FILIP-1L 蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備①

都景芳　頓國(guó)慶　張舒曼　褚留杰　李淑蓮　胡延忠　馬遠(yuǎn)方

(抗體藥物河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，開封475004)

FILIP-1L 蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備①

都景芳頓國(guó)慶張舒曼褚留杰李淑蓮②胡延忠②馬遠(yuǎn)方②

(抗體藥物河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，開封475004)

[摘要]目的：表達(dá)、純化GST-FILIP-1L融合蛋白，制備FILIP-1L多克隆抗體。方法：pGEX-4T3-FILIP-1L重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)GST-FILIP-1L融合蛋白表達(dá)，Glutathion Sepharse 4B純化GST-FILIP-1L融合蛋白。將純化的GST-FILIP-1L融合蛋白免疫新西蘭大耳白兔，制備FILIP-1L多克隆抗體，用ELISA方法檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)，Western blot檢測(cè)多克隆抗體與FILIP-1L蛋白、細(xì)胞轉(zhuǎn)染FILIP-1L蛋白及細(xì)胞FILIP-1L蛋白的結(jié)合能力。結(jié)果：在大腸桿菌中誘導(dǎo)出高表達(dá)的FILIP-1L融合蛋白，經(jīng)Glutathion Sepharse 4B純化后免疫新西蘭大耳白兔，獲得了高效價(jià)的抗FILIP-1L多克隆抗體，親和層析獲得純度較高的多克隆抗體，WB檢測(cè)顯示多克隆抗體能夠與FILIP-1L蛋白、293細(xì)胞轉(zhuǎn)染FILIP-1L蛋白及肝癌細(xì)胞FILIP-1L蛋白結(jié)合。結(jié)論：成功表達(dá)、純化了GST-FILIP-1L融合蛋白，制備了高效價(jià)的抗FILIP-1L多克隆抗體，為研究FILIP-1L蛋白生物學(xué)功能提供了有用的實(shí)驗(yàn)工具。

[關(guān)鍵詞]FILIP-1L；融合蛋白；多克隆抗體

腫瘤細(xì)胞的遷移性與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)[1,2]，腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的重要原因，因此腫瘤侵襲及遷移的機(jī)制研究與臨床腫瘤治療策略的發(fā)展密切相關(guān)。FILIP-1L(Filamin A interacting protein 1-like，F(xiàn)ILIP-1L;previously known as down-regulated in ovarian cancer 1，DOC1)是在卵巢癌細(xì)胞系低表達(dá)蛋白，其功能尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)FILIP-1L與乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的侵襲負(fù)相關(guān)[3]，我們前期研究還發(fā)現(xiàn)FILIP-1L與熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(Heat shock factor 1，Hsf1)的降解有關(guān)[4]，為了進(jìn)一步研究FILIP-1L的生物學(xué)作用，我們構(gòu)建了pGEX-4T3-FILIP-1L表達(dá)載體，應(yīng)用FILIP-1L融合蛋白免疫新西蘭大耳白兔，制備FILIP-1L多克隆抗體，為FILIP-1L生物學(xué)功能的深入研究提供有用工具。

1材料與方法

1.1材料pGEX-4T3、pGEX-4T3-FILIP-1L(288)、pGEX-4T3-FILIP-1L(893)、PcDNA3-FLAG-FILIP-1L(893)及E.coliBL21，本實(shí)驗(yàn)室保存。新西蘭大耳白兔購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。肝癌細(xì)胞系HepG2、smmc-7721、bel-7402、plc/prf/5及肝永生化細(xì)胞changliver購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。Glutathion Sepharse 4B購(gòu)自 GE Healthcare Bio-Sciences AB。L-Gluthion Reduced 為SCIENTIFIC RESEARCH SRECIAL產(chǎn)品。Freund′，s Adjuant Complete及Freund′，s Adjuant Incomplete購(gòu)于Sigma。Active Ester Agrose購(gòu)自Bio-Rad。Protease Inhibitor Cocktail購(gòu)自Sigma。辣根過氧化酶標(biāo)記抗兔IgG 為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1GST-FILIP-1L蛋白誘導(dǎo)表達(dá)分別將pGEX-4T3、pGEX-4T3-FILIP-1L(288)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)菌。挑取單個(gè)菌落接種于1 ml LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)14 h，按照1∶100的體積接種培養(yǎng)于新鮮LB液體培養(yǎng)基中， 37℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)至A600約為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。取200 μl菌液加入5×Loading Buffer 50 μl，沸水浴8 min；另取6 ml菌液， 4 000 r/min，4℃離心10 min。棄上清，加200 μl PBS重懸沉淀，再加入5×Loading Buffer 50 μl，沸水浴8 min。將菌液與細(xì)菌裂解液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，觀察GST-FILIP-1L蛋白表達(dá)。

1.2.2GST-FILIP-1L蛋白溶解性分析如上方法將pGEX-4T3-FILIP-1L質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E.coliBL21， LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，4 000 r/min，4℃離心10 min，PBS洗滌菌體沉淀2次，重懸沉淀，加入溶菌酶，冰上超聲破碎，加1%Triton X-100，冰上放置30 min， 4℃，10 000 r/min，離心10 min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行10%SDS-PAGE蛋白電泳。

1.2.3提取GST-FILIP-1L蛋白如上方法收集菌液，10 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清。沉淀中加入濃度為8 mol/L的尿素溶液20 ml，混合均勻，置冰上超聲30 s，間隔30 s，共6個(gè)循環(huán)。9 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清于透析袋內(nèi)，將透析袋置入2 mol/L尿素溶液中，4℃透析過夜。將透析液更換為1×PBS ， 4℃透析24 h，期間更換PBS液一次。收集透析袋內(nèi)液體， 9 000 r/min，4℃離心20 min，收集上清GST-FILIP-1L蛋白溶液備用。

1.2.4純化GST-FILIP-1L蛋白取Glutathion Sepharse 4B 2 ml加入PBS溶液5 ml，混勻，4 000 r/min，4℃離心5 min，棄上清。重復(fù)上述操作三次，加入1 ml PBS溶液懸浮beads。將Glutathion Sepharse 4B 懸液與上述收集的GST-FILIP-1L蛋白溶液混合，置4℃旋轉(zhuǎn)過夜。加預(yù)冷PBS液10 ml，混懸，洗滌Glutathion Sepharse 4B，4 000 r/min，4℃離心5 min，重復(fù)操作5次。加入Glutathion Reduced緩沖液1 ml， 旋轉(zhuǎn)混合20 min，4℃ 4 000 r/min，離心5 min，將上清收集至新EP管內(nèi)。重復(fù)Glutathion Reduced緩沖液洗脫，共3次。標(biāo)明洗脫液順序，檢測(cè)洗脫液蛋白純度后，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5多克隆抗體制備取新西蘭大耳白兔1只，免疫前耳緣靜脈取血作為陰性血清對(duì)照。將純化的GST-FILIP-1L(288)蛋白與弗氏完全佐劑等體積充分乳化后，于動(dòng)物背部皮下多點(diǎn)注射，每只動(dòng)物的蛋白抗原用量為400 μg。初次免疫后第21天、35天分別以同劑量的GST-FILIP-1L蛋白，加弗氏不完全佐劑乳化后，采用同樣方法加強(qiáng)免疫2次。第二次加強(qiáng)免疫10 d后，耳緣靜脈取血測(cè)定抗血清的效價(jià)?？贵w效價(jià)達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后，自頸總動(dòng)脈插管放血， 收集血液， 37℃培養(yǎng)箱靜置3 h，2 000 r/min離心10 min，取血清于-80℃保存。

1.2.6間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)用抗原稀釋液稀釋GST-FILIP-1L蛋白，使其濃度為1 μg/ml，每孔加入 100 μl蛋白稀釋液包被96孔酶標(biāo)板。以動(dòng)物免疫前血清作為陰性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液稀釋血清(1∶250,1∶500,1∶1 000，1∶2 000,1∶4 000,1∶8 000,1∶16 000～1∶128 000 )，間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.2.7多克隆抗體純化

1.2.7.1飽和硫酸銨純化抗體 用PBS 1∶5倍稀釋免疫動(dòng)物血清，4℃緩慢逐滴加入飽和硫酸銨溶液(體積比1∶1)，4℃磁力攪拌過夜。4℃、10 000 r/min離心20 min， PBS懸浮沉淀。PBS透析4次，每次12 h，收集透析袋內(nèi)抗體溶液。

1.2.7.2去除抗GST抗體取Glutathion Sepharse 4B 1 ml，加預(yù)冷PBS液5 ml， 4 000 r/min，4℃離心5 min，棄上清。PBS懸浮沉淀，重復(fù)上述操作3次。加1 ml PBS液懸浮beads，加入GST蛋白5 mg，4℃旋轉(zhuǎn)孵育2 h， 4 000 r/min，4℃離心5 min。PBS洗5次后，加1 ml PBS混懸。加入上述飽和硫酸銨純化的血清50 ml， 4℃旋轉(zhuǎn)孵育4 h， 離心，收集上清。

1.2.7.3親和層析純化抗體(1)取Active Ester Agrose混懸液1 ml， 4 000 r/min，4℃離心5 min，棄上清。加入預(yù)冷單蒸水1 ml，混懸，4 000 r/min，4℃離心10 min。重復(fù)上述操作5次。(2)取純化的GST-FILIP-1L蛋白5 mg于透析袋內(nèi)，將透析袋置入1 mol/L HEPES溶液中，4℃透析過夜。(3)混合Active Ester Agrose和GST-FILIP-1L蛋白溶液，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。4 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清。(4)依次用PBS溶液10 ml、0.1 mol/L Glycine HCl(pH2.5)5 ml、PBS溶液10 ml洗滌，4 000 r/min，4℃離心10 min。(5)取上述處理的抗血清1 ml，置56℃恒溫水浴鍋內(nèi)30 min，PBS稀釋10倍，加入resin-column混合，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜，4 000 r/min，4℃離心10 min，回收上清，沉淀進(jìn)行下述操作。(7)分別用1×PBS、0.5 mol/L NaCl、0.5%tritonX-100 10 ml洗滌antibody-resin-column，4 000 r/min 4℃離心10 min；轉(zhuǎn)移antibody-resin-column至柱子中，用1×PBS 10 ml及去離子水10 ml洗滌。(8)用0.1 mol/L Glycine.HCl(pH2.5)0.9 ml洗滌antibody-resin-column，收集洗脫液于干凈無(wú)菌EP管內(nèi)(EP管內(nèi)預(yù)先加入一定體積的2 mol/L Tris-HCl pH8.0)，共洗脫3次，分管收集，分別測(cè)定每管蛋白(抗體)含量，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8檢測(cè)多克隆抗體與目的蛋白的結(jié)合制備SDS-PAGE凝膠，加入不同劑量的純化GST-FILIP-1L融合蛋白，常規(guī)蛋白質(zhì)電泳，轉(zhuǎn)印PVDF膜。將PVDF膜置1∶50稀釋的FILIP1L抗體稀釋液中，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。TBST溶液洗膜。加入稀釋好的二抗，室溫，置搖床孵育1 h。化學(xué)發(fā)光顯色，于暗室中曝光、顯影。圖像掃描儀上拍照后分析。

1.2.9檢測(cè)多克隆抗體與細(xì)胞FILIP-1L蛋白結(jié)合常規(guī)培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)良好，按照Lipofetamine 2000 Reagent說(shuō)明書，分別轉(zhuǎn)染PcDNA3.0及PcDNA3.0-FILIP-1L(893)質(zhì)粒，置 37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印PVDF膜。以制備的多克隆抗體為一抗，Western blot方法檢測(cè)多抗與細(xì)胞FILIP-1L蛋白的結(jié)合。

1.2.10檢測(cè)肝癌細(xì)胞FILIP-1L蛋白表達(dá)常規(guī)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2、smmc-7721、bel-7402、plc/prf/5及永生化肝細(xì)胞 changliver，收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印PVDF膜。以制備的多克隆抗體為一抗，Western blot方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞FILIP-1L蛋白表達(dá)。

2結(jié)果

2.1GST-FILIP-1L蛋白原核誘導(dǎo)表達(dá)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌株，挑取單克隆培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析FILIP-1表達(dá)。結(jié)果顯示，與未加IPTG誘導(dǎo)組相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化pGEX-4T3及pGEX-4T3-FILIP-1L(288)質(zhì)粒的細(xì)菌裂解后，分別在25、55 kD處有明顯的蛋白條帶出現(xiàn)，但其菌液電泳后無(wú)明顯條帶顯示。表明融合蛋白誘導(dǎo)成功，且主要在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(見圖1)。

2.2GST-FILIP-1L蛋白溶解性分析取誘導(dǎo)表達(dá)FILIP-1L的菌體洗滌后裂解， 4℃，10 000 r/min，離心10 min，分別收集上清和沉淀，并取上清液和沉淀懸液進(jìn)行10%SDS-PAGE蛋白電泳。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染FILIP-1L(288)的細(xì)菌沉淀懸液電泳后，在分子量為55 kD處有明顯條帶，而上清液電泳后無(wú)明顯條帶顯示，提示FILIP-1L(288)蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要以包涵體形式高表達(dá)[分子量應(yīng)為90 kD的FILIP-1L(893)未完全表達(dá)，見圖2]。

圖1　GST-FILIP-1L蛋白表達(dá)Fig.1　Expression of FILIP-1L fusion proteinNote: M.Protein marker；1，2，3，4.Bacterial lysis；5，6，7，8.Bacterial culture fluid.

圖2　GST-FILIP-1L蛋白溶解性分析Fig.2　Solubility analysis of FILIP-1L proteinNote: M.Protein marker；1,3，5.Supernatant； 2，4，6.Sediment suspension.

2.3GST-FILIP-1L蛋白純化原核表達(dá)的GST及GST-FILIP-1L蛋白與Glutathion Sepharse 4B Beads結(jié)合，經(jīng)Glutathion Reduced(GSH)緩沖液洗脫后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在分子量25 、55 kD處獲得了純度較高的GST及GST-FILIP-1L(288)蛋白，而分子量為90 kD的GST-FILIP-1L(893)蛋白表達(dá)量及純度均較低(見圖3)。

2.4多克隆抗體效價(jià)用純化的FILIP-1L(288)融合蛋白包被酶標(biāo)板，間接ELISA方法檢測(cè)兔抗人FILIP-1L多克隆抗體，以大于陰性血清A450nm值4倍的最小值作為多克隆抗體效價(jià)。檢測(cè)結(jié)果表明，制備的FILIP-1L多克隆抗體效價(jià)為1∶2 048 000(表1，圖4)。

圖3　GST-FILIP-1L融合蛋白純化Fig.3　Purification of pGEX-4T3-FILIP-1L fusion proteinNote: M.Protein marker；1，4.pGEX-4T3；2，5.pGEX-4T3-FILIP-1L(288)；3，6.pGEX-4T3-FILIP-1L(893).

表1FILIP-1L多克隆抗體效價(jià)(A450nm值)

Tab.1ELISA detection FILIP-1L polyclonal antibody titer(A450nm value)

Dilutiontimes(×103)1∶21∶81∶321∶1281∶5121∶20481∶8192Negativeserum0.500.490.480.450.440.430.40Immuneserum4.754.473.973.182.341.890.75

圖4　ELISA檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)Fig.4　ELISA detection FILIP-1L polyclonal antibody titer

2.5多克隆抗體的純化利用Active Ester Agrose純化血清中抗FILIP-1L抗體， SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，獲得了純度較高的IgG，SDS-PAGE電泳中IgG重鏈和輕鏈間的二硫鍵被打開，電泳中顯示分子量25、50 kD的兩條蛋白條帶(見圖5)。

2.6多克隆抗體與目的蛋白結(jié)合應(yīng)用Western blot方法， 檢測(cè)制備的多克隆抗體與FILIP-1L蛋白的結(jié)合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的GST-FILIP-1L融合蛋白(1～6泳道)與多抗孵育后均有條帶顯示，且隨著 FILIP-1L蛋白量的增加，條帶逐漸增粗，但GST蛋白(第7泳道)處無(wú)條帶顯示。提示多抗與GST-FILIP-1L蛋白有良好的結(jié)合能力，但不與GST蛋白結(jié)合。結(jié)果見圖6。

2.7多克隆抗體與細(xì)胞FILIP-1L蛋白結(jié)合293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染PcDNA3.0及PcDNA3.0-flag-FILIP-1L(893)質(zhì)粒48 h， 提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測(cè)多克隆抗體與細(xì)胞FILIP-1L蛋白的結(jié)合，同時(shí)以Flag抗體檢測(cè)轉(zhuǎn)染FILIP-1L蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染PcDNA3.0-flag-FILIP-1L(893)的細(xì)胞裂解液與多抗孵育后，在分子量95 kD(轉(zhuǎn)染FILIP-1L)及110 kD(細(xì)胞FILIP-1L)處均有條帶顯示； 而轉(zhuǎn)染PcDNA3.0的細(xì)胞裂解液與多抗孵育后，僅在分子量 110 kD處有條帶顯示，分子量95 kD處無(wú)條帶出現(xiàn)，提示制備的多抗能與細(xì)胞FILIP-1L蛋白及細(xì)胞轉(zhuǎn)染FILIP-1L蛋白結(jié)合(見圖7)。

圖5　多克隆抗體純化Fig.5　Polyclonal antibody purification

圖6　FILIP-1L抗體與目的蛋白結(jié)合Fig.6　Combination of polyclonal antibody and proteinNote: 1-6： GST-FILIP-1L fusion protein loading amount:10 μl，8 μl，6 μl，4 μl，2 μl，1 μl；7.GST protein loading amount:10 μl.

圖7　多克隆抗體與293T細(xì)胞FILIP-1L蛋白結(jié)合Fig.7　Combination of polyclonal antibody and FILIP-1L protein in 293T cell line

圖8　肝癌細(xì)胞FILIP-1L蛋白表達(dá)Fig.8　FILIP-1L expression of liver cancer cellsNote: 1.HepG2；2.smmc-7721；3.Bel-7402； 4.plc/prf/5；5.Changliver.

2.8檢測(cè)肝癌細(xì)胞FILIP-1L蛋白表達(dá)應(yīng)用制備的FILIP-1L多抗，Western blot方法檢測(cè)不同肝癌細(xì)胞FILIP-1L蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示不同的肝癌細(xì)胞在分子量110 kD處均有條帶顯示，永生化肝細(xì)胞Changliver FILIP-1L表達(dá)量較高，而肝癌細(xì)胞HepG2、smmc-7721、Bel-7402及plc/prf/5細(xì)胞FILIP-1L表達(dá)量較低(見圖8)。

3討論

野生型FILIP-1L由893個(gè)氨基酸組成，含有4個(gè)雙螺旋、2個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，在不同的細(xì)胞內(nèi)，存在有不同分子量的FILIP-1L剪切體形式。目前FILIP-1L的生物學(xué)功能尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn) FILIP-1L與腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成有關(guān)， FILIP-1L表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞系和卵巢癌的侵襲力負(fù)相關(guān)，侵襲嚴(yán)重的腫瘤組織的FILIP-1L表達(dá)較非侵襲的交界瘤組織的FILIP-1L表達(dá)顯著降低[5]；腫瘤血管系統(tǒng)定向表達(dá)FILIP-1L蛋白，能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)[6]； 過表達(dá)FILIP-1也可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并增加細(xì)胞凋亡；腹腔內(nèi)接種FILIP-1L基因能夠抑制卵巢癌擴(kuò)散至腹膜及腹腔內(nèi)器官[7]，這些研究結(jié)果提示，F(xiàn)ILIP-1可能是細(xì)胞增殖、遷移的主要抑制劑和凋亡誘導(dǎo)劑。為了深入研究FILIP-1L在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制，我們構(gòu)建了pGEX-4T3-FILIP-1L(288)、pGEX-4T3-FILIP-1L(893)兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化BL21菌株，IPTG誘導(dǎo) ，表達(dá)出GST-FILIP-1L融合蛋白(圖3)，并且pGEX-4T3-FILIP-1L(288)表達(dá)量明顯高于pGEX-4T3-FILIP-1L(893)。pGEX-4T3-FILIP-1L(288)、pGEX-4T3-FILIP-1L(893)均以包涵體形式表達(dá)。我們用高濃度的變性劑(8 mol/L尿素)溶解包涵體，經(jīng)過透析、Glutathion Sepharse 4B純化，得到濃度高、純度好的GST-FILIP-1L(288)融合蛋白。我們用純化的GST-FILIP-1L(288)融合蛋白免疫新西蘭大耳白兔，應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)抗血清效價(jià)，結(jié)果顯示動(dòng)物血清抗體效價(jià)達(dá)到1∶2 048 000，提示動(dòng)物接種GST-FILIP-1L(288)融合蛋白后，體內(nèi)產(chǎn)生了高滴度的抗FILIP-1L抗體。親和層析純化動(dòng)物血清中FILIP-1L抗體，經(jīng)免疫印跡檢測(cè)顯示，制備的FILIP-1L抗體能夠特異結(jié)合FILIP-1L蛋白、細(xì)胞轉(zhuǎn)染FILIP-1L蛋白及細(xì)胞FILIP-1L蛋白。應(yīng)用制備的FILIP-1L抗體， WB檢測(cè)顯示永生化肝細(xì)胞changliver FILIP-1L表達(dá)量較高，而肝癌細(xì)胞hepG2、smmc-7721、bel-7402及plc/prf/5細(xì)胞FILIP-1L表達(dá)量較低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們制備的FILIP-1L抗體能夠特異識(shí)別FILIP-1L，可以用于后續(xù)的FILIP-1L功能學(xué)研究。

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤病人死亡的主要原因，F(xiàn)ILIP-1L通過抑制WNT信號(hào)通路及MMP表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[8-10]，是一個(gè)潛在的重要抗腫瘤分子。我們前期實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)FILIP-1L是熱休克轉(zhuǎn)錄因子1的作用蛋白，參與Hsf1的降解過程[4]。目前FILIP-1L的生物學(xué)功能尚不完全清楚，而市面上尚無(wú)性能良好的商品化抗體，我們制備的FILIP-1L抗體為深入研究FILIP-1L的生物學(xué)功能提供了有用工具。

參考文獻(xiàn)：

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[收稿2015-11-27修回2015-12-09]

(編輯張曉舟)

Prokaryotic expression of FILIP-1L and preparation of its polyclonal antibody

DU Jing-Fang,DUN Guo-Qing,ZHANG Shu-Man,CHU Liu-Jie,LI Shu-Lian,HU Yan-Zhong,MA Yuan-Fang.

Engineering Laboratory of Henan Province for Antibody Drug， Laboratory of Cellular and Molecular Immunology， Henan University School of Medicine， Kaifeng 475004，China

[Abstract]Objective:To express and purify the fusion protein of GST-FILIP-1L and prepare its polyclonal antibody.Methods: The constructed recombinant expression vectors pGEX-4T3-FILIP-1L were transformed into Escherichia Coli BL21.FILIP-1L fusion protein was induced by IPTG and purified by Glutathion Sepharse 4B .The rabbit was immunized by the purified fusion protein,and produced serum with anti-FILIP-1L antibody. The titer of polyclonal antibody was detected by ELISA,the anti-FILIP-1L polyclonal antibody was purified by Active and its combining specificity with FILIP-1L protein was further identified by Western blot.Results: The GST-FILIP-1L fusion protein was highly expressed in E.coli,and its specific polyclonal antibody was obtained after the immunization.The polyclonal antibody purified by Active Ester Agrose was able to combine specially with FILIP-1L protein and transformed FILIP-1L protein in 293 cells and FILIP-1L protein of liver cancer cells,respectively.Conclusion: The GST-FILIP-1L fusion protein was expressed successfully,the anti-GST-FILIP-1L polyclonal antibodies with high titer and specificity are successfully prepared,these antibodies provide an useful experimental tool to research the biological function of the FILIP-1L protein.

[Key words]Filamin A interacting protein 1-like;Fusion protein;Polyclonal antibody

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.014

通訊作者②，E-mail:LshL92627@163.com。

作者簡(jiǎn)介：都景芳(1963年-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事腫瘤免疫方面的研究，E-mail:kfdjf@henu.edu.cn。

中圖分類號(hào)R392

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)06-0832-06

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30971508)。