呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性疾病小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

賈然，陸路，梁小珍，孫志武，譚令兵，徐夢(mèng)華，蘇犁云，徐錦

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，上海 201102； 2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 3. 中國科學(xué)院上海巴斯德研究所，上海 200031

·論著·

呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性疾病小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

賈然1，陸路2，梁小珍3，孫志武2，譚令兵3，徐夢(mèng)華1，蘇犁云1，徐錦1

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，上海 201102； 2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 3. 中國科學(xué)院上海巴斯德研究所，上海 200031

摘要：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是導(dǎo)致嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染的最重要病原體，但該病毒的滅活疫苗可引起RSV疫苗增強(qiáng)性疾病(RSV vaccine-enhanced disease，RVED)，因此至今仍未研制出安全、有效的疫苗。RVED的發(fā)生機(jī)制目前仍不清楚。使用能有效模擬RVED的動(dòng)物模型是探索RVED發(fā)生機(jī)制的主要手段，而本研究的目的就是建立能穩(wěn)定模擬RVED表現(xiàn)的小鼠模型。將BALB/c小鼠分成3組，即甲醛滅活RSV疫苗接種組(FV組)、活RSV接種組(VV組)和對(duì)照組(BV組)，并模擬自然感染對(duì)其攻毒。通過小鼠體重監(jiān)測(cè)、肺組織蘇木精-伊紅染色、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、流式細(xì)胞術(shù)等，觀察FV組小鼠感染RSV后的病毒載量、肺部炎癥和T細(xì)胞免疫狀態(tài)。結(jié)果顯示，與VV組和BV組相比，F(xiàn)V組小鼠RSV攻毒后的體重占初始體重百分比顯著降低，肺部炎癥最明顯，且僅FV組出現(xiàn)支氣管和毛細(xì)血管周圍有大量淋巴細(xì)胞浸潤及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。熒光定量PCR顯示，F(xiàn)V組小鼠的肺部RSV載量最低。流式細(xì)胞術(shù)顯示，攻毒4 d后FV組CD4+ T細(xì)胞數(shù)與其他兩組相比顯著增加，且CD4+ T細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)及IL-4/γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)比值顯著高于其他兩組，而CD8+T細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和IFN-γ低于VV組。結(jié)果提示，RVED小鼠呈現(xiàn)出Th2優(yōu)勢(shì)型免疫應(yīng)答及CD8+ T細(xì)胞功能不足，模型初步建立成功，為RVED發(fā)生機(jī)制的探索和RSV疫苗的研發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：呼吸道合胞病毒；呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性疾??；Th2優(yōu)勢(shì)型免疫應(yīng)答

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬于副黏病毒科肺病毒屬，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染的最重要病原體，每年由RSV感染導(dǎo)致的5歲以下嬰幼兒死亡病例達(dá)20萬例[1]。然而到目前為止，仍沒有安全、有效的疫苗被批準(zhǔn)用于嬰幼兒RSV感染的預(yù)防。20世紀(jì)60年代，人們首次在嬰幼兒中開展了甲醛滅活RSV疫苗(formalin-inactivated RSV vaccine，F(xiàn)IRSV)的臨床試驗(yàn)，然而80%的受試者在自然感染RSV后出現(xiàn)了比初次感染時(shí)更嚴(yán)重的肺炎，甚至有兩名受試兒童死亡，且死者肺部病理切片顯示其肺部毛細(xì)血管及支氣管周圍有大量淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。因此，該疫苗的研制很快宣告失敗[2-3]。這種由于接種滅活RSV疫苗而導(dǎo)致的病情比未接種疫苗者更嚴(yán)重的疾病稱為呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性疾病(RSV vaccine-enhanced disease，RVED)。

RVED的發(fā)生嚴(yán)重阻礙了RSV疫苗的研制，但其發(fā)生機(jī)制目前仍不清楚。早期對(duì)RVED機(jī)制的研究主要集中在體液免疫上，認(rèn)為在FIRSV制作過程中抗原表位被甲醛破壞，因而不能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的特異性中和抗體。但后來研究發(fā)現(xiàn)，這種由于接種滅活疫苗而導(dǎo)致的疫苗增強(qiáng)性疾病，在同屬于副黏病毒科的麻疹病毒和偏肺病毒中也存在，而在流感病毒和副流感病毒中不存在[4]，且RSV G蛋白疫苗也能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生類似RVED的表現(xiàn)[5]，表明甲醛并不是導(dǎo)致RVED發(fā)生的關(guān)鍵所在。因此，部分學(xué)者轉(zhuǎn)而研究RVED形成的細(xì)胞免疫機(jī)制，發(fā)現(xiàn)RVED小鼠體內(nèi)的Th2型細(xì)胞因子﹝白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)、IL-5等﹞分泌明顯升高，而Th1型細(xì)胞因子﹝γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)等﹞則相對(duì)下降，即RVED小鼠體內(nèi)存在一種特殊的Th2優(yōu)勢(shì)型免疫應(yīng)答。研究者們認(rèn)為這種異常T細(xì)胞應(yīng)答所導(dǎo)致的細(xì)胞因子風(fēng)暴與RVED小鼠感染后的免疫病理密切相關(guān)。但滅活的RSV疫苗如何導(dǎo)致異常T細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)生，目前還不清楚，這也是目前RVED發(fā)生機(jī)制研究領(lǐng)域中最需要回答的關(guān)鍵問題。

使用能有效模擬RVED表現(xiàn)的動(dòng)物模型是探索RVED發(fā)生機(jī)制的主要手段，也是疫苗研發(fā)中的重要環(huán)節(jié)。目前，用于構(gòu)建RVED動(dòng)物模型的疫苗主要有滅活疫苗(如紫外線滅活疫苗和FIRSV[6])、亞單位疫苗(如RSV G蛋白疫苗[5])、重組疫苗(如表達(dá)RSV G蛋白的牛痘病毒疫苗[7])等。不同RSV疫苗導(dǎo)致RVED表現(xiàn)有所不同。例如，傳統(tǒng)FIRSV可導(dǎo)致小鼠感染后出現(xiàn)體重下降、重度肺炎、肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤等表現(xiàn)；而RSV G蛋白疫苗導(dǎo)致的RVED小鼠體重下降程度較輕，主要表現(xiàn)為肺部炎癥加重[5]；RSV F蛋白疫苗可導(dǎo)致小鼠體重下降，但不會(huì)出現(xiàn)肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤[8]。不同的RSV疫苗通過何種機(jī)制誘導(dǎo)不同表現(xiàn)的RVED目前還不清楚。因此，構(gòu)建RVED動(dòng)物模型時(shí)，需根據(jù)研究目的來選擇合適的RSV疫苗。本研究旨在構(gòu)建有典型RVED表現(xiàn)的小鼠模型，使用傳統(tǒng)的FIRSV接種小鼠，并對(duì)其感染RSV后的肺部炎癥、T細(xì)胞免疫狀態(tài)、肺部RSV載量等進(jìn)行檢測(cè)。

1材料與方法

1.1材料

RSV A2病毒株由復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室姜世勃教授實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增保存。DMEM培養(yǎng)液和RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，鋁佐劑購自美國Thermo Scientific公司，CD8、CD4、IL-4、IFN-γ、IL-17和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)單克隆熒光標(biāo)記抗體購自美國eBioscience公司，F(xiàn)c block、高爾基復(fù)合體阻斷劑和細(xì)胞內(nèi)因子流式染色試劑盒購自美國BD公司，鼠抗RSV F蛋白單克隆抗體購自德國Leica公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記兔抗鼠免疫球蛋白多克隆抗體購自丹麥Dako公司，HRP顯色底物4-氯-1-萘酚(4-chloro-1-naphthol，4CN)購自美國Bio-Rad公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，淋巴細(xì)胞刺激劑購自美國Biolegend公司，TRIzol提取劑購自美國Invitrogen公司，Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒和Premix Ex TaqTMReal-time RCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.2方法

1.2.1RSV培養(yǎng)及滴度檢測(cè)本研究使用Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)RSV。用滾瓶培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿瓶壁80%～90%時(shí)，棄上清液，用無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗細(xì)胞1次，加入600 μL RSV液和40 mL含2%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)液，吸附3 h后補(bǔ)加100 mL含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。觀察并記錄合胞體形成情況，4～5 d后待合胞體全部脫落，將病毒液凍融3次，2 000 r/min離心10 min，收集上清液即為病毒液。將病毒液分裝，于-80 ℃保存。

RSV毒力檢測(cè)采用免疫酶組織化學(xué)法。將Hep-2細(xì)胞接種入24孔板，待其長滿孔底90%時(shí)，將50 μL待測(cè)RSV液加入450 μL含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液中配成10-1倍病毒稀釋液，依次稀釋，配制10-2～10-6倍病毒稀釋液，將10-2～10-6倍共5個(gè)密度的病毒稀釋液按200 μL/孔加入24孔板中，每個(gè)密度做一個(gè)復(fù)孔。放入37 ℃培養(yǎng)箱吸附3 h，期間每隔30 min輕輕搖動(dòng)一次，棄去病毒液，每孔加入500 μL含0.2%低溫瓊脂的DMEM培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。4～5 d后待合胞體形成完全時(shí)，棄瓊脂，加入甲醛室溫固定5 h，用含1%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS封閉1 h，PBS洗2次，按1∶250比例加入鼠抗RSV F蛋白單克隆抗體，4 ℃溫育過夜。次日將24孔板用PBS洗2次，按1∶250比例加入HRP標(biāo)記兔抗鼠免疫球蛋白多克隆抗體，4 ℃溫育2 h，PBS洗2次。每孔加入500 μL HRP顯色液(溶液A：4 mL甲醇+12 mg 4CN；溶液B：20 mL PBS+12 μL H2O2。顯色前將溶液A、B混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配)進(jìn)行顯色，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)并計(jì)算病毒毒力。

1.2.2FIRSV制備將RSV液200 mL加入T75培養(yǎng)瓶中，按1∶4 000比例加入50 μL甲醛，搖勻后用封口膜封口，放入37 ℃培養(yǎng)箱中溫育，72 h后取出，50 000g離心1 h，底部白色沉淀即為甲醛滅活的RSV。棄上清液，用8 mL無血清DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀，吹打均勻，逐滴加入800 μL鋁佐劑，邊加邊搖，此時(shí)Al(OH)3終濃度為4 mg/mL，4 ℃震蕩過夜。3 000 r/min離心30 min，棄上清液，用2 mL無血清DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀，分裝并做好標(biāo)記，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，體重(21.1±0.6)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。本研究獲得復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

設(shè)置FIRSV接種組(FV組)、活RSV接種組(VV組)和PBS對(duì)照組(BV組)，每組10只小鼠。FV組處理方案見圖1，采用肌內(nèi)注射方式為小鼠接種FIRSV， 接種兩次，單次疫苗接種量50 μL；VV組小鼠在第1天以50 μL RSV液經(jīng)鼻感染小鼠；而BV組小鼠在第1天以50 μL無菌PBS滴鼻。第28天FV組、VV組與BV組以滴度為106pfu的RSV液經(jīng)鼻感染小鼠(攻毒)。

圖1RVED小鼠模型的FIRSV接種及攻毒方案

Fig.1Vaccination and challenge schedules for RVED murine model

1.2.4模型評(píng)價(jià)體重記錄：攻毒后當(dāng)天起每天定時(shí)為每只小鼠稱重，并觀察其生活習(xí)性及飲食情況。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠免疫應(yīng)答狀態(tài)：攻毒后第4天處死小鼠，無菌取脾，剪碎，加入1 mL含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，用200目尼龍網(wǎng)研磨過濾，2 000 r/min離心；用預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液重懸，冰上放置3 min，2 000 r/min離心，棄上清液；用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并將細(xì)胞密度調(diào)整到2×106/mL；在每1 mL細(xì)胞懸液中加入2 μL淋巴細(xì)胞刺激劑，37 ℃培養(yǎng)箱放置1 h，然后每6 mL細(xì)胞懸液中加入4 μL高爾基復(fù)合體阻斷劑，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置2 h，2 000 r/min離心，PBS洗2次；加入200倍稀釋的Fc block，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入標(biāo)記好的96孔板中，冰上放置30 min，離心， PBS洗2次；將熒光標(biāo)記的抗CD4、CD8單克隆抗體加入Staining Buffer中，混勻后加入相應(yīng)孔中，避光4 ℃溫育20 min， PBS洗2次。按BD公司細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，染色結(jié)束后每孔用100 μL 4%多聚甲醛將細(xì)胞重懸，并轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

定量RT-PCR檢測(cè)肺部RSV RNA含量：攻毒后第4天無菌取肺，稱重并研磨，用TRIzol法抽提肺部總RNA，根據(jù)每只小鼠肺部重量按比例重懸總RNA。反轉(zhuǎn)錄使用隨機(jī)引物，程序?yàn)?7 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s。熒光定量PCR擴(kuò)增條帶為RSV F蛋白，正向引物序列為CAARTCAAYATTGAG-ATAGAATCTAGAA，反向引物序列為GCTAT-ACAYARTATTATCATCCCACA，探針序列為FAM-C T C C A G A A T A Y A G G C A T G A T T C T C C-BHQ。熒光定量PCR程序?yàn)椋?5 ℃15 min預(yù)變性；95 ℃10 s→60 ℃1 min(熒光檢測(cè))，45個(gè)循環(huán)。

肺部組織病理學(xué)檢查：攻毒后第4天無菌取肺，于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。光鏡下觀察并記錄各組肺部病理學(xué)改變，400×高倍視野下計(jì)數(shù)支氣管和毛細(xì)血管周圍炎癥細(xì)胞層數(shù)及是否有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1小鼠攻毒后的體重變化

FV組、VV組和BV組的小鼠體重占初始體重的百分比：攻毒后第1天分別為(97.40±2.32)%、(99.06±1.09)%和(102.56±2.63)%，第2天分別為(95.68±1.98)%、(98.64±2.73)%和(102.32±0.34)%，第3天分別為(97.84±2.61)%、(100.73±2.27)%和(102.33±0.30)%。單因素方差分析顯示，F(xiàn)V組、VV組和BV組小鼠在攻毒后第1、2、3天的體重占初始體重的百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分別為15.15、29.76和15.57，均P<0.000 1)。攻毒后第1和第2天，F(xiàn)V組小鼠體重百分比均低于VV組(P<0.05)和BV組(P<0.001)。第3天，F(xiàn)V組小鼠體重雖稍有回升，但仍明顯低于VV組(P<0.05)和BV組(P<0.001)。VV組在攻毒后第1和第2天的體重百分比均明顯低于BV組(P<0.05)，但第3天VV組與BV組小鼠的體重百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

2.2肺部病理結(jié)果

如圖3所示，F(xiàn)V組小鼠在攻毒后第4天肺部即可見明顯炎癥，支氣管和毛細(xì)血管周圍出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤，支氣管腔內(nèi)有大量混雜的中性粒細(xì)胞的炎性分泌物，炎癥區(qū)可見明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。而VV組和BV組炎癥程度均輕于FV組，支氣管和毛細(xì)血管周圍可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，未見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。

如圖4所示，高倍鏡下計(jì)數(shù)各組小鼠支氣管和毛細(xì)血管周圍淋巴細(xì)胞平均層數(shù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)V組、VV組和BV組小鼠毛細(xì)血管及支氣管周圍淋巴細(xì)胞平均層數(shù)分別為(25.8±8.37)、(6.00±2.38)和(8.25±3.52)層。單因素方差分析顯示，3組小鼠的淋巴細(xì)胞層數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.34，P=0.000 7)。其中FV組淋巴細(xì)胞層數(shù)顯著高于VV組和BV組(均P<0.05)，而BV組與VV組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A: Day 1 after challenge. B: Day 2 after challenge. C: Day 3 after challenge.

圖2FV組、VV組和BV組小鼠在攻毒后3 d內(nèi)的體重百分比

Fig.2The bodyweight changes of mice from groups FV, VV and BV within 3 d after challenge

HE staining of lung tissues of mice collected 4 d after challenge from FV group (A), VV group (C), BV group (E) at an original magnification of 100×, and 400× magnification of the selected areas was shown in B, D and F. Eosinophils dispersed in the inflammatory area of panel B are indicated by arrow.

圖3FV組、VV組和BV組小鼠在攻毒后第4天的肺組織病理

Fig.3Pulmonary pathology of mice from groups FV, VV and BV on day 4 after challenge

圖4FV組、VV組和BV組小鼠肺支氣管周圍和血管周圍淋巴細(xì)胞層數(shù)

Fig.4Average layers of perivascular and peribronchial lymphocytes in lungs of mice from groups FV, VV and BV

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

圖5所示為攻毒后第4天通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的小鼠T細(xì)胞免疫狀況。單因素方差分析顯示，3組小鼠的CD4+T細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.86，P=0.005 4)。其中FV組CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著高于VV組和BV組(均P<0.05)，而BV組與VV組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組之間CD8+T細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.02，P=0.396 1)。

方差分析顯示，3組小鼠CD4+T細(xì)胞分泌的IL-4差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.47，P=0.010 4)。其中FV組CD4+T細(xì)胞分泌的IL-4顯著高于VV組和BV組(均P<0.05)；但3組之間CD4+T細(xì)胞分泌的IFN-γ和IL-17差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分別為0.51和0.20，均P>0.05)。

A: The percentage of CD4+T cells and CD8+T cells in splenocytes. B: The secretions of IL-4, IFN-γ and IL-17 in CD4+T cells measured by intracellular cytokine staining. C: The IL-4 to IFN-γ ratio in CD4+T cells according to the data from panel B. D: The secretions of TNF-α, IFN-γ and granzyme B in CD8+T cells.

圖5FV組、VV組和BV組小鼠T細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)

Fig.5The immune response of T lymphocytes in mice from groups FV, VV and BV

單因素方差分析顯示，3組之間小鼠CD4+T細(xì)胞中IL-4/IFN-γ比值有顯著性差異(F=20.95，P=0.000 3)。其中FV組IL-4/IFN-γ比值顯著高于VV組(P<0.05)和BV組(P<0.001)，而BV組與VV組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

方差分析顯示，3組之間小鼠CD8+T細(xì)胞分泌的TNF-α有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=8.52，P=0.013 3)。其中FV組和BV組的TNF-α分泌均顯著低于VV組(均P<0.05)，而FV組與BV組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，3組之間小鼠IFN-γ分泌有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=11.59，P=0.008 7)，其中FV組和BV組IFN-γ分泌顯著低于VV組(均P<0.05)，而FV組與BV組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組小鼠CD8+T細(xì)胞顆粒酶B(granzyme B)分泌水平均較低，且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.29，P=0.757 7)。

2.4小鼠肺RSV含量檢測(cè)

攻毒后第4天采用定量RT-PCR檢測(cè)小鼠肺部RSV RNA含量，3組之間小鼠肺部RSV RNA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=84.79，P=0.007 3)。其中FV組小鼠RSV含量顯著低于VV組和BV組(均P<0.05)，且BV組RSV含量顯著高于VV組(P<0.001)(圖6)。

圖6FV組、VV組和BV組小鼠肺部RSV RNA含量

Fig.6RSV RNA loads in lungs of mice from groups FV, VV and BV

3討論

RVED的發(fā)生嚴(yán)重阻礙了RSV疫苗的研制，也導(dǎo)致RSV感染的預(yù)防工作在嬰幼兒中難以開展。因此，重現(xiàn)RVED表現(xiàn)并探索其發(fā)生機(jī)制對(duì)RSV疫苗的研制具有重要意義。本研究中，與其他兩組相比，F(xiàn)V組小鼠感染RSV后體重下降最明顯，且肺部支氣管和毛細(xì)血管周圍有大量淋巴細(xì)胞浸潤，炎癥細(xì)胞層數(shù)顯著多于另外兩組，表明接種FIRSV的小鼠在感染RSV后，其全身病情和肺部炎癥均比未免疫者更嚴(yán)重；且FV組小鼠的一個(gè)獨(dú)特表現(xiàn)是，肺部有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。接種FIRSV后不幸死于RSV感染的兩名兒童肺部也有類似病理表現(xiàn)[3]，人類RVED的主要病理表現(xiàn)在小鼠體內(nèi)得到了驗(yàn)證，表明本研究所構(gòu)建的RVED小鼠模型能較好地模擬人類RVED的表現(xiàn)。

Th0細(xì)胞可在不同細(xì)胞因子和抗原的刺激下分化為Th1、Th2、Th17等。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ等，Th17細(xì)胞主要分泌IL-17，Th2細(xì)胞則主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等。其中IL-5是重要的嗜酸性粒細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，可影響骨髓內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞的分化；IL-4可通過JAK/STAT3途徑誘導(dǎo)呼吸道重塑，促進(jìn)肺部炎癥形成，還可抑制Th0向Th1和Th17細(xì)胞分化[9]。本研究中，與其他兩組相比，F(xiàn)V組攻毒后小鼠CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著升高，且CD4+T細(xì)胞分泌的IL-4和IL-4/IFN-γ比值顯著高于VV組和BV組，表現(xiàn)出明顯的Th2優(yōu)勢(shì)型免疫應(yīng)答，與其他研究認(rèn)為RVED小鼠存在Th2優(yōu)勢(shì)型免疫應(yīng)答的特點(diǎn)一致[4,6]。本研究顯示，CD4+T細(xì)胞中IFN-γ和IL-17無明顯差異，進(jìn)一步表明RVED小鼠的炎癥及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤主要由Th2細(xì)胞介導(dǎo)，而Th1和Th17細(xì)胞可能由于被增強(qiáng)的Th2型應(yīng)答所抑制，在炎癥發(fā)生中并不扮演主要角色。

CD8+T細(xì)胞可特異性殺傷靶細(xì)胞，稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞或殺傷性T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞可通過穿孔素、顆粒酶B、TNF-α等途徑直接殺傷靶細(xì)胞，也可通過分泌IFN-γ活化巨噬細(xì)胞而間接殺傷靶細(xì)胞。其中殺傷作用最快的是穿孔素和顆粒酶B，TNF-α次之，IFN-γ最慢[10]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)V組和BV組小鼠CD8+T細(xì)胞分泌的TNF-α和IFN-γ比VV組顯著下降，但3組之間顆粒酶B的水平均很低，無顯著差異，表明RVED小鼠CD8+T細(xì)胞存在功能不足，且此殺傷功能的下降是通過TNF-α和IFN-γ途徑實(shí)現(xiàn)的。有研究顯示，RSV攻擊RVED小鼠24 h就有顆粒酶B激活，認(rèn)為顆粒酶B的激活可能發(fā)生在RSV攻毒后的早期[11]；而在RSV攻毒后4 d，即RSV攻毒后期，可能因消耗而檢出水平較低，且無顯著差異。有研究發(fā)現(xiàn)，能充分激活CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的疫苗，可使小鼠表現(xiàn)出Th1優(yōu)勢(shì)型應(yīng)答且嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示CD8+T細(xì)胞在Th2細(xì)胞的分化和激活中有重要抑制作用[12]。因此，導(dǎo)致RVED的效應(yīng)細(xì)胞主要是CD4+T細(xì)胞，不是CD8+T細(xì)胞[4]，且CD8+T細(xì)胞功能不足也促進(jìn)了Th2優(yōu)勢(shì)型免疫應(yīng)答和RVED的發(fā)生。

嗜酸性粒細(xì)胞作為支氣管哮喘等疾病的主要效應(yīng)細(xì)胞，可合成和分泌大量細(xì)胞毒素及促炎性介質(zhì)，包括活性氧簇、嗜酸性粒細(xì)胞陽性蛋白等。當(dāng)嗜酸性粒細(xì)胞活化或壞死時(shí)，這些物質(zhì)被釋放，引起一系列的組織損傷，如上皮細(xì)胞缺損、氣道高反應(yīng)性、組織炎癥等[13]。因此，猜測(cè)RVED小鼠感染后形成的肺部病變可能與嗜酸性粒細(xì)胞有關(guān)。關(guān)于嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥的產(chǎn)生與Th2型免疫應(yīng)答之間的關(guān)系，已有不少研究。Srikiatkhachorn等發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞可抑制嗜酸性粒細(xì)胞的成熟和募集[12]。Castilow等發(fā)現(xiàn)，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13缺失能顯著減少肺部嗜酸性粒細(xì)胞聚集的數(shù)量[14]，表明嗜酸性粒細(xì)胞浸潤是由于FV組小鼠感染RSV后觸發(fā)Th2型細(xì)胞因子過度分泌所致。還有研究顯示，嗜酸性粒細(xì)胞缺失小鼠在感染RSV后，肺部RSV含量顯著升高，因此認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞可促進(jìn)肺部RSV清除[15-16]。本研究中，F(xiàn)V組小鼠在感染RSV后有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，可能是由于明顯增多的Th2型細(xì)胞因子IL-4導(dǎo)致小鼠肺部嗜酸性粒細(xì)胞大量浸潤，而后者不僅是RVED的重要病理表現(xiàn)，也可能是FV組小鼠肺部RSV含量最低的重要原因。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)RVED小鼠中樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)成熟度較低；而在接種疫苗的同時(shí)聯(lián)合使用Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)激動(dòng)劑，則可有效激活DC并產(chǎn)生有保護(hù)性的Th1型免疫應(yīng)答。因此，該研究認(rèn)為滅活疫苗對(duì)DC表面的TLR激活不足，導(dǎo)致DC不能有效發(fā)揮抗原呈遞作用，從而產(chǎn)生了不平衡的T細(xì)胞應(yīng)答[6]。DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，依賴TLR識(shí)別入侵的微生物而激活，從而激發(fā)天然免疫，將抗原呈遞給CD4+和CD8+T細(xì)胞。通過調(diào)控CD4+和CD8+T細(xì)胞的分化、成熟，TLR能以DC為橋梁調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。另外，由于TLR廣泛表達(dá)于T細(xì)胞，有研究發(fā)現(xiàn)其激活可直接促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖、存活及相應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生，并在病原特異性T細(xì)胞免疫記憶形成過程中有重要作用[17]。因此，TLR的激活不足可能是RVED形成的重要原因。其是通過DC間接影響還是通過T細(xì)胞直接影響獲得性T細(xì)胞應(yīng)答，是今后依賴此模型繼續(xù)研究的方向。

目前，國內(nèi)關(guān)于構(gòu)建RVED動(dòng)物模型的研究極少，更缺乏對(duì)其機(jī)制的研究。而國外對(duì)RVED的研究側(cè)重于與免疫相關(guān)的發(fā)病機(jī)制。例如，Delgado等主要通過檢測(cè)RSV特異性IgG的功能來探討RVED形成與DC成熟度之間的關(guān)系，并采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)檢測(cè)肺部淋巴結(jié)IL-4和IFN-γ的分泌[6]；李宏勇用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RVED小鼠肺組織IL-4和IL-5等細(xì)胞因子的mRNA含量[18]。上述方法雖可檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平，但不能區(qū)分CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞，因此不能準(zhǔn)確觀察Th1/Th2偏倚及CD8+T細(xì)胞功能。Johnson等觀察并分析了RVED小鼠外周血和支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)對(duì)肺組織勻漿上清液中的IL-4和IFN-γ總體水平進(jìn)行檢測(cè)，但未做CD8+T細(xì)胞功能檢測(cè)[19]，因此不能全面展現(xiàn)RVED小鼠的不平衡T細(xì)胞應(yīng)答。本研究不僅檢測(cè)了RVED小鼠的攻毒后體重變化、肺部炎癥、肺部RSV載量等，還通過流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞水平對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測(cè)，明確顯示Th2偏倚及CD8+T細(xì)胞功能不足。因此，與其他研究相比，本研究較為全面地呈現(xiàn)了RVED小鼠的肺部病理表現(xiàn)和異常T細(xì)胞免疫應(yīng)答，為后期進(jìn)一步探索其發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了RVED小鼠模型，再現(xiàn)了RVED小鼠的Th2優(yōu)勢(shì)型免疫應(yīng)答及肺部嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥，為RVED發(fā)病機(jī)制研究和RSV疫苗研制提供了重要手段。

參考文獻(xiàn)

[1]Taylor G, Thom M, Capone S, Pierantoni A, Guzman E, Herbert R, Scarselli E, Napolitano F, Giuliani A, Folgori A, Colloca S, Cortese R, Nicosia A, Vitelli A. Efficacy of a virus-vectored vaccine against human and bovine respiratory syncytial virus infections [J/OL]. Sci Transl Med, 2015. http://stm.sciencemag.org/content/7/300/300ra127.full.

[2]Anderson LJ. Respiratory syncytial virus vaccine development [J]. Semin Immunol, 2013, 25(2): 160-171.

[3]Kim HW, Canchola JG, Brandt CD, Pyles G, Chanock RM, Jensen K, Parrott RH. Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine [J]. Am J Epidemiol, 1969, 89(4): 422-434.

[4]Waris ME, Tsou C, Erdman DD, Zaki SR, Anderson LJ. Respiratory synctial virus infection in BALB/c mice previously immunized with formalin-inactivated virus induces enhanced pulmonary inflammatory response with a predominant Th2-like cytokine pattern [J]. J Virol, 1996, 70(5): 2852-2860.

[5]Li C, Zhou X, Zhong Y, Li C, Dong A, He Z, Zhang S, Wang B. A recombinant G protein plus cyclosporine A-based respiratory syncytial virus vaccine elicits humoral and regulatory T cell responses against infection without vaccine-enhanced disease [J]. J Immunol, 2016, 196(4): 1721-1731.

[6]Delgado MF, Coviello S, Monsalvo AC, Melendi GA, Hernandez JZ, Batalle JP, Diaz L, Trento A, Chang HY, Mitzner W, Ravetch J, Melero JA, Irusta PM, Polack FP. Lack of antibody affinity maturation due to poor Toll stimulation led to enhanced RSV disease [J]. Nat Med, 2009, 15(1): 34-41.

[7]Castilow EM, Legge KL, Varga SM. Cutting edge: Eosinophils do not contribute to respiratory syncytial virus vaccine-enhanced disease [J]. J Immunol, 2008, 181(10): 6692-6696.

[8]Castilow EM, Varga SM. Overcoming T cell-mediated immunopathology to achieve safe RSV vaccination [J]. Future Virol, 2008, 3(5): 445-454.

[9]Olson MR, Varga SM. Pulmonary immunity and immunopathology: lessons from respiratory syncytial virus [J]. Expert Rev Vaccines, 2008, 7(8): 1239-1255.

[10]Pinto RA, Arredondo SM, Bono MR, Gaggero AA, Díaz PV. T helper 1/T helper 2 cytokine imbalance in respiratory syncytial virus infection is associated with increased endogenous plasma cortisol [J]. Pediatrics, 2006, 117(5): e878-e886.

[11]Bar-Haim E, Erez N, Malloy AM, Graham BS, Ruckwardt TJ. CD8+TCR transgenic strains expressing public versus private TCR targeting the respiratory syncytial virus KdM282-90epitope demonstrate similar functional profiles [J]. PLoS One, 2014, 9(6): e99249.

[12]Srikiatkhachorn A, Braciale TJ. Virus-specific CD8+T lymphocytes downregulate T helper cell type 2 cytokine secretion and pulmonary eosinophilia during experimental murine respiratory syncytial virus infection [J]. J Exp Med, 1997, 186(3): 421-432.

[13]Sneeboer MM, Fens N, van de Pol MA, Majoor CJ, Meijers JC, Kamphuisen PW, Lutter R, Sterk PJ, Bel EH. Loss of asthma control and activation of coagulation and fibrinolysis [J]. Clin Exp Allergy, 2015, 46(3): 422-427.

[14]Castilow EM, Meyerholz DK, Varga SM. IL-13 is required for eosinophil entry into the lung during respiratory syncytial virus vaccine-enhanced disease [J]. J Immunol, 2008, 180(4): 2376-2384.

[15]Zhou W, Hashimoto K, Moore ML, Elias JA, Zhu Z, Durbin J, Colasurdo G, Rutigliano JA, Chiappetta CL, Goleniewska K, O′Neal JF, Graham BS, Peebles RS Jr. IL-13 is associated with reduced illness and replication in primary respiratory syncytial virus infection in the mouse [J]. Microbes Infect, 2006, 8(14-15): 2880-2889.

[16]Phipps S, Lam CE, Mahalingam S, Newhouse M, Ramirez R, Rosenberg HF, Foster PS, Matthaei KI. Eosinophils contribute to innate antiviral immunity and promote clearance of respiratory syncytial virus [J]. Blood, 2007, 110(5): 1578-1586.

[17]Zuo AJ, Liang DC, Shao H, Born WK, Sun DM. In vivo priming of IL-17+uveitogenic T cells is enhanced by Toll ligand receptor (TLR)2 and TLR4 agonists via gamma delta T cell activation [J]. Mol Immunol, 2012, 50(3): 125-133.

[18]李宏勇．Notch信號(hào)抑制劑和TLR配體聯(lián)合作為佐劑對(duì)呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性免疫病理的調(diào)節(jié)作用[D]．石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2015．

[19]Johnson TR, Rao S, Seder RA, Chen M, Graham BS. TLR9 agonist, but not TLR7/8, functions as an adjuvant to diminish FI-RSV vaccine-enhanced disease, while either agonist used as therapy during primary RSV infection increases disease severity [J]. Vaccine, 2009, 27(23): 3045-3052.

Establishment and analysis of a murine model for respiratory syncytial virus vaccine-enhanced disease

JIA Ran1, LU Lu2, LIANG Xiaozhen3, SUN Zhiwu2, TAN Lingbing3, XU Menghua1, SU Liyun1, XU Jin1

1. Department of Clinical Laboratory, Children’s Hospital of Fudan University, Shanghai 201102, China; 2. Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China; 3. Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China

Abstract:Respiratory syncytial virus (RSV) is the most important pathogen responsible for children’s severe lower respiratory tract infection worldwide. As inactivated RSV vaccine could lead to RSV vaccine-enhanced disease (RVED),no safe RSV vaccine has been permitted in clinical use yet, and the mechanism of RVED is still unclear. The aim of the present study is to establish a murine model that can steadily mimic the performance of RVED. A total of 30 BALB/c mice were divided into three groups and vaccinated with formalin-inactivated RSV (FV group), live RSV (VV group) or sterilized phosphate buffered saline (PBS) (BV group), respectively. Four weeks later, all the mice were challenged with live RSV intranasally. The bodyweight of the tested animals was measured on the day of viral challenge and the following 3 days. T cell immune response, lung RSV load and pulmonary pathology were detected by flow cytometry, quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-qPCR) and lung hematoxylin-eosin (HE) staining respectively. Compared with the VV group and the BV group, the bodyweight of the mice in the FV group showed the largest weight loss after challenge. Severe pneumonia with extensive lymphocytic and eosinophilic infiltration could be seen in the FV group only. Lung RSV load in the FV group was the lowest. The number of CD4+ T cells in the FV group was higher than those in the other two groups, while the number of CD8+ T cells showed no significant difference among the three groups. The secretion of interleukin 4 (IL-4) in CD4+ T cells and IL-4/interferon γ (IFN-γ) ratio in the FV group were much higher than those in the other two groups, while the secretions of tumor necrosis factor α (TNF-α) and IFN-γ in the FV group were much lower than those in the VV group. In conclusion, a murine model of RVED has been established successfully, showing an unbalanced Th2-biased immune response and impaired CD8+ T cell function. The model could be used to help the study of RVED and development of protective and safe RSV vaccines.

Key words:Respiratory syncytial virus; Respiratory syncytial virus vaccine-enhanced disease; Th2-biased immune response

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81273204)

通信作者：徐錦

Corresponding author. XU Jin, E-mail: jinxu_125@163.com

(收稿日期：2016-02-26)