瑞舒伐他汀對(duì)心肌梗死大鼠左心房交感神經(jīng)重構(gòu)的影響Δ

路清華，顧明明，魏長(zhǎng)春，路　鵬，劉　錦

(1.山東省泰山醫(yī)院藥劑科，山東 泰安　271000； 2.山東省寧陽(yáng)縣第一人民醫(yī)院中醫(yī)科，山東 泰安　271000； 3.山東省泰山醫(yī)院護(hù)理部，山東 泰安　271000； 4.山東省泰山醫(yī)院心內(nèi)科，山東 泰安　271000)

瑞舒伐他汀對(duì)心肌梗死大鼠左心房交感神經(jīng)重構(gòu)的影響Δ

路清華1*，顧明明2，魏長(zhǎng)春3，路鵬1，劉錦4#

(1.山東省泰山醫(yī)院藥劑科，山東 泰安271000； 2.山東省寧陽(yáng)縣第一人民醫(yī)院中醫(yī)科，山東 泰安271000； 3.山東省泰山醫(yī)院護(hù)理部，山東 泰安271000； 4.山東省泰山醫(yī)院心內(nèi)科，山東 泰安271000)

摘要目的：探討瑞舒伐他汀對(duì)心肌梗死(myocardial infarction，MI)大鼠左心房交感神經(jīng)重構(gòu)的影響及其作用機(jī)制。方法：將60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)均分為3組：假手術(shù)組(Sham組)，MI+瑞舒伐他汀干預(yù)組(Rstatin組)及MI組。采用免疫組化法分析3組大鼠左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)(left stellate ganglion，LSG)及左心房組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growthassociated protein 43，GAP-43)陽(yáng)性物質(zhì)含量以反映神經(jīng)纖維的分布和密度，采用Western blot法檢測(cè)兩者的蛋白含量。結(jié)果：Rstatin組和MI組大鼠LSG與左心房組織中GAP-43及NGF陽(yáng)性神經(jīng)密度均明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但Rstatin組明顯低于MI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Rstatin組和MI組大鼠LSG及左心房組織中GAP-43蛋白表達(dá)均明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但Rstatin組明顯低于MI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Rstatin組和MI組大鼠LSG及左心房組織中NGF蛋白表達(dá)均明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但Rstatin組與MI組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：瑞舒伐他汀可有效改善MI大鼠左心房交感神經(jīng)重構(gòu)，其機(jī)制可能與直接抑制LSG內(nèi)GAP-43及左心房組織中NGF的表達(dá)及蛋白生成有關(guān)。

關(guān)鍵詞心肌梗死； 瑞舒伐他汀； 交感神經(jīng)重構(gòu)

心臟由內(nèi)在及外在自主神經(jīng)支配，星狀神經(jīng)節(jié)在功能上屬于交感神經(jīng)節(jié)，左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)(left stellate ganglion，LSG)的興奮性增強(qiáng)可增加心律失常的易感性。心肌梗死(myocardial infarction，MI)后會(huì)出現(xiàn)去神經(jīng)化、神經(jīng)出芽及過(guò)度再生，即神經(jīng)重構(gòu)現(xiàn)象[1]。研究結(jié)果顯示，MI后心臟神經(jīng)重構(gòu)能促進(jìn)房性快速心律失常，尤其是心房顫動(dòng)的發(fā)生[2-3]。近年來(lái)，他汀類藥物的多效性備受關(guān)注，除調(diào)節(jié)血脂作用外，其抗心律失常及防止心臟重構(gòu)等作用屢有報(bào)道[4-5]。Cao等[6]的大型臨床試驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)他汀類藥物具有抗心律失常作用，但具體機(jī)制仍不十分明確。本研究旨在探討MI后心臟是否發(fā)生內(nèi)在及外在自主神經(jīng)重構(gòu)，以及瑞舒伐他汀對(duì)大鼠MI后心房神經(jīng)重構(gòu)的影響及其可能的機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物模型建立和分組

選60只清潔級(jí)(SPF)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250 g左右，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、MI+瑞舒伐他汀干預(yù)組(Rstatin組)、MI組，每組均為20只。MI組和Rstatin組大鼠制作MI模型：腹腔麻醉后，開(kāi)胸暴露心臟，用6/0的細(xì)針穿線結(jié)扎前降支，觀察到遠(yuǎn)端心肌變白、左心房充盈以明確MI形成后，逐層關(guān)胸。Sham組大鼠只在相同部位穿線但不結(jié)扎。Rstatin組大鼠在MI后給予瑞舒伐他汀(無(wú)錫阿斯利康)10 mg/(kg·d)灌胃，Sham組和MI組大鼠給予相應(yīng)量的0.9%氯化鈉注射液，共4周。

1.2心肌組織標(biāo)本的留取

術(shù)后第4周處死各組大鼠后迅速取出心臟，用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈，取LSG及面積為0.4～0.6 cm2的左心房心肌，部分置于中性甲醛中固定1 h，然后置于甲醛中保存；部分儲(chǔ)存于液氮中集中行Western blot和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)。

1.3免疫組化法測(cè)定生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growthassociated protein 43，GAP-43)及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)陽(yáng)性神經(jīng)纖維

從甲醛中取出組織，進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋及切片，切片厚度為3 μm。切片于60 ℃預(yù)熱30 min，脫蠟，以枸櫞酸鈉高溫抗原修復(fù)2 min，3%H2O2反應(yīng)10 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。分別滴加一抗為GAP-43抗體1∶1 000(英國(guó)Abcam公司)及NGF抗體1∶1 000(英國(guó)Abcam公司)，于4 ℃下孵育過(guò)夜。然后滴加二抗，以DAB顯色試劑盒顯色，棕色顆粒為GAP-43/NGF陽(yáng)性染色物質(zhì)。使用計(jì)算機(jī)輔助形態(tài)計(jì)量分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus 6.0)測(cè)定陽(yáng)性染色的平均光密度(average optical density，AOD)，據(jù)此比較組間陽(yáng)性染色物質(zhì)的差異。

1.4Western Blot測(cè)定GAP-43、NGF蛋白表達(dá)

取適量蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜、5%脫脂奶粉，于37 ℃封閉1 h后加入兔多克隆GAP-43、NGF一抗1∶1 000(英國(guó)Abcam公司)及小鼠單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗1∶1 000(英國(guó)Abcam公司)于4 ℃下孵育120 min，分別加入相應(yīng)二抗孵育90 min，充分洗滌后與增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(美國(guó)NEN公司)反應(yīng)，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光顯色[LAS-4000mini化學(xué)發(fā)光成像分析儀，通用電器醫(yī)療(日本)公司]，使用LAS-4000mini2200凝膠成像儀[通用電器醫(yī)療(日本)公司]采集圖片。以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算目的蛋白與同步GAPDH灰度值的比值作為相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.14周后3組大鼠LSG及左心房組織交感神經(jīng)再生現(xiàn)象

Rstatin、MI組大鼠LSG及心房區(qū)GAP-43、NGF陽(yáng)性染色的AOD均明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且空間分布更加紊亂，神經(jīng)纖維的走向與心肌細(xì)胞的排列不一致，部分神經(jīng)纖維粗大；Rstatin組大鼠GAP-43和NGF陽(yáng)性染色的AOD均明顯低于MI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1～2及圖1～2。

表13組大鼠左心房組織GAP-43及NGF陽(yáng)性染色的

注：與Sham組比較，*P<0.01；與Rstatin組比較，△P<0.01

Note：vs. the sham group,*P<0.01; vs. the rstatin group,△P<0.01

表2　3組大鼠LSG中GAP-43及NGF陽(yáng)性染色的

注：與Sham組比較，*P<0.01；與Rstatin組比較，△P<0.01

Note：vs. sham group,*P<0.01; vs. Rstatin group,△P<0.01

A. Sham組GAP-43染色；B.Rstatin組GAP-43染色；C.MI組GAP-43染色；D.Sham組NGF染色；E.Rstatin組NGF染色；F.MI組NGF染色A.GAP-43 staining in sham group；B.GAP-43 staining in rstatin group；C.GAP-43 staining in MI group；D.NGF staining in sham group；E.NGF staining in rstatin group；F.NGF staining in MI group圖1　3組大鼠心房組織中GAP-43及NGF陽(yáng)性物質(zhì)分布Fig 1　Distribution of GAP-43 in atrial tissue and positive density of NGF

A. Sham組GAP-43染色；B.Rstatin組GAP-43染色；C.MI組GAP-43染色；D.Sham組NGF染色；E.Rstatin組NGF染色；F.MI組NGF染色A.GAP-43 staining in sham group；B.GAP-43 staining in rstatin group；C.GAP-43 staining in MI group；D.NGF staining in sham group；E.NGF staining in rstatin group；F.NGF staining in MI group圖2　3組大鼠LSG中GAP-43及NGF陽(yáng)性物質(zhì)分布Fig 2　Distribution of GAP-43 in LSG and positive density of NGF

A.3組大鼠左心房GAP-43蛋白表達(dá)；B.3組大鼠左心房NGF蛋白表達(dá)；C.3組大鼠LSG中GAP-43蛋白表達(dá)；D.3組大鼠LSG中NGF蛋白表達(dá)；*P<0.01；LA.左心房A.expression of GAP-43 protein in LA of three group of rats；B.expression of NGF protein in left atrium of three group of rats；C.expression of GAP-43 protein in LSG of three group of rats；D.expression of NGF protein in LSG of three group of rats；*P<0.01；LA.left atrium圖3　左心房組織及LSG中GAP-43、NGF蛋白表達(dá)Fig 3　Expression of GAP-43 protein and NGF protein in LA and LSG

2.24周后3組大鼠左心房組織及LSG中GAP-43、NGF蛋白表達(dá)

MI、Rstatin組大鼠左心房組織及LSG中GAP-43、NGF蛋白表達(dá)水平均明顯高于Sham組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Rstatin組大鼠左心房組織及LSG中GAP-43蛋白表達(dá)水平均明顯低于MI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而NGF蛋白表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

3討論

近年來(lái)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MI時(shí)可伴有心臟及星狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)損傷及修復(fù)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)再分布和高支配現(xiàn)象，這種交感神經(jīng)的高支配可引起心房顫動(dòng)等多種心律失常[7]。這種交感神經(jīng)高支配現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，盡管心臟神經(jīng)出芽及過(guò)度再生機(jī)制還不是十分清楚，但有研究結(jié)果表明，受損心肌及炎癥組織合成并釋放的NGF在神經(jīng)重構(gòu)中起著重要的作用[8-9]。NGF是機(jī)體重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一，能促進(jìn)交感神經(jīng)的發(fā)育與分化，加強(qiáng)神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生修復(fù)，而抑制NGF表達(dá)則會(huì)減少M(fèi)I后組織交感神經(jīng)的生長(zhǎng)[10]。NGF能促進(jìn)心臟交感神經(jīng)的生長(zhǎng)及受損去甲腎上腺素能神經(jīng)元的再生，因此，其可能參與MI后交感神經(jīng)失支配、再生和過(guò)度支配過(guò)程，進(jìn)而與MI后心律失常的發(fā)生密切相關(guān)[6]。GAP-43是一種胞膜磷酸蛋白，與神經(jīng)發(fā)育、突觸形成和可塑性，特別是與神經(jīng)再生密切相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，NGF可能促使GAP-43在生長(zhǎng)錐中磷酸化，轉(zhuǎn)染人GAP-43 cDNA的PC12細(xì)胞對(duì)NGF的敏感性增加10倍，神經(jīng)突起再生作用顯著提高，而且周圍神經(jīng)損傷后，GAP-43含量可增加20～100倍[11-13]。在特定的條件和環(huán)境下，周圍神經(jīng)軸突的再生與GAP-43有著十分密切的關(guān)系，因周圍神經(jīng)的再生需要合成數(shù)種與神經(jīng)再生相關(guān)的蛋白質(zhì)，而GAP-43就是其中較重要的一種，可以被認(rèn)為是周圍神經(jīng)再生的標(biāo)志[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，MI后左心房和LSG均發(fā)生了交感神經(jīng)重構(gòu)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，單純左心室MI后心房出現(xiàn)神經(jīng)過(guò)度再生，心房顫動(dòng)誘發(fā)率也相應(yīng)增高[2，13]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)左心室MI導(dǎo)致心臟神經(jīng)纖維密度顯著增加，分布紊亂。有研究顯示，MI可引起LSG的NGF及GAP-43含量增多，而NGF mRNA并未增加，這提示LSG中增加的NGF可能是由梗死區(qū)域心肌組織產(chǎn)生并經(jīng)神經(jīng)軸突逆向轉(zhuǎn)運(yùn)而來(lái)的[1]。本研究發(fā)現(xiàn)MI大鼠心房?jī)?nèi)蛋白的相對(duì)表達(dá)量比Sham組明顯增加。本研究對(duì)大鼠MI后心房中NGF蛋白表達(dá)及交感神經(jīng)支配進(jìn)行研究，結(jié)果提示心肌細(xì)胞表達(dá)的NGF蛋白在MI后交感神經(jīng)重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。本研究證實(shí)由于LSG的神經(jīng)廣泛分布于整個(gè)心臟，其增加的GAP-43可在心臟整體水平促進(jìn)交感神經(jīng)再生。他汀類藥物在心血管疾病中的應(yīng)用已相當(dāng)廣泛，這可能與其多效性有關(guān)，如改善心室重構(gòu)及抗心律失常，這些作用有益于改善MI患者的預(yù)后。心臟神經(jīng)重構(gòu)也能促進(jìn)心房顫動(dòng)發(fā)生，而他汀類藥物被證明可通過(guò)抗炎作用降低房性心律失常的誘發(fā)率[3，16]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀具有改善MI大鼠交感神經(jīng)重構(gòu)的作用[17]。盡管單獨(dú)使用辛伐他汀不能使心臟神經(jīng)重構(gòu)完全恢復(fù)到正常狀態(tài)，但明顯好于未用藥組，提示他汀類藥物在MI患者中的應(yīng)用是必要的。

綜上所述，瑞舒伐他汀通過(guò)改善大鼠MI后心房神經(jīng)重構(gòu)而起到預(yù)防房性快速心律失常的作用，其機(jī)制可能與其在LSG及心房組織中使NGF及GAP-43表達(dá)下調(diào)有關(guān)，這為他汀類藥物在MI后的臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。然而，MI后心房交感神經(jīng)的再生過(guò)程非常復(fù)雜，GAP-43的陽(yáng)性表達(dá)僅提示神經(jīng)的再生反應(yīng)，并不意味著一定就有成功的再生，而缺乏GAP-43表達(dá)也并非意味著軸突生長(zhǎng)完全抑制。GAP-43的特性、GAP-43與NGF之間的關(guān)系及如何促進(jìn)MI后心房交感神經(jīng)的重構(gòu)尚有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of Rosuvastatin on Sympathetic Neural Remodeling of Left Atrium in Rats after Myocardial InfarctionΔ

LU Qinghua1, GU Mingming2, WEI Changchun3, LU Peng1, LIU Jing4

(1.Dept.of Pharmacy, Shandong Taishan Hospital, Shandong Taian 271000, China; 2.Dept.of Traditional Chinese Medicine, Shandong Ningyang County the First People’s Hospital, Shandong Taian 271000, China; 3.Dept.of Nursing, Shandong Taishan Hospital, Shandong Taian 271000, China; 4.Dept.of Cardiology, Shandong Taishan Hospital, Shandong Taian 271000, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To investigate the effects of rosuvastatin on sympathetic neural remodeling of left atrium(LA) in rats after myocardial infarction(MI) and the mechanism of action. METHODS: 60 male wistar rats were randomly divided into sham operation group (sham group), MI+ rosuvastatin intervention group (rstatin group), and MI group (MI group). Immunohistochemistry was used to analyze the left stellate ganglion(LSG) in rats and nerve growth factor(NGF) in atrial tissue, positive materials of growthassociated protein 43(GAP-43), and then the distribution and density of nerve fiber were reflected. The expression levels of the proteins were quantified by Western blotting. RESULTS: LSG in rats, GAP-43 in atrial tissue and positive nerve density of NGF in rstatin group and MI group were significantly higher than those of sham group, with statistically significant difference(P<0.01); yet rstatin group were lower than MI group, with statistically significant difference(P<0.01). The protein expression of LSG and GAP-43 in rstatin group and MI group were significantly higher than those of sham group, with statistically significant difference(P<0.01); yet rstatin group were lower than MI group, with statistically significant difference(P<0.01). Meanwhile, the protein expression of LSG and NGF were significantly higher than those of sham group, with statistically significant difference(P<0.01); yet there was no significance between rstatin group and MI group(P>0.05). CONCLUSIONS: Rosuvastatin could effectively improve the sympathetic neural remodeling of LA in MI rats. The mechanism might be associated with the direct inhibition of expression and protein synthesis of GAP-43 in LSG and NGF in LA.

KEYWORDSMyocardial infarction; Rosuvastatin; Neural remodeling

Δ基金項(xiàng)目：2014年深圳市科創(chuàng)委科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.JCYJ20140414160300581)

中圖分類號(hào)R972+.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1672-2124(2016)05-0624-05

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.05.020

(收稿日期：2015-12-10)

*副主任藥師，博士。研究方向：天然藥物化學(xué)。E-mail：jilinwb@163.com