關(guān)節(jié)軟骨的熒光顯微檢測方法研究

王瀟,吳曰超,何俊豪,毛之華,張學(xué)喜,蔡金洋,王強,尹建華*

(1.南京航空航天大學(xué)自動化學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系,南京　211106;2.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室,南京　210029)

關(guān)節(jié)軟骨的熒光顯微檢測方法研究

王瀟1,吳曰超1,何俊豪1,毛之華1,張學(xué)喜1,蔡金洋2,王強2,尹建華1*

(1.南京航空航天大學(xué)自動化學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系,南京211106;2.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室,南京210029)

摘要:基于關(guān)節(jié)軟骨組織中膠原蛋白的自發(fā)熒光特性,對軟骨組織的熒光顯微檢測方法進行研究。首先基于熒光圖像的統(tǒng)計處理,揭示健康樣本與病變樣本的差異。其次基于熒光的偏振敏感特性,利用線性二色性方法揭示了軟骨組織存在的熒光各向異性特性,為利用熒光各向異性方法研究生物組織結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)的顯微方法檢測軟骨組織的形態(tài)和超結(jié)構(gòu)相比,利用熒光特性的熒光顯微檢測方法具有獲取軟骨組織結(jié)構(gòu)的能力。本文的研究結(jié)果為開辟新的骨關(guān)節(jié)疾病診斷方法提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:關(guān)節(jié)軟骨;熒光顯微;各向異性

1引言

關(guān)節(jié)軟骨(articular cartilage,AC)是一種透明的結(jié)締組織,覆蓋在骨關(guān)節(jié)的連接表面(幾百微米到幾毫米厚度)。其表面光滑,輔以關(guān)節(jié)滑液,有利于減少相鄰兩骨的摩擦,使人體得以自由運動。然而當關(guān)節(jié)軟骨隨年齡增長或者受外界的影響(如外傷、過承重、低溫等)時,則會發(fā)生組織功能性退變甚至骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)等各種形式的關(guān)節(jié)疾病。該病的后期階段則會出現(xiàn)不可逆的大范圍的軟骨損壞,從而最終導(dǎo)致整個關(guān)節(jié)功能和關(guān)節(jié)置換的喪失。因此,對軟骨疾病進行早期診斷意義重大。

在過去的關(guān)節(jié)軟骨研究中,人們采用的檢測手段主要是生物化學(xué)分析[1]、磁共振成像[1]、生物力學(xué)測量[2]等。生物化學(xué)和生物力學(xué)能探測大塊組織或者較厚的平行切片,卻受限于分辨率。 磁共振成像成功測量軟骨的蛋白多糖含量,但難于探測膠原蛋白的含量信息。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡、掃描和透射顯微鏡可以對組織的形態(tài)學(xué)和超結(jié)構(gòu)進行成像,但缺少成分濃度以及細微組織結(jié)構(gòu)信息[3-6]。傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared imaging,FTIRI)光譜成像技術(shù)亦被用于關(guān)節(jié)軟骨分析檢測,并取得了一定的進展[7-8]。

與此同時,在過去的幾十年中熒光技術(shù)因其各種特性和優(yōu)點迅速發(fā)展,極大地豐富了生命科學(xué)研究手段,回答了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域復(fù)雜的科學(xué)問題。其中以熒光輻射光強為對比機制的顯微技術(shù)因可直接反映熒光基團的位置和濃度,應(yīng)用最為廣泛。除此之外熒光本身所具有的波長,壽命和偏振特性也被廣泛應(yīng)用到生物檢測領(lǐng)域。波長特性為熒光光譜方法和多色熒光圖像提供了物理基礎(chǔ)；而熒光壽命則對對熒光基團所處環(huán)境敏感；同時熒光的偏振敏感性則被用于研究生物分子方向信息以及組織結(jié)構(gòu)特性[9-11]。而基于熒光光譜和熒光壽命的檢測技術(shù)已經(jīng)被成功應(yīng)用于軟骨組織的研究和骨關(guān)節(jié)炎的診斷中[12-13]。

本文基于關(guān)節(jié)軟骨中膠原蛋白的自發(fā)熒光特性,對軟骨組織的熒光顯微特性進行研究,為探索軟骨組織熒光檢測方法提供基礎(chǔ)。主要包括兩個方面,首先基于熒光的光強特性,分析正常軟骨和病變軟骨的熒光圖像差別,用熒光圖像處理的方法來檢測軟骨組織。由于軟骨組織中膠原蛋白的自發(fā)熒光特性,可以對軟骨組織不做標記進行自發(fā)熒光顯微成像。膠原蛋白形成纖維網(wǎng)絡(luò),保證關(guān)節(jié)軟骨可承受機械壓力和拉力,同時固定蛋白多糖,而蛋白多糖保證軟骨的彈性、吸收運動時產(chǎn)生的震動。紅外光譜成像方法的研究結(jié)果表明,病變軟骨組織會有大量蛋白多糖的流失,進而引起組織基質(zhì)的改變[14]。因此健康樣本和病變樣本的熒光圖像在形態(tài)特征上存在區(qū)別。為此對兩種樣本進行熒光顯微成像,通過比較其熒光圖像并分析其圖像差別。

其次基于熒光的偏振敏感特性,利用線性二色性方法研究軟骨組織的熒光偏振響應(yīng)特性,從各項異性信息檢測方面為生物組織的研究提供基礎(chǔ)。其中所謂的線性二色性(LD-linear dichroism)方法是基于熒光吸收過程中吸收效率對激發(fā)光偏振方向的敏感性(吸收效率)提出的,每個熒光分子都有其極性方向,而受激發(fā)時的吸收效率正比于其極性方向與激發(fā)光偏振方向夾角余弦的平方,基于該原理提出的LD法已成功用于研究細胞膜磷脂分子排列分布[15]以及淀粉纖維組織結(jié)構(gòu)[16]。而軟骨組織中膠原纖維的各向異性結(jié)構(gòu)作為表征能夠區(qū)分健康和病變組織。因此本文基于膠原纖維的自發(fā)熒光特性,利用該方法,揭示其軟骨組織的各向異性結(jié)構(gòu),為用熒光偏振檢測軟骨組織結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)。

2軟骨組織熒光顯微檢測實驗

2.1熒光顯微圖像實驗

在實驗中,為保證所獲取熒光圖像具有更好的軸向分辨力,去除骨碎末等雜質(zhì)對圖像的影響,采用激光共聚焦熒光顯微系統(tǒng)(ZEISS LSM700)獲取熒光圖像,激發(fā)波長為491 nm波段的藍光,每個像素點駐留時間為3 ms。利用該共焦系統(tǒng)的20倍放大倍率,對健康樣本和病變樣本分別進行熒光成像。

2.2熒光偏振檢測實驗

實驗采用奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(IX51),配置MicroPublisher3.3RTV 型號CCD,采集軟骨樣品熒光強度數(shù)據(jù)。激發(fā)光的偏振方向改變通過起偏器的旋轉(zhuǎn)實現(xiàn)。具體的光路如圖1所示,鹵素?zé)舭l(fā)出的白光經(jīng)濾光片后成為激發(fā)光光源,經(jīng)起偏器改變偏振方向a,然后被二色棱鏡反射進入顯微物鏡,激發(fā)樣本。在該偏振方向下,輻射熒光經(jīng)過顯微物鏡最后曝光成像在與樣本平面共軛的CCD。改變激發(fā)光偏振方向a,在每個偏振方向a下,CCD記錄其對應(yīng)的熒光圖像,最終產(chǎn)生一個偏振熒光圖像序列。從該圖像序列中,對每個像素點沿偏振方向a這個維度可以獲取隨a變化的熒光輻射光強。

2.3樣本制備

實驗所用健康樣本和病變樣本均為犬后膝關(guān)節(jié)軟骨,犬后膝關(guān)節(jié)軟骨取自2條成年狗(1 條健康,1條患有關(guān)節(jié)炎)。OA樣本為實施了前十字韌帶(anterior cruciate ligament,ACL)截斷術(shù)后飼養(yǎng)兩年的成年狗,該ACL橫切的犬模型已成為OA動物研究的黃金標準,其可導(dǎo)致關(guān)節(jié)運動失真和軟骨損傷,類似于在人OA中的組織變化。軟骨樣本從半月板覆蓋著的脛骨上切下,軟骨骨塊的大小約為 2 mm×2 mm×2 mm。隨后用鹽水洗滌樣本并用液氮快速冷凍,在低溫切片機(Leica CM 1950,Germany)零下20攝氏度的環(huán)境中被切成10微米厚的切片。 軟骨切片附著在載玻片上,并在空氣中干燥。切割方向垂直于軟骨表面,即從淺表區(qū)(SZ)、過渡區(qū)(TZ)到放射區(qū)(RZ)[17]。

Fig.1The setup of polarized fluorescence microscopic

3實驗結(jié)果分析

3.1軟骨組織的熒光顯微圖像分析

利用2.1所述的激光共聚焦熒光顯微系統(tǒng)(ZEISS LSM700)對正常樣本和病變樣本(各3片),進行熒光成像,從熒光圖像直觀上看所有正常樣本圖像特征相似,所有病變樣本圖像特征相似,而兩種樣本的熒光圖像特征差異明顯。共聚焦圖2展示了實驗所測量的樣本中一個健康樣本和一個病變樣本的熒光圖像及其強度統(tǒng)計直方圖,從圖中可以直觀看出,與健康樣本相比病變軟骨發(fā)生如下變化:首先病變樣本淺表層被破壞不再平滑；其次軟骨組織基質(zhì)發(fā)生變化,蛋白多糖流失造成過渡區(qū)附著的細胞數(shù)目明顯減少,膠原纖維直接顯露出來,這與紅外光譜成像方法所得結(jié)果符合[14]。進一步對兩個樣本的前半部分和后半部分,進行熒光圖像直方圖統(tǒng)計的比較,如圖2(c)(f)所示,從圖像統(tǒng)計上給出健康樣本和病變樣本的差異。由于蛋白多糖的流失,造成病變樣本組織基質(zhì)和附著細胞的減少,膠原纖維裸露造成的空洞使得病變樣本的直方圖分布更偏向暗部,前半部分和后半部分的強度分布中心都處在50～70左右,而健康樣本前半部分和后半部分的強度分布中心都處在100～120左右。對其他兩個正常樣本和病變樣本進行處理,得到相似的結(jié)果,該結(jié)果表明病變軟骨的熒光強度分布發(fā)生了明顯的改變,由此可見直方圖統(tǒng)計特征可以作為辨別軟骨組織的一個重要標識,進而為病變軟骨的熒光顯微檢測提供了新的方法。

Fig.2Fluorescence microscopic images(a,b)and fluorescence intensity histograms(c)of the first half part of the healthy and osteoarthritic cartilages,respectively,as well as the corresponding graphs(d,e,f)of the latter half part of the both cartilages.The fluorescence intensity histograms of the healthy and osteoarthritic cartilages are respectively indicated by grey and black in(c)and(f)

3.2軟骨組織的熒光偏振檢測

利用圖1所示熒光偏振檢測裝置,對健康樣本進行測量。實驗中起偏器從0°到180°,以10°為間隔進行旋轉(zhuǎn),保證激發(fā)光的偏振方向a進行相應(yīng)的旋轉(zhuǎn),CCD依次曝光記錄每個激發(fā)光偏振方向a下對應(yīng)的熒光圖像。從19幀的熒光圖像系列中,對每個像素點可以提取受激發(fā)光偏振方向a調(diào)制的熒光變化曲線。圖3展示了一個健康樣本的測量結(jié)果,其中圖3(a)為a=0°時CCD所記錄的熒光圖像。圖3(b)為軟骨組織表層區(qū)A點位置隨偏振方向a變化的歸一化熒光強度和對其擬合后的熒光強度變化曲線。在數(shù)據(jù)擬合中,由于輻射光強正比于偏振方向與熒光偶極子方向夾角余弦的平方,所以設(shè)計擬合函數(shù)為I(α)=A×cos2(α+B)+C,其中I為輻射光強,A為幅度代表了各向異性特性,B為角度平移代表了組織結(jié)構(gòu)的平均取向,C為背景光強。利用Matlab根據(jù)所設(shè)計的擬合函數(shù)對所記錄的熒光強度進行擬合,得到擬合后的熒光變化曲線。從擬合結(jié)果可以看出,擬合曲線匹配實驗數(shù)據(jù),擬合系數(shù)為0.87,表明熒光強度變化曲線符合理論上吸收效率隨a變化的正弦規(guī)律。由于表層區(qū)域纖維排列平行于表面,因此當偏振方向與表面垂直時(即偏振方向α=90°),吸收最小,輻射熒光光強接近最低值,與紅外光譜方法所得結(jié)果符合[18]。為避免單個數(shù)據(jù)的偶然性,進一步沿表層區(qū)水平方向隨機選取8個點(包括點A),疊加這8個點的熒光強度,并對疊加后的熒光強度隨α變化的數(shù)據(jù)進行擬合,其結(jié)果如圖3(c)所示。由于表層區(qū)各位置膠原纖維的排列性質(zhì)基本相同,都沿水平方向,所以多點的統(tǒng)計結(jié)果與單點A的結(jié)果相似。該結(jié)果為利用熒光偏振技術(shù)檢測和診斷軟骨組織結(jié)構(gòu)提供了方法基礎(chǔ)。在下一步的工作中,熒光各向異性信息與組織病變之間的關(guān)系會進行更為詳細的研究。

Fig.3(a)The polarized fluorescence microscopic image of healthy articular cartilage,(b)the polarized fluorescence intensity and the fitted profile of the corresponding point A with the fitting coefficient of 0.87,(c)the statistical polarized fluorescence intensity and the fitted profile for points indicated by white circles in(a)with the fitting coefficient of 0.78

4結(jié)論

本文以軟骨組織膠原蛋白自發(fā)熒光特性為基礎(chǔ),結(jié)合熒光顯微技術(shù)這一強大光學(xué)檢測手段,研究了利用自發(fā)熒光圖像進行組織的檢測,以及利用熒光的偏振特性研究其組織結(jié)構(gòu)的各向異性信息,為利用熒光技術(shù)進行軟骨組織診斷提供新的理念和方法基礎(chǔ)。進一步基于熒光偏振特性研究各向異性信息與病變組織之間的關(guān)系,是接下來要繼續(xù)深入進行的工作。而熒光顯微自身所具有的無損、便捷、高靈敏和高準確性必將在軟骨組織檢測方向展示出其優(yōu)點。

參考文獻

[1]Zheng S,Xia Y,Bidthanapally A,etal.Damages to the extracellular matrix in articular cartilage due to cryopreservation by microscopic magnetic resonance imaging and biochemistry[J].Magn Reson Imaging,2009,27(5):648-655.

[2]Wilson W,Huyghe J M,van Donkelaar C C.Depth-dependent compressive equilibrium properties of articular cartilage explained by its composition[J].Biomech Model Mechanobiol,2007,6(1):43-35.

[3]Chen S S,Falcovitz Y H,Schneiderman R,etal.Depth-dependent compressive properties of normal aged human femoral head articular cartilage:relationship to fixed charge density[J].Osteoarth Cart,2001,9(6):561-569.

[4]Xia Y,Alhadlaq H,Ramakrishnan N,etal.Molecular and morphological adaptations in compressed articular cartilage by polarized light microscopy and Fourier-transform infrared imaging[J].J Struct Biol,2008,164(1):88-95.

[5]Tan A H C,Mitra A K,Chang P C C,etal.Assessment of blood-induced cartilage damage in rabbit knees using scanning electron microscopy[J].J Orthop Surg,2004,12(2):199-204.

[6]Yamamoto K,Shishido T,Masaoka T,etal.Morphological studies on the ageing and osteoarthritis of the articular cartilage in C57 black mice[J].J Orthopaedic Surg,2005,13(1):8-18.

[7]Camacho N P,West P,Torzilli P A,etal.FTIR microscopic imaging of collagen and proteoglycan in bovine cartilage [J].Biopolymers,2001,62(1):1-8.

[8]Zhang X X,Yin J H,Mao Z H,etal.Discrimination of healthy and osteoarthritic articular cartilages by Fourier transform infrared imaging and partial least squares-discriminant analysis[J].J Biomed Opt,2015,20( 6):060501 .

[9]Axelrod D.Carbocyanine dye orientation in red-cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization[J].Biophys J,1979,26(3):557-573.

[10]Vrabioiu A M,Mitchison T J.Structural insights into yeast septin organization from polarized fluorescence microscopy[J].Nature,2006,443(7110):466-469.

[11]Benninger R K,Vanherberghen B,Young S,etal.Live cell linear dichroism imaging reveals extensive membrane ruffling within the docking structure of natural killer cell immune synapses[J].Biophys J,2009,96(2):L13-L15.

[12]Gibson G J,Verner J J,Nelson F R T,etal.Degradation of the cartilage collagen matrix associated with changes in chondrocytes in osteoarthrosis.Assessment by loss of background fluorescence and immunodetection of matrix components[J].J Orthopaedic Res,2001,19(1):33-42.

[13]Talbot C B,Lever M J,Benninger R K P,etal.Fluorescence lifetime imaging of articular cartilage[J].Inter J Exp Pathol,2004,85(1):A31-A32.

[14]Yin J H,Xia Y,Lu M.Concentration profiles of collagen and proteoglycan in articular cartilage by Fourier transform infrared imaging and principal component regression[J].Spectrochim Acta,Part A,2012,88:90-96.

[15]Kress A,Wang X,Ranchon H,etal.Mapping the local organization of cell membranes using excitation-polarization-resolved confocal fluorescence microscopy[J].Biophys J,2013,105(1):127-136.

[16]Duboisset J,Ferrand P,He W,etal.Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy[J].J Phys Chem B,2013,117(3):784-788 .

[17]Zhang X X,Mao Z H,Yin J H,etal.Determination of collagen and proteoglycan concentration in osteoarthritic and healthy articular cartilage by Fourier transform infrared imaging and partial least square[J].Vib Spectrosc,2015,78:49-53.

[18]Yin J H,Xia Y,Ramakrishnan N.Depth-dependent anisotropy of proteoglycan in articular cartilage by Fourier transform infrared imaging [J].Vib Spectrosc,2011,57:338-341.

A Study on Fluorescence Microscopy Measurement Method of Articular Cartilage

XIAO Wang1,WU Yue-chao1,HE Jun-hao1,MAO Zhi-hua1,ZHANG Xue-xi1,CAI Jin-yang2,WANG Qiang2,YIN Jian-hua1*

(1.DepartmentofBiomedicalEngineering,NanjingUniversityofAeronauticsandAstronautics,Nanjing210016,China;2.StateKeyLaboratoryofReproductiveMedicine,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China)

Abstract:Based on the auto-fluorescence property of collagen in articular cartilage,the research on fluorescence microscopy measurement method of articular cartilage was carried out.First,the difference between the healthy and pathological samples was revealed by statistical comparison of fluorescence images.Second,based on the polarization property of fluorescence,the fluorescence anisotropy of the cartilage was presented by the linear dichroism method,which lays foundation for research on structure of articular cartilage using fluorescence anisotropy method.Compared to traditional microscopic measurement techniques that supply the morphology and the super-structure of cartilage tissues,fluorescence microscopy measurement methods are able to obtain the information about the structure of cartilage tissues.The results presented in this paper open the door for developing new diagnostic method for articular cartilage diseases.

Key words:articular cartilage;fluorescence microscopy;anisotropy

收稿日期:2015-08-08; 修改稿日期:2015-10-30

基金項目:國家自然科學(xué)基金(61378087)和江蘇省自然科學(xué)基金(BK20150752)

作者簡介:王瀟(1985-),男,講師,研究方向:生物光子學(xué),光學(xué)顯微成像,生物成像,生物光譜學(xué)。 E-mail:xiao.wang@nuaa.edu.cn 通訊作者:尹建華,E-mail:yin@nuaa.edu.cn

文章編號:1004-5929(2016)02-0185-05

中圖分類號:O433；O657.3；Q-3

文獻標志碼:A

doi:10.13883/j.issn1004-5929.201602016