2010
—2013年上海長寧地區(qū)成人輪狀病毒急性胃腸炎的分子特征

徐仲卿，沈思蘭，朱紹琴，張萬菊，胡蕓文，錢方興

1. 上海市同仁醫(yī)院，上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院，上海 200336； 2. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

*同為第一作者

2010
—2013年上海長寧地區(qū)成人輪狀病毒急性胃腸炎的分子特征

徐仲卿1,*，沈思蘭1,*，朱紹琴2，張萬菊2，胡蕓文2，錢方興1

1. 上海市同仁醫(yī)院，上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院，上海 200336； 2. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

摘要：為研究上海長寧地區(qū)成人輪狀病毒急性胃腸炎的分子特征，收集2010年6月—2013年12月長寧區(qū)定點醫(yī)院成人急性胃腸炎患者的糞便標本1 554份，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進行A組輪狀病毒檢測，多重聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)進行B組和C組輪狀病毒檢測。結(jié)果顯示，1 554例患者的平均年齡為(46.19±15.59)歲，其中男性691例、女性863例。共檢出輪狀病毒200株，檢出率為12.87%。18～39歲組的輪狀病毒檢出率為9.15%，40～59歲組為15.58%，60～79歲組為15.16%，≥80歲組為18.57%。A組輪狀病毒基因型檢測結(jié)果顯示，G型以G9亞型最多(29.82%)，P型以P[8]亞型最多(77.19%)，GP組合以G9P[8]最多(25.73%)。結(jié)果提示，2010—2013年上海長寧地區(qū)成人輪狀病毒急性胃腸炎在就診患者中以中老年多見，基因型以G9P[8]最多。

關(guān)鍵詞：腹瀉；基因型；輪狀病毒；急性胃腸炎

全球范圍內(nèi)每年約有25億兒童發(fā)生腹瀉，其中1.14億與輪狀病毒(rotavirus，RV)相關(guān)，可造成2 400萬人次就診，240萬人次住院，52.7萬人死亡[1]。我國每年有近3萬名5歲以下兒童死于輪狀病毒腹瀉[2]，因腹瀉入院的5歲以下兒童輪狀病毒檢測陽性率高達47.8%[3]。雖然輪狀病毒引起的急性胃腸炎在成人中較少見，但其相關(guān)性胃腸炎在成人和老年人中的暴發(fā)時有報道[4-6]，給國民健康造成了一定影響。輪狀病毒由澳大利亞的Bishop于1973年在兒童急性腹瀉患者的十二指腸組織中首次發(fā)現(xiàn)。輪狀病毒是雙鏈RNA病毒，隸屬于呼腸病毒科輪狀病毒屬，基因組由11個不連續(xù)片段組成[7]。根據(jù)抗原性和遺傳特性分為8個組(A～H)，其中A、B、C三組輪狀病毒被證實可感染人類[8]。大部分人類感染由A組病毒引起；B組病毒由我國洪濤首次發(fā)現(xiàn)[9]，可導致成人胃腸炎流行；C組病毒則多呈散發(fā)。為進一步了解輪狀病毒在成人中的流行情況，本研究對2010—2013年上海市長寧區(qū)定點醫(yī)院的成人急性胃腸炎患者糞便標本進行輪狀病毒基本流行病學調(diào)查，檢測型別，著重分析其分子特征。

1材料與方法

1.1標本來源

選擇上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院作為監(jiān)測哨點，收集2010年6月—2013年12月1 627例成人急性胃腸炎患者的基本臨床資料及糞便標本，剔除資料不全及不合格標本，共檢測糞便標本1 554份。所有病例均符合以下標準：①年齡≥18歲；②24 h內(nèi)經(jīng)歷嘔吐與腹瀉(稀便或水樣便≥3次)，以急性胃腸炎為主訴就診；③糞便中不含黏液或血液。每例患者只采集1份標本，標本采集覆蓋全年各月。采用配額抽樣方法，每周平均采集5～20份，所有標本儲存于-80 ℃冰箱，每半年統(tǒng)一檢測。排除標準：癥狀持續(xù)2周以上、終末期疾病、重度精神障礙，以及公認的、非感染性的腹瀉或嘔吐(包括克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、囊性纖維化、乳糜瀉、酒精過量、妊娠嘔吐等)。

1.2標本處理

采集糞便標本后，立即用標本處理液﹝磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)或生理鹽水﹞制備成10%的混懸液，震蕩3次，每次10 s，然后靜置10 min，8 000 r/min離心5 min，吸取上清液進行實驗或置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3核酸提取

取200～400 μL處理好的糞便標本上清液，提取核酸后適當分裝，在-80 ℃冰箱內(nèi)至少保存1份備份核酸，便于后續(xù)研究和抽樣檢測。核酸提取方法使用QIAamp?Viral RNA Mini Kit或Geneaid Biotech病毒核酸提取試劑盒，操作方法詳見說明書。

1.4輪狀病毒檢測

A組輪狀病毒采用ProSpecTTMRotavirus Kit(Oxoid公司)試劑盒，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進行抗原檢測，所有輪狀病毒陽性標本用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)進行G、P分型。B組和C組輪狀病毒及其他病毒(包括諾如病毒、札幌病毒、星狀病毒、腺病毒)采用多重PCR進行核酸檢測。B組和C組輪狀病毒的引物序列見表1。

表1B組和C組輪狀病毒引物序列

Tab.1Primers of group B and C rotaviruses

RotavirusPrimerPolaritySequence(5'-3')Productsize(bp)GroupBB5-2+GGCAATAAAATGGCTTCATTGC814B5-3-GGGTTTTTACAGCTTCGGCTGroupCNG8S1+ATTATGCTCAGACTATCGCCAC352NG8S2-GTTTCTGTACTAGCTGGTGAAC

1.5統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1病原學檢測

2.1.1病原學檢測結(jié)果2010年6月—2013年12月共收集1 554例成人急性胃腸炎患者糞便標本。患者年齡18～93歲，平均(46.19±15.59)歲；男691例、女863例。共檢出輪狀病毒陽性標本200份，檢出率為12.87%(其中單獨輪狀病毒感染189例，輪狀病毒混合其他病毒感染11例)。A組輪狀病毒陽性171份，檢出率為11.00%；B/C組輪狀病毒陽性29份，檢出率為1.87%。

在單獨輪狀病毒感染中，A組輪狀病毒檢出163份，檢出構(gòu)成比為95.32%(163/171)；B/C組輪狀病毒檢出26份，檢出構(gòu)成比為89.66%(26/29)。在輪狀病毒混合感染中，A組輪狀病毒檢出8份，占72.73%(8/11)；B/C組輪狀病毒檢出3份，占27.27%(3/11)(圖1)。

圖1輪狀病毒檢出率

Fig.1Detection rate of rotavirus

2.1.2輪狀病毒陽性組與陰性組患者一般情況比較輪狀病毒陽性組患者平均年齡(49.83±14.37)歲，大于陰性組的(45.58±15.74)歲(P<0.01)。性別構(gòu)成方面，兩組無顯著差異(表2)。

表2輪狀病毒陽性組與陰性組患者的一般情況及臨床癥狀比較

Tab.2Comparison of rotavirus-positive and negative groups

ParameterRotavirus-positiveRotavirus-negativePvalueTotal(n)2001354Age(year)49.83±14.3745.58±15.740.002Male/female90/110601/7530.871Watery diarrhea(n)19012080.011Vomitting(n)572860.019Fever(n)191130.756

2.1.3不同年齡組的輪狀病毒檢測結(jié)果將患者按年齡分為4組：18～39歲組、40～59歲組、60～79歲組、≥80歲組。18～39歲組的輪狀病毒檢出率為9.15%，40～59歲組為15.58%，60～79歲組為15.16%，≥80歲組為18.57%。統(tǒng)計學分析顯示，18～39歲組的輪狀病毒檢出率低于其他3組，有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)；其他3組之間差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

表3不同年齡組的輪狀病毒檢測結(jié)果

Tab.3Detection rate of rotavirus in groups with different ages

Age(year)Rotavirus-positiveRotavirus-negativeDetectionrate(%)Total200135412.8718-39616069.1540-597942815.58*60-794726315.16*≥80135718.57**

*P<0.05,**P<0.01 compared with 18-39 years group.

2.1.4不同季度的輪狀病毒檢出率在連續(xù)3年半的監(jiān)測中，輪狀病毒檢出率高于平均檢出率(12.87%)的季度是2010年第4季度(32.54%)、2011年第1季度(18.88%)、2011年第4季度(16.67%)、2012年第1季度(13.11%)、2013年第1季度(12.90%)、2013年第4季度(28.97%)(圖2)。

圖2不同季度的輪狀病毒檢出率

Fig.2Detection rate of rotavirus in different seasons

2.2臨床癥狀

統(tǒng)計腹瀉、嘔吐、發(fā)熱3種主要臨床癥狀。輪狀病毒陽性患者中，95.00%(190/200)有水樣瀉，28.50%(57/200)有嘔吐癥狀，9.50%(19/200)出現(xiàn)發(fā)熱。輪狀病毒陰性患者中，89.22%(1 208/1 354)有水樣瀉，21.12%(286/1 354)有嘔吐癥狀，8.35%(113/1 354)出現(xiàn)發(fā)熱。輪狀病毒陽性組的水樣瀉和嘔吐發(fā)生率較陰性組高(P<0.05)；兩組發(fā)熱的發(fā)生率無顯著差異(P>0.05)(表2)。

2.3基因分型

2.3.1基因分型結(jié)果G基因型：共檢出A組輪狀病毒171例，其中51例為G9亞型，占29.82%；43例為G1亞型，占25.15%；27例為G3亞型，占15.79%；26例為G2亞型，占15.20%；15例為混合型，占8.77%；9例未明確基因型，占5.26%。P基因型：共檢出A組輪狀病毒171例，其中132例為P[8]亞型，占77.19%；29例為P[4]亞型，占16.96%；5例為混合型，占2.92%；5例未明確基因型，占2.92%。GP組合：在GP組合中，最多見的依次是G9P[8](44，25.73%)、G1P[8](39，22.81%)、G3P[8](26，15.20%)、G2P[4](24，14.04%)。G9P[4]、G1P[4]、G2P[8]、G3P[4]較為少見，分別占3.51%、1.75%、1.17%、0.58%。

2.3.2基因遺傳樹分析分子進化樹分析用MEGA 5.0構(gòu)建，其中構(gòu)樹算法采取鄰接法(neighbor-joining，NJ)，Bootstrap值標注在每個基因型別分支的交叉點(重復1 000次)。底部數(shù)值代表各序列間的進化距離。代表G9株的SPH0127、SPH0144、 SPH1971和SPH2662(GenBank 登記號為 KC200153～KC200156)根據(jù)進化系統(tǒng)分為兩組，一組包括SPH0127和SPH2662，另一組包括SPH0144和SPH1971(圖3)。

圖3基因進化樹

Fig.3Phylogenetic tree

3討論

急性胃腸炎是一種常見腸道傳染病，是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)關(guān)注的一個非常重要的公共衛(wèi)生問題[10]。病毒是引起急性胃腸炎的最常見病原體，輪狀病毒胃腸炎是欠發(fā)達國家和發(fā)展中國家嬰幼兒死亡的主要原因之一[11]。輪狀病毒感染在成人中雖較少見，但仍可能對國民健康造成損害[12-13]。

本研究選取2010—2013年上海長寧地區(qū)以急性胃腸炎為主要癥狀的成人患者，全面系統(tǒng)地調(diào)查了1 554例患者中輪狀病毒感染的流行病學及分子特征。結(jié)果顯示，輪狀病毒(包括單獨及混合感染)檢出率為12.87%，其中A組輪狀病毒檢出率為11.00%，B/C組輪狀病毒檢出率為1.87%，高于王遠虹等[14]、陳錦生等[15]的報道(8.1%、7.7%)，但遠低于泰國的檢出率(27%)[16]，與日本的監(jiān)測水平(14%)相當[17]。各地區(qū)檢測率變化較大的原因有待進一步研究。

不同年齡組患者的輪狀病毒檢測結(jié)果顯示，18～39歲組檢出率低，≥40歲以上組檢出率相對較高，可能與青壯年人群機體免疫力較強有關(guān)；在≥40歲的中老年人群中，≥80歲的高齡老人輪狀病毒檢出率最高，但無統(tǒng)計學差異，推測與高齡患者樣本量較少有關(guān)，今后需擴大樣本繼續(xù)研究。不同性別人群中，輪狀病毒檢出率無差異。在連續(xù)三年半的監(jiān)測中，高于平均檢出率的季度均是每年第1和第4季度，提示上海長寧地區(qū)成人輪狀病毒性胃腸炎以冬春季多見。

既往研究顯示，在可感染人類的輪狀病毒基因型中，G1、G2、G3、G4及G9型最常見[18]。世界范圍內(nèi)常見的GP組合有G1P[4]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8][19]，本研究中最多見的GP組合是G9P[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，輪狀病毒G9亞型在成人中占明顯優(yōu)勢。在所有輪狀病毒陽性病例中，超過1/4為G9亞型。G9亞型由美國于19世紀80年代早期首次發(fā)現(xiàn)，期間消失了10余年，直到19世紀90年代中期才又出現(xiàn)。在中國G9株于1994年出現(xiàn)[20]，其后偶發(fā)。本研究中，根據(jù)進化系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系G9株可分為兩組，一組包括SPH0127和SPH2662，屬于子代3系，與北京[21]和武漢[22]的病毒株同源性較大；另一組包括SPH0144和SPH1971，源于日本株99-TK2091VP7。此外，這4株輪狀病毒的核苷酸序列與各自參考株的同源性達95.1%～99.1%。本研究結(jié)果提示，上海長寧地區(qū)有2種不同子系的G9株，這可能是病毒傳播過程中存在VP7區(qū)基因變異。

盡管中國大部分地區(qū)10余年來存在低頻率G9亞型感染的發(fā)生，但G9株在監(jiān)測哨點醫(yī)院作為輪狀病毒優(yōu)勢亞型之一的原因目前仍不清楚[23-26]。由于輪狀病毒的自然感染不會產(chǎn)生終身免疫，是否感染及感染嚴重與否依賴宿主自身的免疫狀態(tài)。在某些環(huán)境中，無癥狀的成人感染者可作為潛在感染源導致疾病流行或暴發(fā)，且成人感染會引起一定程度的基因變異，尤其是病毒在傳播過程中存在VP7區(qū)基因變異，從而降低了基于VP7區(qū)基因研制的多價輪狀病毒疫苗的免疫效果，限制了此種疫苗在兒童中的使用。因此，在疫苗研究中需考慮到G9亞型在不同地區(qū)的流行狀態(tài)，包括兒童及成人。

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Detection of rotavirus in adult acute gastroenteritis in Changning District of Shanghai, 2010-2013

XU Zhongqing1,*, SHEN Silan1,*, ZHU Shaoqin2, ZHANG Wanju2, HU Yunwen2, QIAN Fangxing1

1. Shanghai Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200336, China; 2. Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China

Abstract:In order to study the molecular characteristics of rotavirus infection in adults with acute gastroenteritis in Shanghai, 2010-2013, the stool specimens collected in the period of June 2010 to December 2013 from 1 554 adult patients with acute gastroenteritis in Changning District were subjected to enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR) for rotavirus detection. The results showed that the average age of all patients was (46.19±15.59) years old. Among them, 691 were male and 863 were female. Rotavirus was detected in 200 cases, with a detection rate of 12.87%. The detection rate of rotavirus was 9.15% in the patients aged 18-39, 15.58% in those aged 40-59, 15.16% in those aged 60-79, and 18.57% in those aged ≥80. The G9 subtype (29.82%) and P8 subtype (77.19%) were the most common genotypes in group A rotavirus, and G9P[8] was the most common GP combination. The results suggest that rotavirus infection in adults with acute gastroenteritis is more popular in middle aged and elderly people.

Key words:Diarrhea; Genotype; Rotavirus; Acute gastroenteritis

基金項目：“十二五”國家科技重大專項(2012ZX10004-211)

通信作者：錢方興

Corresponding author. QIAN Fangxing, E-mail: qianfangxing@aliyun.com

(收稿日期：2016-01-04)

·論著·