B10細(xì)胞與非肥胖型糖尿病小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的關(guān)系研究

劉麗楠　李敬華　王素莉　程　晨　侯雯莉　關(guān)樹(shù)梅　張　紅

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津300162)

B10細(xì)胞與非肥胖型糖尿病小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的關(guān)系研究

劉麗楠李敬華王素莉程晨侯雯莉關(guān)樹(shù)梅張紅

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津300162)

[摘要]目的：研究B10細(xì)胞與非肥胖型糖尿病小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的關(guān)系。方法：選擇20只6周齡NOD/LT雌性小鼠進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)至30周齡，根據(jù)小鼠血糖、血肌酐和體重情況將小鼠分為自身免疫性糖尿病未發(fā)生組和發(fā)生組。利用酶聯(lián)吸附反應(yīng)檢測(cè)兩組小鼠脾臟組織中IL-10水平。利用流式細(xì)胞分選術(shù)檢測(cè)兩組小鼠脾臟組織匯總B10細(xì)胞比例。將40只6周齡NOD/LT雌性小鼠分為對(duì)照組和B10組，B10組小鼠接種分離得到的B10細(xì)胞，每周一次，對(duì)照組接種同等體積生理鹽水，分別于第10、15、20、25、30周齡時(shí)檢測(cè)小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生情況。結(jié)果：發(fā)生組小鼠血糖和血肌酐水平顯著高于未發(fā)生組(P<0.05)，體重水平顯著低于未發(fā)生組(P<0.05)。發(fā)生組小鼠脾臟組織中IL-10水平顯著高于未發(fā)生組。自身免疫性糖尿病發(fā)生組小鼠脾臟組織中B10細(xì)胞含量顯著高于未發(fā)生組。當(dāng)小鼠處于第10、15周齡時(shí)，B10組小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生率顯著低于對(duì)照組，但第20、25、30周時(shí)，B10組小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生率顯著高于對(duì)照組。結(jié)論：B10細(xì)胞的過(guò)度積累，可能是進(jìn)一步誘發(fā)NOD小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的原因之一。

[關(guān)鍵詞]B10細(xì)胞；非肥胖型糖尿病小鼠；自身免疫性糖尿病

B細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)參與抗體分泌、抗原呈遞、傳遞刺激信號(hào)等過(guò)程的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，除此之外，B細(xì)胞還具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能，從而導(dǎo)致非肥胖型糖尿病(Nonobese diabetic，NOD)、自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmuneencephalomy-elitis，EAE)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemiclupuserythe-matosus，SLE)等多種自身免疫性疾病的發(fā)生[1]。B10細(xì)胞是2008年確認(rèn)鑒定出的一種重要調(diào)節(jié)性B細(xì)胞， WT小鼠被LPS+佛波酯+離子霉素+莫能菌素(Phorbol ester+ionomycin+monensin，PIM) 刺激5 h后，其脾臟組織中可分離得到的CD5+CD1dhighCD19highB細(xì)胞亞群，這類細(xì)胞是B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的主要來(lái)源，因此稱為B10細(xì)胞，目前研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性疾病的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用[2,3]。1型糖尿病是由于胰島素β細(xì)胞被自身免疫系統(tǒng)攻擊破壞后，引起胰島素分泌障礙，導(dǎo)致血糖濃度升高的自身免疫性糖尿病[4]。在NOD/LT小鼠中，自身免疫性糖尿病的發(fā)生率高達(dá)80%[5]。因此，本文主要研究B10細(xì)胞與非肥胖型糖尿病小鼠的自身免疫性糖尿病發(fā)生的關(guān)系。

1材料與方法

1.1動(dòng)物飼養(yǎng)及樣本收集20只6周齡NOD/LT雌性小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(滬)2003-0003。SPF級(jí)常規(guī)飼養(yǎng)。于NOD/LT小鼠30周齡時(shí)，稱量體重，尾靜脈采血,用快速血糖儀(One touch ultra)測(cè)定全血血糖，血糖>16.7 mmol/L為糖尿病小鼠，并檢測(cè)血肌酐濃度，統(tǒng)計(jì)NOD/LT小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生情況。根據(jù)發(fā)生情況將小鼠分為未發(fā)生組和發(fā)生組。1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg體重)腹腔麻醉全部小鼠，手術(shù)取小鼠脾臟組織，一部分液氮凍存用于檢測(cè)IL-10水平。一部分用于分離B10細(xì)胞。重新購(gòu)買40只6周齡NOD/LT雌性小鼠用于后續(xù)試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)本院倫理協(xié)會(huì)同意。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)吸附反應(yīng)檢測(cè)NOD/LT小鼠脾臟組織中IL-10水平將凍存的脾臟組織進(jìn)行液氮研磨，利用IL-10 ELISA試劑盒(購(gòu)自北京天根公司)檢測(cè)NOD/LT小鼠脾臟組織中IL-10水平。操作根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2流式細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分選B10細(xì)胞將新鮮的NOD/LT小鼠脾臟組織進(jìn)行酶解消化，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，保證所分離的細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞，制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液，流式抗體CD5、CD1d和CD19進(jìn)行染色，采用FACS分選CD5+CD1dhighCD19highB細(xì)胞。

1.2.3B10細(xì)胞對(duì)NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的影響將新鮮的NOD/LT小鼠脾臟組織進(jìn)行酶解消化，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，保證所分離的細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞，制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液，利用聯(lián)合免疫磁珠分選術(shù)分離得到CD19high細(xì)胞，按照1x104濃度接種于24孔板中。加入10 μg/ml LPS、50 ng/ml 佛波酯、500 ng/ml 離子霉素和2 μmol/L莫能菌素刺激5 h，提高CD5+CD1dhighCD19highB細(xì)胞含量。將第二次購(gòu)買的NOD/LT小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和B10組，每組20只。將分離得到的B10細(xì)胞制備成2×104的細(xì)胞懸液，接種到B10組小鼠體內(nèi)中，每周一次。對(duì)照組接種同等體積生理鹽水。SPF常規(guī)培養(yǎng)，分別于小鼠第10、15、20、25、30周齡時(shí)取小鼠尾靜脈血檢測(cè)小鼠血糖水平，統(tǒng)計(jì)NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生情況。

2結(jié)果

2.1NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生情況當(dāng)NOD/LT小鼠培養(yǎng)至30周齡后，檢測(cè)小鼠血糖、血肌酐和體重情況。結(jié)果顯示，20只小鼠中血糖濃度高于16.7 mmol/L的小鼠共11只，低于16.7 mmol/L的小鼠共9只，即NOD/LT小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生率為55%。據(jù)此將小鼠分為未發(fā)生組和發(fā)生組，統(tǒng)計(jì)分析兩組小鼠血糖、血肌酐和體重情況，發(fā)生組小鼠血糖水平(29.24±7.48)顯著高于未發(fā)生組(8.99±6.12，P<0.05)，發(fā)生組小鼠血肌酐水平(24.39±2.93)顯著高于未發(fā)生組(42.65±3.74，P<0.05)，發(fā)生組小鼠體重水平(286.48±27.83)顯著低于未發(fā)生組(153.47±25.31，P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2NOD/LT小鼠脾臟組織中IL-10水平和B10細(xì)胞含量收集NOD/LT小鼠脾臟，利用ELISA是結(jié)合檢測(cè)脾臟組織中IL-10水平，利用流式細(xì)胞術(shù)分析B10細(xì)胞所占淋巴細(xì)胞比例，結(jié)果顯示自身免疫性糖尿病發(fā)生組IL-10水平(17.752±3.925)顯著高于未發(fā)生組(8.438±1.386)，同時(shí)B10細(xì)胞占比(5.61%)明顯高于未發(fā)生組(1.27%，P<0.05)，見(jiàn)圖1，表2。

表1NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生情況

Tab.1Incidence of autoimmune diabetes in NOD mice

GroupsnBloodglucose(mmol/L)Serumcreatinine(μmol/L)Weight(g)Noneautoimmunediabetes9(45%)8.99±6.1224.39±2.93286.48±27.83Autoimmunediabetes11(55%)29.24±7.4842.65±3.74153.47±25.31

圖1　NOD/LT小鼠脾臟組織中B10細(xì)胞含量Fig.1　Levels of B10 cells in spleen of NOD mice

表2NOD/LT小鼠脾臟組織中IL-10水平和B10細(xì)胞含量

Tab.2Levels of IL-10 and B10 cells in spleen of NOD mice

GroupsnIL-10(ρ/ng/L)B10(%)Noneautoimmunediabetes98.438±1.3861.27%Autoimmunediabetes1117.752±3.9255.61%

表3B10細(xì)胞對(duì)NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的影響[n(%)]

Tab.3Effects of B10 cells on autoimmune diabetes in NOD mice[n(%)]

Groups10weeks15weeks20weeks25weeks30weeksControlgroup2(10%)5(25%)8(40%)10(50%)12(60%)B10group0(0%)3(15%)12(60%)18(90%)20(100%)

2.3B10細(xì)胞對(duì)NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的影響將分離得到的B10細(xì)胞稀釋成濃度為2×104的細(xì)胞懸液接種到6周齡NOD/LT小鼠體內(nèi)，分別于小鼠第10、15、20、25、30周齡時(shí)檢測(cè)小鼠血糖水平，檢測(cè)NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生情況。結(jié)果顯示B10組小鼠在第10、15、20、25、30周齡時(shí)，血糖濃度高于16.7 mmol/L的小鼠數(shù)量分別為0、3、12、18、20只，而對(duì)照組小鼠在第10、15、20、25、30周齡時(shí)時(shí)，血糖濃度高于16.7 mmol/L的小鼠數(shù)量分別為2、5、8、10、12只，因此B10組小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生率在小鼠第10(0%)和15周齡(15%)時(shí)低于對(duì)照組(10%，25%)，但是在第20、25、30周齡(60%、90%、100%)時(shí)小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生率高于對(duì)照組(40%、50%、60%)，見(jiàn)表3。

3討論

1型糖尿病是由于胰島素β細(xì)胞被自身免疫系統(tǒng)攻擊破壞后，引起胰島素分泌障礙，導(dǎo)致血糖濃度升高的自身免疫性糖尿病。在NOD小鼠中，自身免疫性糖尿病的發(fā)生率高達(dá)80%。目前研究認(rèn)為NOD小鼠發(fā)生自發(fā)性糖尿病主要由于自身抗原缺乏耐受引起的[6]。非肥胖型糖尿病、自身免疫性腦脊髓膜炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的發(fā)生都是由于B細(xì)胞的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能引發(fā)的機(jī)體過(guò)度免疫反應(yīng)造成的[7]。在機(jī)體內(nèi)，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cells，Bregs)是參與負(fù)向免疫調(diào)節(jié)的主要B細(xì)胞亞群，其免疫功能主要通過(guò)調(diào)節(jié)白介素10(Interleukin 10，IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transfor ming growth factor β，TGFβ)完成[8]。CD5+CD1dhighCD19highB細(xì)胞是此亞群中的主要成員，負(fù)責(zé)免疫組織中大部分IL-10的分泌，因此又稱為B10細(xì)胞。因此，本文主要研究B10細(xì)胞與非肥胖型糖尿病小鼠的自身免疫性糖尿病發(fā)生的關(guān)系。

本研究中，我們選擇20只6周齡NOD/LT小鼠進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)至30周齡時(shí)，對(duì)其血糖、血肌酐水平和體重情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其中11只小鼠出現(xiàn)自身免疫性糖尿病，據(jù)此將小鼠分為未發(fā)生組和發(fā)生組，統(tǒng)計(jì)分析兩組小鼠血糖、血肌酐和體重情況，發(fā)生組小鼠血糖和血肌酐水平顯著高于未發(fā)生組(P<0.05)，體重水平顯著低于未發(fā)生組(P<0.05)。同時(shí)我們利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組小鼠脾臟組織中IL-10水平，結(jié)果顯示自身免疫性糖尿病發(fā)生組小鼠脾臟組織中IL-10水平顯著高于未發(fā)生組。利用流式細(xì)胞分選術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，自身免疫性糖尿病發(fā)生組小鼠脾臟組織中B10細(xì)胞含量顯著高于未發(fā)生組。說(shuō)明IL-10水平和B10細(xì)胞在NOD小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用，這可能是由于小鼠自身免疫促進(jìn)B10細(xì)胞的擴(kuò)增引起的。

由于B10細(xì)胞除了參與抗體分泌、抗原呈遞、傳遞刺激信號(hào)等過(guò)程之外，還可作為接觸性超敏反應(yīng)(Contact hypersensitivity，CHS)等疾病的特異性抗原，這有可能是引發(fā)負(fù)向免疫調(diào)節(jié)的主要原因[9]。因此我們將B10細(xì)胞接種到6周齡NOD/LT小鼠，研究B10細(xì)胞對(duì)NOD小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的影響。為了提高B10細(xì)胞濃度，我們首先利用聯(lián)合免疫磁珠分選術(shù)分離得到CD19high細(xì)胞，繼而利用LPS+佛波酯+離子霉素+莫能菌素處理，提高CD5+CD1dhighCD19highB細(xì)胞比例，得到濃度較高的B10細(xì)胞。將B10接種到NOD小鼠體內(nèi)，分別于第10、15、20、25、30周齡時(shí)檢測(cè)小鼠尾靜脈血液中血糖濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)小鼠處于第10,15周齡時(shí)，B10組小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生率顯著低于對(duì)照組，但第20周以后，B10組小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生率顯著高于對(duì)照組。白介素10是一種多功能的細(xì)胞因子，是目前公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化以及炎性和免疫反應(yīng)[10]。因此我們認(rèn)為在NOD小鼠成長(zhǎng)初期，B10細(xì)胞分泌的IL-10發(fā)揮其炎癥抑制作用，延緩了NOD小鼠自

身免疫性糖尿病的發(fā)生，但當(dāng)B10細(xì)胞在NOD小鼠體內(nèi)積累，激活小鼠體內(nèi)負(fù)向免疫調(diào)節(jié)，導(dǎo)致NOD小鼠自身免疫性糖尿病的發(fā)生率的上升。

總之，在發(fā)生自身免疫性糖尿病的NOD小鼠中，B10細(xì)胞增多，而B(niǎo)10細(xì)胞的過(guò)度積累，可能是進(jìn)一步誘發(fā)NOD小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的原因之一。

參考文獻(xiàn)：

[1]Vazquez MI,Catalan-Dibene J,Zlotnik A.B cells responses and cytokine production are regulated by their immune microenvironment[J].Cytokine,2015,74(2):318-326.

[2]Iwata Y,Matsushita T,Horikawa M,etal.Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells[J].Blood,2011,117(2):530-541.

[3]Candando KM,Lykken JM,Tedder TF.B10 cell regulation of health and disease[J].Immunol Rev,2014,259(1):259-272.

[4]Atkinson MA,Eisenbarth GS,Michels AW.Type 1 diabetes[J].Lancet,2014,383(9911):69-82.

[5]Ablamunits V,Henegariu O,Hansen JB,etal.Synergistic reversal of type 1 diabetes in NOD mice with anti-CD3 and interleukin-1 blockade evidence of improved immune regulation[J].DIAB,2012,61(1):145-154.

[6]Bhattacharya P,Fan J,Haddad C,etal.A novel pancreatic β-cell targeting bispecific-antibody (BsAb) can prevent the development of Type 1 diabetes in NOD mice[J].Clin Immunol,2014,153(1):187-198.

[7]Ziegler S,Gartner K,Scheuermann U,etal.Cellular immune response[J].Eur J Immunol,2014,44:1239-1244.

[8]Hoffman BE,Martino AT,Sack BK,etal.Nonredundant roles of IL-10 and TGF-β in suppression of immune responses to hepatic AAV-factor IX gene transfer[J].Mol Therapy,2011,19(7):1263-1272.

[9]Curzytek K,Kubera M,Majewska-Szczepanik M,etal.Inhibitory effect of antidepressant drugs on contact hypersensitivity reaction is connected with their suppressive effect on NKT and CD8+T cells but not on TCR delta T cells[J].Int Immunopharmacol,2015,28:1091-1096.

[10]Jin Y,Wi HJ,Choi MH,etal.Regulation of anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-β in mouse dendritic cells through treatment with clonorchis sinensis crude antigen[J].Exp Mol Med,2014,46(1):e74.

[收稿2015-09-03修回2015-09-30]

(編輯許四平)

Relationship between B10 cells and incidence of autoimmune diabetes in non-obese diabetic mice

LIU Li-Nan,LI Jing-Hua,WANG Su-Li,CHENG Chen,HOU Wen-Li,GUAN Shu-Mei,ZHANG Hong.

The Endocrinology Department of the Affiliated Hospital of Logistics Institute of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162,China

[Abstract]Objective:To study relationship between B10 cells and the incidence of autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice.Methods: 20 NOD/LT female mice of 6 week old were cultured in normal culture to 30 weeks,and the mice were divided into two groups according the mice′s blood glucose,serum creatinine and body weight detected at their 30 weeks old.IL-10 levels in spleen tissues of the two groups were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.We used flow cytometry to detect the proportion of B10 cells in the spleen of mice in the two groups.NOD/LT mice were randomly divided into control group and B10 group.The B10 cells were inoculated in B10 groups,their blood glucose were detected when they were 10,15,20,25 and 30 weeks old.Results: The blood glucose and serum creatinine levels were significantly higher in the group than that in the autoimmune diabetes group (P< 0.05),and the body weight was significantly lower than that in the autoimmune diabetes group (P< 0.05).The level of IL-10 in the spleen tissues of the autoimmune diabetes mice was significantly higher than that in the non autoimmune diabetes group.The content of B10 cells in the spleen of the mice with autoimmune diabetes mellitus was significantly higher than that in the non autoimmune diabetes group.When mice at the age of 10,15 weeks,the incidence of autoimmune diabetes in B10 group was significantly lower than that in the control group,but the incidence of autoimmune diabetes in B10 group was significantly higher than that in control group at 20,25 and 30 weeks.Conclusion: The over accumulation of B10 cells may be one of the reasons for the further development of autoimmune diabetes in NOD mice.

[Key words]B10 cells;Nonobese diabetic mice;Autoimmune diabetes

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.009

作者簡(jiǎn)介：劉麗楠(1978年-)，女，碩士，主治醫(yī)師、講師，主要從事內(nèi)分泌代謝性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

中圖分類號(hào)R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)06-0812-04