廣西人群中IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G 多態(tài)性的分布特點①

郭　靜　向　陽　彭友帆　韋葉生　藍　艷

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科,百色 533000)

廣西人群中IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G 多態(tài)性的分布特點①

郭靜向陽②彭友帆②韋葉生②藍艷

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科,百色 533000)

[摘要]目的：研究探討IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因多態(tài)性在廣西人群中的分布特點。分析兩位點的基因型及基因頻率在不同種族間的分布差異。方法：采用單堿基延伸法(PCR-SEB)及DNA測序法對283例受試者IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G位點進行多態(tài)性分析。用統(tǒng)計學方法分析其分布頻率及組間差異。結果：rs10975521A/T 存在AA、AT、TT三種基因型，分布頻率分別為12.7%、53.0%、34.3%。其各基因型及等位基因頻率在廣西人群中男女性別之間無顯著差異(P>0.05)。其等位基因頻率與人類基因組計劃公布的歐洲人(P<0.05)、北京漢族人(P<0.05)及日本人群(P<0.01)之間均有顯著差異。rs1929992A/G存在AA、AG、GG三種基因型，分布頻率分別為23.9%、53.7%、13.4%。其各基因型及等位基因頻率在廣西地區(qū)人群中男女之間也無統(tǒng)計醫(yī)學意義(P>0.05)。其基因型與歐洲人(P<0.01)、北京漢族人(P<0.05)和日本人(P<0.01)之間差異有統(tǒng)計學意義。等位基因頻率與歐洲人(P<0.01) 、北京漢族人(P<0.05) 相比差異有統(tǒng)計學意義。結論：IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因多態(tài)性在種族和地區(qū)間存在不同程度的差異。

[關鍵詞]IL-33 ；基因多態(tài)性 ；廣西人群

白細胞介素33(Interleukin-33，IL-33)是白細胞介素1(Interleukin-1，IL-1)家族中的新成員，又稱為IL-1F11，被Schmitz等[1]發(fā)現于2005年。其作用復雜，功能多面，在全身多組織器官中都有所分布。IL-33是一種多功能蛋白，一方面，它參與T淋巴細胞介導的免疫應答，促進肥大細胞產生其他至炎因子，在多種疾病及生理過程中發(fā)揮作用。另一方面，還可以在細胞核內起到轉錄因子的作用[2-5]。研究發(fā)現，IL-33在炎癥、微生物感染、自身免疫性疾病及心血管疾病中都有所參與[6]。近年來，隨著研究的深入與人類基因組掃描的不斷完善， IL-33的基因多態(tài)性對疾病的影響逐漸被重視，我們在人類基因組掃描圖譜所公布的IL-33基因SNP位點數據中，篩選出次要等位基因頻率>10%的兩個SNP位點rs10975521A/T和rs1929992A/G，并研究其在廣西人群中的分布頻率，為深入研究IL-33的基因多態(tài)性在不同種族、地區(qū)間的分布及其在疾病中的影響打下基礎。

1對象與方法

1.1對象研究對象共283例，男72例，女211例。年齡19～65歲 。樣本取自右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院的體檢中心，篩選出日常生活功能良好，無心腦血管疾病，感染性疾病及自身性免疫性疾病，各項體檢指標均無異常且相互無血緣關系的健康體檢者作為研究對象。所有研究對象均來自廣西地區(qū)，采集標本前均已簽署知情同意書。此研究已通過本單位的倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1DNA提取取靜脈血2 ml,加入EDTAN2抗凝。用(亞能生物TM全血DNA快速提取試劑盒)提取DNA，-70℃保存。

1.2.2引物的合成通過primer3在線軟件(http://primer3.ut.ee/)設計引物，由上海天昊生物科技有限公司進行合成。rs10975521A/T上游引物：TTGCATGCCAACAACAAGGAAC，下游引物：CCCCAACACCCAAATCTACACAA，延伸引物：TTTT-TTTTTTTGACAGTTCTGTAATCATATATATAGATATA-GATAA rs1929992A/G，上游引物：TCCCATGGTCATTAGTTTTGGTGA，下游引物：TTGAAGTCATCATCAACTTGGAACCT，延伸引物:TTTTTTTTTTTCCCCCCAAATTTCAA。

1.2.3PCR擴增及基因測序擴增反應體系共20 μl，包含1.0 μl模板DNA,2.0 μl PCR緩沖液,2.0 μl dNTPs,1.0 U TaqDNA聚合酶,以及兩端引物各1.0 μl。剩余體積用滅菌雙蒸水補足20 μl。使用熱啟動Taq 酶(Qiagen 公司)進行多重PCR 所獲得的PCR產物，通過蝦堿酶(SAP)(Promega公司)和外切酶I (Epicentre公司)進行純化。延伸反應使用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit來進行。延伸產物在ABI3730XL上樣并用GeneMapper4.1分析其基因多態(tài)性。并采用測序法進一步驗證我們的結果。

1.3統(tǒng)計學分析用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包分析數據。各位點基因型及等位基因頻率采用直接計數法，兩組間基因型及等位基因的頻率分布差異采用χ2檢驗，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。遺傳平衡分析用Hardy-Weinberg平衡檢驗。

2結果

2.1IL-33基因位點rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因分型經Hardy-Weinberg平衡檢驗分析，兩位點基因型均達Hardy-Weinberg平衡，結果具有群體代表性。rs10975521A/T與rs1929992A/G兩位點擴增產物分別為124 bp與210 bp。rs10975521A/T存在AA、AT、TT三種基因型。rs1929992A/G存在AA、AG、GG三種基因型?；驕y序證實了我們的檢驗結果(見圖1、2)。

2.2兩位點基因型及等位基因頻率在廣西人群中的分布IL-33基因rs10975521A/T 的三個基因型:AA、AT和TT在男女兩組間分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。rs1929992A/G的三個基因型:AA、AG和GG在男女兩組間分布差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩位點的各等位基因頻率在男女兩組間分布差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)見表1。

2.3兩位點基因型及等位基因頻率在各種族人群間分布經分析，廣西人群rs10975521A/T各等位基因頻率與歐洲人(P<0.05)、北京漢族人(P<0.05)及日本人(P<0.01)相比，均有顯著性差異。與非洲黑人相比無顯著差異(P>0.05)。Hapmap數據庫尚未公布rs10975521A/T位點在各人群中基因型及等位基因頻率數據，四個人群的等位基因頻率數據來自NCBI數據庫。

圖1　IL-33基因rs10975521A/T測序圖Fig.1　Sequencing map of genotype for IL-33 genersrsrs10975521A/T polymorphismNote: Arrow of panels ①-③ showed AA，AT and TT genotypes,respectively.

圖2　IL-33基因rs1929992A/G測序圖Fig.2　Sequencing map of genotype for IL-33 gene rs1929992A/G polymorphismNote: Arrow of panels ①-③ showed AA，AG and GG genotypes,respectively.

廣西人群rs1929992A/G各基因型分布頻率與歐洲人(P<0.01)、日本人(P<0.01)、北京漢族人(P<0.05)相比具有顯著差異。與非洲黑人相比無顯著差異(P>0.05)。其等位基因分布頻率與歐洲人(P<0.01)、北京漢族人(P<0.05)之間差異有統(tǒng)計學意義。與非洲黑人、日本人之間無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、3。

表1廣西人群IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G 基因型和等位基因頻率的比較

Tab.1Distribution of genotype and allele frequencies of IL-33 gene rs10975521A/T and rs1929992A/G in Guangxi population

RSandGendernGenotypefrequencies(%)AA(AA)AT(AG)TT(GG)Allelefrequency(%)A(A)T(G)Rs10975521Male729(12.5)38(52.8)25(34.7)56(38.9)88(61.1)Female21127(12.8)112(53.0)72(34.1)166(39.3)256(60.6)Total28336(12.7)150(53.0)97(34.3)222(39.2)344(60.8)Rs1929992Male7224(33.3)38(52.8)10(13.9)86(59.7)58(40.3)Female21169(32.7)114(54.1)28(13.2)252(59.7)170(40.3)Total28393(23.9)152(53.7)38(13.4)338(59.7)228(40.3)

Note：Genotype and allele frequencies of IL-33 gene showed no significant difference among same group of male and female(P> 0.05).

表2廣西人群rs10975521A/G基因型和等位基因分布頻率與各種族人群間的比較

Tab.2Comparison of frequency of IL-33 gene rs10975521A/G polymorphism among different ethic and regional groups

GroupsnGenotypefrequencies(%)AAATTTAllelefrequency(%)ATGuangxipeople28336(12.7)150(53.0)97(34.3)222(39.2)344(60.8)HapMap-CEU1)120---73(30.3)167(69.7)HapMap-YRI2)118---102(43.1)134(56.9)HapMap-HCB1)120---114(47.6)126(52.4)HapMap-JPT1)120---136(56.7)104(43.3)

Note：Hapmap database is still not released corresponding values，Allele frequency is derived from the NCBI databases；1)Allele frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi crowd;2)Allele frequencies,P>0.05,compared with the Guangxi crowd.

表3廣西人群rs1929992A/G基因型和等位基因分布頻率與各種族人群間的比較

Tab.3Comparison of frequency of IL-33 gene rs1929992A/G polymorphism among different ethic and regional groups

GroupsnGenotypefrequencies(%)AAAGGGAllelefrequency(%)AGGuangxipeople28393(23.9)152(53.7)38(13.4)338(59.7)228(40.3)HapMap-CEU1)12060(50.0)50(41.7)10(8.3)170(70.8)70(29.2)HapMap-YRI2)11842(35.6)56(47.5)19(16.9)140(59.3)94(40.7)HapMap-HCB1)9020(22.2)48(53.3)22(24.4)88(48.9)92(51.1)HapMap-JPT3)8834(38.6)28(31.8)26(29.5)96(54.5)80(45.5)

Note：1)Allele and genotype frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi crowd;2) Allele and genotype frequencies,bothP>0.05,compared with the Guangxi crowd；3)Genotype frequencies,P<0.01,allele,P>0.05.

3討論

IL-33位于人類的第9號染色體上，編碼270個氨基酸。IL-33主要在人體纖維母細胞、內皮細胞、上皮細胞、尤其是在呼吸道及消化道上皮細胞中高表達[1]。在靜止時，IL-33僅限于在細胞核內，發(fā)揮其轉錄因子的作用。而受到炎癥等刺激后，IL-33與其受體ST2結合，可刺激其下游信號分子聚集，并誘導Th2細胞因子，參與炎癥反應和免疫調控。IL-33還是一種“預警因子”，在細胞壞死時，IL-33可從細胞核中釋放，進而在中性粒細胞的作用下刺激多種炎癥因子參與免疫調控[6]。IL-33在多種疾病的病理過程度有所參與，而且IL-33在機體免疫發(fā)揮作用時，具有雙面性。在寄生蟲感染、動脈粥樣硬化、肥胖等疾病中，IL-33是一種保護因子[7，8]。而在過敏性鼻炎，類風濕關節(jié)炎，多發(fā)性硬化以及膿毒血癥中又扮演著風險因子的角色[9-11]。近年來，越來越多的研究者對IL-33產生了濃厚的興趣。有文獻報道，IL-33的血清水平在多種自身免疫性疾病中呈現高表達狀態(tài)，而IL-33的基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化、類風濕關節(jié)炎、炎癥性腸病等也具有相關性[12,13]。

廣西地處中國西南邊界地區(qū)，共有40多個民族長期共居，其地理環(huán)境獨特，與外界往來較少，生活環(huán)境相對封閉。從我們研究的結果可以看出，廣西人群IL-33基因rs10975521A/G 位點的等位基因頻率與歐洲人(P<0.05)、北京漢族人(P<0.05)、日本人(P<0.01)相比都存在著顯著差異。而IL-33基因rs1929992A/G位點的多態(tài)性雖然與非洲黑人和北京漢族人之間差異不大(P均 >0.05)，但是與歐洲人(P均<0.01)、日本人(P<0.05)相比仍表現出較大差異。這也體現了IL-33基因在種族之間所存在的差異性。

基因多態(tài)性的分布特點因地域不同，種族不同，環(huán)境影響和自然選擇而存在著很大差異。我們的研究結果也體現了這一特性?；蚨鄳B(tài)性是一種普遍存在現象，這種突變與人類的進化，環(huán)境的選擇以及病理的誘導都有著密切的聯系，rs10975521C/T、 rs1929992A/G位于IL-33基因的內含子區(qū)，內含子區(qū)的位點的突變有可能會影響基因的轉錄，影響基因的表達調控和功能[14]，從而參與各種病理生理過程。隨著全基因組掃描圖譜的建立，以及在基因組關聯研究技術的幫助下，讓更多的研究者對基因多態(tài)性和疾病的關系也有了全新的認識。我們對廣西人群IL-33基因多態(tài)性進行研究，并分析了其在多種族人群之間的分布差異。不僅為IL-33基因多態(tài)性在人類分布中的研究供了有用基礎資料，更為相關疾病的前瞻性研究打下了分子生物學層面的基礎。

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[收稿2016-01-12修回2016-02-16]

(編輯許四平)

Distribution characteristics of rs10975521A/T and rs1929992A/G polymorphism of IL-33 gene in Guangxi population

GUO Jing, XIANG Yang,PENG You-Fan,WEI Ye-Sheng,LAN Yan.

Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China

[Abstract]Objective:To study and explore the distribution characteristics of rs10975521A/T and rs1929992A/G polymorphism of the IL-33 gene in Chinese Guangxi population.To compare the frequency distribution differences of allele and genotype of two sites among different ethnic.Methods: The polymorphism of rs10975521A/T and rs1929992A/G of IL-33 gene in 283 subjects were analyzed with the methods of Single base extension (PCR-SEB) and DNA sequencing,and the distribution frequency and the differences between groups of that were analyzed statisticaly.Results: Three genotypes of AA，AT and TT were found in rs10975521A/T with the frequency distribution of 12.7%,53.0% and 34.3% respectively and there was no significant difference between sexes of each genotype and allele frequency in the Guangxi population (P>0.05).There were significant differences of the allele frequency of rs10975521A/T in the Guangxi population compared with that in the European (P< 0.05), han Chinese in Bejing (P< 0.05) and Japanese people (P< 0.01).Three genotypes of AA,AG and GG were found in rs1929992A/G with the frequency distribution of 23.9%,53.7% and 13.4% respectively and there was no significant difference between sexes of each genotype and allele frequency in the Guangxi population(P> 0.05),but the differences of genotype frequency of rs1929992A/G was statistically significant compared with that in the European,han Chinese in Bejing and Japanese people (P< 0.05). There were significant differences of the allele frequency between Guangxi population and European (P< 0.01),han Chinese in Bejing(P< 0.05).Conclusion: There are different degrees of discrepancy of rs10975521A/T and rs1929992A/G polymorphism of IL-33 gene among different race and region.

[Key words]IL-33;Gene polymorphism;Guangxi population

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.017

作者簡介：郭靜(1987年-),女,在讀碩士，主要從事系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫機制的研究，E-mail：gjnsdy-1987@163.com。 通訊作者及指導教師：藍艷(1973年-),女，教授，碩士生導師，主要從事系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫機制的研究，E-mail：yylanyan@163.com。

中圖分類號Q347

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0849-04

①本文為國家自然科學基金(81260234；81560552)、廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目(YCSZ2015223)和右江民族醫(yī)學院校級課題(yy2015zd001)。

②右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，百色533000。