的平均光密度值顯著高于視上核、弓狀核、腺垂體(P<0.05)，但背內側核、外側區(qū)和室旁核間及弓狀核、視上核與腺垂體之間差異均不顯著(P>0.05)。

2.2Nesfatin-1 mRNA在雌性大鼠生長軸中的表達

由圖3可知，在成年雌性大鼠下丘腦、腺垂體、肝臟、胰腺中，Nesfatin-1 mRNA均有不同程度的表達，其中以胰腺中的表達量最高，腺垂體次之，下丘腦和肝臟較低，胰腺和腺垂體的表達量顯著高于下丘腦和肝臟，但下丘腦與肝臟間差異不顯著(P>0.05)。在腓腸肌中未檢測出Nesfatin-1 mRNA的表達。

3討論

3.1Nesfatin-1在下丘腦的表達

機體的攝食和能量的調控由下丘腦復雜的神經(jīng)環(huán)路來完成，其中以下丘腦PVN、LHA和ARC區(qū)尤為重要[13]。有研究表明，約19%的ARC神經(jīng)元共表達Nesfatin-1和神經(jīng)肽Y(NPY)，而通過下丘腦ARC神經(jīng)元全細胞電流鉗技術則發(fā)現(xiàn)，Nesfatin-1可導致NPY神經(jīng)元超極化，提示其可能通過抑制NPY神經(jīng)元及激活鉀離子通路來引起厭食[14]。李志玲等[15]認為，Nesfatin-1參與了對ARC神經(jīng)元電活動及胃運動的調控。Shimizu等[16]則發(fā)現(xiàn)，通過使用迷走神經(jīng)阻滯劑辣椒素可消除通過外周神經(jīng)注射Nesfatin-1而引起的抑食作用，提示Nesfatin-1可能通過激活迷走神經(jīng)調節(jié)攝食信號的傳導，從而起到抑制進食的作用。機體的生長離不開攝食，而Nesfatin-1對攝食產(chǎn)生的作用勢必會影響到機體的生長。

下丘腦的神經(jīng)內分泌小細胞分泌包括生長激素釋放激素(Growth hormone releasing hormone，GHRH )、生長激素抑制激素(Somatostatin，SS)、促甲狀腺激素釋放激素(Thyrotropin-releasing hormone(TRH))等在內的9種激素。本試驗通過免疫組織化學的方法驗證了Nesfatin-1陽性細胞在DMH、LHA、ARC、PVN、PeN中的分布。這與Foo等[17]認為在小細胞內分泌神經(jīng)元中，Nesfatin-1與SS和GHRH共區(qū)域相吻合。Garcia-Galiano等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，在雌性大鼠從幼年期向青春期過渡過程中，Nesfatin-1 mRNA在其下丘腦PVN、LHA和SON部位的表達量上升了3倍。Nesfatin-1陽性細胞的分布特點及其表達量隨年齡的不同而不同，該結果也提示其可能與機體各種生長激素及抑制激素存在一定程度的相關性。

圖 1Nesfatin-1在雌性成年大鼠生長軸中的定位分析

A.下丘腦背內側核(DMH)和室周核(PeN)；B.下丘腦外側區(qū)(LHA)；C.下丘腦視上核(SON)；

D.下丘腦室旁核(PVN),PeN；E.下丘腦弓狀核(ARC),PeN；F、G.腺垂體；H.肝臟；

I.胰腺胰島，腺泡；J.肌肉；K.下丘腦陰性對照；L.腺垂體陰性對照；箭頭所示為Nesfatin-1陽性細胞

Fig.1Localization of Nesfatin-1 in the growth axis of female rats

A.Dorsomedial hypothalamic nucleus (DMH),Periventricular nucleus (PeN) of the hypothalamus;

B.Hypothalamic lateral area(LHA);C.Hypothalamic supraoptic nucleus(SON);D.paraventricular nucleus(PVN),PeN;

E.Hypothalami arcuate nucleus(ARC),PeN;F and G.Anterior pituitary;H.Liver;I.Pancreatic islet,Pancreatic acini J.Muscle;

K.Negative control;L.Negative control for anterior pituitary.Arrows show the immunoreactive cells of Nesfatin-1

圖 2　Nesfatin-1陽性細胞在大鼠生長軸上的表達量分析

圖 3　Nesfatin-1 mRNA 在成年雌性大鼠生長軸中的表達

3.2Nesfatin-1在垂體中的表達

垂體可以分為腺垂體和神經(jīng)垂體，作為機體重要的內分泌腺，其在調節(jié)動物體機體平衡、生長、生殖等各方面激素的分泌中發(fā)揮著重要的作用。目前針對Nesfatin-1在動物體垂體中的分布和作用尚鮮有報道。本試驗結果顯示，Nesfatin-1陽性細胞在腺垂體中有大量分布，且mRNA相對含量顯著高于下丘腦。這與Foo等[17]所報道的其存在于腺垂體前葉的結果相類似。腺垂體細胞主要分泌包括生長激素、促性腺激素在內的多種激素，Nesfatin-1在腺垂體中的分布，與動物種類、年齡等各方面是否有關尚不明確。Gonzalez等[9]對金魚腹腔注射Nesfatin-1，其促黃體素(Luteinizing hormone，LH)和促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH ) mRNA的表達量會有所下降。Tadross等[19]報道，對雄性大鼠腦室注射Nesfatin-1，可以促進其LH和FSH的分泌，并且能夠刺激下丘腦釋放GnRH。Lents等[20]報道，在青春期前的豬中，側腦室注射Nesfatin-1能促進LH的分泌。這表明在不同物種中，Nesfatin-1的作用方式也不盡相同。而上述研究多是基于外源性Nesfatin-1對動物生殖方面的影響，對生長激素的分泌是否有影響則鮮有報道，因此尚有待進一步研究。

3.3Nesfatin-1在肝臟、胰腺及肌肉中的表達

本試驗通過免疫組織化學方法分析明確了Nesfatin-1在胰腺、肝臟及腓腸肌中均有分布，在胰腺中Nesfatin-1陽性細胞存在于胰島細胞及腺泡中，這與Gonzalez等[21]發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1前體與胰島素共存的結論相吻合。另據(jù)Mohan等[8]報道，在大鼠的生長發(fā)育過程中，Nesfatin-1與胰島β細胞共同釋放，二者表達的比率與大鼠年齡相關，在大鼠產(chǎn)后的13，20，27 d中，其血清中的Nesfatin-1水平隨著大鼠的生長而持續(xù)升高，表明器官的發(fā)育與Nesfatin-1的含量有著密不可分的關系。肝臟作為GH的主要靶器官，是產(chǎn)生胰島素樣生長因子的最主要部位，在促進生長、代謝及機體免疫功能調節(jié)等多方面都有重要作用[22]。因而筆者認為，Nesfatin-1不僅通過攝食來影響機體的生長發(fā)育，其在大鼠生長軸上的分布程度提示其可能直接參與了多種生長激素及抑制激素的表達。通過免疫組織化學分析發(fā)現(xiàn)，Nesfatin-1在腓腸肌中有較弱的表達，但在腓腸肌中則未檢測出Nesfatin-1 mRNA的表達，推測腓腸肌中的Nesfatin-1抗原是由其他器官分泌至其中的，在此過程中，由于Nesfatin-1 mRNA半衰期短，其短時間內即被降解，所以未被檢測到。

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Expression of Nesfatin-1 and its mRNA in growth axis of rats

LI Ran,WANG Yao-yao,LI Yun-sheng,FANG Fu-gui,LI Fu-bao

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

Abstract:【Objective】 In the paper,expression of Nesfatin-1 mRNA in growth axis of rats including hypothalamus,pituitary,liver,pancreas,and muscle was explored.【Method】 After deep anesthesia perfusion,hypothalamus,adenohypophysis,liver,pancreas,and gastrocnemius muscle of female rats were collected and fixed in 4% paraformaldehyde solution.Then,immuno-histochemical PV-9000 2-step method and DAB staining technique were used to detect the distribution of Nesfatin-1.Other female rats were beheaded and same tissues were collected and the expression was measured using fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR).【Result】 Nesfatin-1 mainly distributed in the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN),dorsomedial nucleus(DMH),periventricular nucleus(PeN),lateral hypothalamic area(LHA),arcuate nucleus(ARC),supraoptic nucleus(SON),pituitary,pancreas islet and acinar cells,liver,and muscle.Average optical density of Nesfatin-1 in PeN and pancreatic islet was significantly higher (P<0.05) than in other tissues while that in pancreatic acini,liver and muscle was significantly lower (P<0.05).The expression in hypothalamic DMH,LHA and PVN was significantly different from in SON,ARC and anterior pituitary.The expression level of Nesfatin-1 mRNA in pancreas was the highest followed by pituitary,while the expression in liver and hypothalamus was the lowest.No expression of Nesfatin-1 mRNA was observed in muscle.【Conclusion】 Nesfatin-1 and its mRNA widely distribute in the growth axis,indicating that Nesfatin-1 may participate in regulation of growth and development in rats.

Key words:Nesfatin-1;rat;growth axis;expression and regulation

DOI：網(wǎng)絡出版時間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.004

[收稿日期]2014-10-29

[基金項目]高等學校博士學科點專項科研基金博導類資助項目(20123418110004)

[作者簡介]李冉(1990-)，女，安徽泗縣人，在讀碩士，主要從事動物組織胚胎及神經(jīng)內分泌研究。 [通信作者]李福寶(1953-)，男，安徽蚌埠人，教授，主要從事動物解剖與神經(jīng)內分泌研究。E-mail:lfb@ahau.edu.cn

[中圖分類號]Q983+.5；Q42

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)06-0023-06

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.008.html